Способ моделирования фосфатной кальцификации на поверхности искусственных сосудов из аналога раствора плазмы крови человека in vitro Российский патент 2025 года по МПК G09B23/28 G01N33/487 

Изобретение относится к области экспериментальной медицины, в частности к области моделирования процесса фосфатной кальцификации на поверхности искусственных сосудов из аналога раствора плазмы крови человека.

Минерализация тканей является неотъемлемой частью широкого спектра патологических процессов и заболеваний сердечно-сосудистой системы и наблюдается при развитии тромбозов, аневризмах сердца и крупных сосудов, встречается на поздних стадиях атерослероза в составе атероматозных масс. Патологическая минерализация биологических структур представляет собой всесторонний многофакторный клеточно-опосредованный процесс, регулируемый на генетическом, биохимическом и гормональном уровнях. Кальцинированный аортальный стеноз является наиболее частой причиной протезирования аортального клапана. С возрастом отмечается постоянный рост частоты данного порока. Начальные изменения в виде склероза аортальных полулуний наблюдаются у 75% людей в возрасте более 85 лет, а тяжелая степень стеноза достигает 3% среди пациентов старше 75 лет. Патогенез аортального стеноза представляется активным клеточным механизмом.

Минерализация тканей изучена значительно хуже. Главной неорганической фазой патогенной кальцификации коллагеновых и мышечных тканей, так же как в костной и зубной тканях, является фосфат кальция, который с определенной степенью приближения и идеализации относят к карбонатсодержащему гидроксилапатиту, как правило, слабо окристаллизованному и нестехиометрическому из-за присутствия значительных количеств посторонних ионов. Некоторые из этих ионов входят в кристаллическую решетку апатита, другие же только адсорбируются на поверхности апатита. Этот апатит является типичным биогенным минералом, тесно связанным пространственно, генетически структурно и морфологически с протеинами, липидами и полисахаридами тканей организма.

Патогенный апатит не имеет такой тесной связи с обменными процессами в организме, как физиогенный. Степень дефектности его всегда высока и зависит в большей степени от локальных процессов, чем от состояния организма в целом. Соотношение Са/Р в кальцинатах, по многочисленным литературным данным, варьирует в значительных пределах.

В процессе изучения кальцинатов автором выявлены общие закономерности патологического отложения минерального вещества в кровеносной системе человека. Несмотря на некоторые отличия в структурах отложения минерального вещества автор приходит к выводу, что, абсолютно все так называемые «кальцинаты» кровеносной системы характеризуются сходным минеральным составом (до 90% апатита) и рядом общих, сопутствующих и способствующих минерализации условий.

Сложность большинства реальных физико-химических процессов не позволяет решить описанные проблемы в in vivo. Их изучение становиться возможным в искусственно созданной модельной системе, приближенной к физиологической среде.

Известен способ (патент РФ №2611412) в котором моделируется процесс кристаллизации кальцификатов сосудов из аналога раствора плазмы крови человека, в условиях близких к физиологическим, in vitro, включающий получение минеральных фаз. составляющих основу неорганической компоненты кальцификатов сердечных клапанов человека, в искусственно созданной приближенной к физиологической среде модельной системе, согласно решения, создают модельные среды, близкие по неорганическому составу, рН, ионной силе к плазмы крови человека следующего состава: объем раствора, 250 мл, массы (г) солей: CaCl₂⋅2H₂O - 0,1446; K₂HPO₄ - 0,1288; (NH₄)₂HPO₄ - 0,6600⋅10^-3; MgCl₂⋅6H₂O - 0,0482; NaHCO₃ - 0.5460; Na₂SO₄ - 0,0639; NaCl – 5,7330 г, при рН 7,40±0,05, проводят наблюдение в течение 7 суток, полученный осадок отфильтровывают, высушивают при t=80±5°C в течение 5 часов. В составе осадка идентифицируют карбонатгидроксилапатит с примесью витлокита близкого по составу к кальцификатам коллагеновых и мышечных тканей человека.

Недостатком данного решения является моделирования начального процесса кристаллизации фосфатов кальция в самой в плазме крови без их последующего осаждения на поверхности искусственных сосудов

Технической задачей заявляемого решения является разработка способа экспериментального моделирования процесса патогенной кристаллизации фосфатов кальция на поверхности искусственных сосудов.

Техническим результатом заявляемого решения является разработка способа экспериментального моделирования процесса патогенной кристаллизации карбонатгидроксилапатита с примесью витлокита на поверхности искусственных сосудов.

Указанный технический результат достигается тем, что предложен способ моделирования фосфатной кальцификации на поверхности искусственных сосудов из аналога раствора плазмы крови человека in vitro, в котором создают растворы модельных сред близкие по неорганическому составу, рН, ионной силе к плазме крови человека, при этом для приготовления раствора используют: объем раствора 250 мл, массы (г) солей: CaCl₂ 2H₂O - 0,1446; K₂HPO₄ - 0,1288; (NH₄)₂HPO₄ - 0,6600⋅10^-3; MgCl₂⋅6H₂O - 0,0482; NaHCO₃ - 0,5460; Na₂SO₄ - 0,0639; NaCl - 5,7330, при рН 7,40±0,05, согласно решения, в раствор помещают пластинки из искусственных сосудов и выдерживают в течение 30÷90 дней при t=36,6°С, после этого пластинки вынимают и высушивают на воздухе при t=20±5°С в течение 5 часов, затем анализируют состав минеральных фаз и относительную площадь покрытия кальцификатами поверхности искусственных сосудов.

Для расчета состава систем использовали значения средней концентрации неорганических веществ, входящих в плазму крови человека, полученные из литературных данных [Березов Т. Т., Коровин М. А. Биологическая химия. М.: Медицина. 2002. 704 с], Состав плазмы крови человека представлен в таблице 1.

Данные для приготовления модельного раствора приведены в таблице 2.

Как видно из табл.2, модельный раствор отличается от средних значений по содержанию натрия, хлорид-ионов и сульфатов, поэтому добавляем хлорид натрия в количестве 98 ммоль/л, тем самым закрываем потребность в хлорид-ионах и частично в ионах натрия. Добавляем сульфат натрия в количестве 0,45 ммоль/л, тогда полностью покрываем потребность в сульфатах. Остается ввести 117-98-1=18 ммоль/л натрия, можно использовать NaOH для создания необходимого значения рН.

Выбор исходных реагентов и их соотношение в растворе определялись таким образом, чтобы концентрации ионов и ионная сила раствора были максимально приближены к данным параметрам моделируемой системы.

В качестве исходных реагентов использовали соли марки ч.д.а. и х.ч. и дистиллированную воду. Для каждой серии экспериментов были приготовлены растворы, содержащие катионы и анионы, при совместном присутствии которых в данных условиях не образуются малорастворимые соединения. В каждом производили корректировку значений рН до физиологического значения (7.4±0.01) путем добавления 30%-ого раствора NaOH или HCl (конц.). После смешения эквивалентных объемов растворов получаем раствор с заданным пересыщением и рассчитанной концентрацией компонентов.

Для осаждения фосфатов кальция на поверхности сосудистых протезов марок «Витафлон», «Intergard Silver» и «Intergard Synergy», были подготовлены образцы размером 10 мм* 10 мм. Поверхность образцов была предварительно подготовлена: очищена и обезжирена.

Затем образцы опускали в вертикальном положении в мерные конические колбы 50-100 мл, так, чтобы они не касались дна и стенок колбы. Далее приливали модельный раствор плазмы крови человека. Полученную систему выдерживали в течение 1 и 2 месяцев в шкафу БИАТРОН при температуре 36,6°С, после чего образцы извлекали из модельного раствора, просушивали при комнатной температуре и анализировали посредством оптической микроскопии.

Протезы кровеносных сосудов «Витафлон» На фиг.1 представлен вид протезов кровеносных сосудов «Витафлон», предназначенных для замещения или шунтирования артерий различного диаметра при их стенозе, окклюзии или аневризмах, ранениях и их последствиях, а также в других случаях, кроме коронарного шунтирования и церебральных реконструкций.

Протезы изготовлены из политетрафторэтилена (ПТФЭ) и состоят из основной пористой трубки, армированной тонкой пористой пленкой, укрепляющей стенку протеза и предотвращающей его последующее расширение.

Основные функциональные свойства, заявленные производителем: отсутствие иммунологической и тканевой реакции; низкая тромбогенность; высокая химическая стойкость; отсутствие деструкции как во время пребывания в организме, так и в процессе хранения; апирогенность; нулевая порозность; не требуют предварительной обработки перед имплантацией.

Протезы кровеносных сосудов «Intergard Silver» и «Intergard Synergy».

На фиг.2 представлен вид протезов кровеносных сосудов «Intergard Silver», представляющих собой вязаный сосудистый протез на основе полиэтилентерефталата (ПЭТФ) с двойной велюровой структурой, что способствует внутренней миграции клеток и гарантирует надежную инкорпорацию протеза в ткани. Калогеновое покрытие закрывает все поры и предотвращает просачивание крови сквозь стенки протеза, а покрытие ацетатом серебра обеспечивает долговременную защиту то микроорганизмов, способствует гипоаллергенному и естественному заживлению, за счет чего снижается количество осложнений.

На фиг.3 представлен вид протезов кровеносных сосудов «Intergard Synergy», также изготовленных из ПЭТФ, и представляющих собой вязаный сосудистый протез. Однако, его отличительной чертой является противомикробное покрытие на основе ацетата серебра и триклозана, чья способность предотвращать развитие инфекции усиливается при их сочетании, предлагая более высокие антимикробные свойства, чем имеющиеся на рынке сосудистые протезы.

Внешний вид протезов «Intergard Silver» и «Intergard Synergy» не отличается.

В таблице 3 представлены результаты исследования твердых фаз, синтезированных на сосудистых имплантах марок «Витафлон», «Intergard Silver» и «Intergard Synergy» без добавок

Для синтеза образцов из модельного раствора плазмы крови человека без добавок было выбрано время синтеза от 1 до 2 месяцев.

На фиг.4 представлены результаты дифрактограмма образца, синтезированного без добавок. Рентгенофазовый анализ установил, что для всех образцов, синтезированных на сосудах исследуемых марок, фазовый состав представлен гидроксилапатитом.

На фиг.5 представлены ИК-спектры образцов, синтезированных без добавок

Для уточнения состава образцов, было проведено исследование методом ИК-спектроскопии. Интерпретация проводилась путем идентификации полос поглощения колебаний группировок на ИК-спектрах образцов.

Проведенный анализ образцов показал, что в зависимости от марки сосуда не происходит изменения фазового состава. В области 450-700 см^-1 видны деформационные колебания Р-О-Р в PO₄^3-, в области 900-1200 см^-1 - валентные колебания Р-O в РО₄^3-. Регистрируются полосы поглощения в спектральных областях 1416-1547 и 850-900 см^-1, относящиеся соответственно к деформационным колебаниям С-O карбонат-ионов. Видно, что характерное для гидроксилапатита колебание H₂O в области 3400-3550 см^-1 очень выражено.

На основе проведенных анализов, можно сделать выводы о фазовом составе всех образцов. Установлено, что исследуемое вещество является карбонат гидроксилапатитом В-типа (Са₅(PO₄, CO₃)₃(ОН)).

На фиг.6 представлена Зависимость Са/Р коэффициента твердой фазы от времени синтеза. Методами химического анализа надосадочной жидкости установлено соотношение Са/Р в образцах.

Из анализа полученных данных видно, что при увеличении времени синтеза наблюдается рост Са/Р коэффициента. Наибольшее значение Са/Р коэффициента получено у образцов марки «Витафлон». Это связано с пористой структурой используемого материала.

На фиг.7 представлен вид сосудистого протеза марки «Витафлон после образования отложений, образованных в результате синтеза.

На фиг.8 представлен вид сосудистого протеза марки «Intergard Silver» после образования отложений, образованных в результате синтеза.

На фиг.9 представлен вид сосудистого протеза марки «Intergard Synergy» после образования отложений, образованных в результате синтеза.

Все исследуемые образцы изучались с помощью оптической микроскопии. С помощью программы ToupView(x64) были определены площади сосудов и отложений на них, образованных в результате синтеза.

Заявляемый способ позволяет в модельных условиях выявить параметры, которые приводят патогенной кристаллизации фосфатов кальция на искусственных сосудов in vitro человека, с участием плазмы крови человека, и создать модельную систему, с помощью которой можно изучать эффективность воздействия лекарственных препаратов для профилактики и лечения патогенной кальцификации.

Изобретение относится к области экспериментальной медицины. Предложен способ моделирования фосфатной кальцификации на поверхности искусственных сосудов из аналога раствора плазмы крови человека in vitro, в котором создают растворы модельных сред, близкие по неорганическому составу, рН, ионной силе к плазме крови человека. Для приготовления раствора используют объем раствора 250 мл, массы (г) солей: CaCl₂⋅2H₂O – 0,1446; K₂HPO₄ – 0,1288; (NH₄)₂HPO₄ – 0,6600 10^-3; MgCl₂⋅6H₂O – 0,0482; NaHCO₃ – 0,5460; Na₂SO₄ – 0,0639; NaCl - 5,7330, при рН 7,40±0,05. В раствор помещают пластинки из искусственных сосудов и выдерживают в течение 30-90 дней при температуре 36,6°С. После этого пластинки вынимают и высушивают на воздухе при температуре 20±5°C в течение 5 ч. Затем анализируют состав минеральных фаз и относительную площадь покрытия кальцификатами поверхности искусственных сосудов. Изобретение позволяет моделировать процесс патогенной кристаллизации карбонатгидроксилапатита с примесью витлокита на поверхности искусственных сосудов, создать модельную систему, с помощью которой можно изучать эффективность воздействия лекарственных препаратов для профилактики и лечения патогенной кальцификации. 9 ил., 3 табл.

Способ моделирования фосфатной кальцификации на поверхности искусственных сосудов из аналога раствора плазмы крови человека in vitro, в котором создают растворы модельных сред, близкие по неорганическому составу, рН, ионной силе к плазме крови человека, при этом для приготовления раствора используют объем раствора 250 мл, массы (г) солей: CaCl₂⋅2H₂O – 0,1446; K₂HPO₄ – 0,1288; (NH₄)₂HPO₄ – 0,6600⋅10^-3; MgCl₂⋅6H₂O – 0,0482; NaHCO₃ – 0,5460; Na₂SO₄ – 0,0639; NaCl - 5,7330, при рН 7,40±0,05, отличающийся тем, что в раствор помещают пластинки из искусственных сосудов и выдерживают в течение 30-90 дней при t = 36,6°С, после этого пластинки вынимают и высушивают на воздухе при t = 20±5°C в течение 5 ч, затем анализируют состав минеральных фаз и относительную площадь покрытия кальцификатами поверхности искусственных сосудов.