3-АМИНО-2-ФЕНИЛ-1,2-ДИАЗАСПИРО[4.4]НОН-3-ЕН-4-КАРБОНИТРИЛ, ОБЛАДАЮЩИЙ АНТИМИКРОБНЫМИ СВОЙСТВАМИ Российский патент 2025 года по МПК C07D231/06 A61P31/04 

Область техники

Изобретение относится к области фармацевтической химии, а именно к новому соединению формулы (I) или его фармацевтически приемлемым солям и может быть использовано в медицине и ветеринарии.

(I)

Уровень техники

Актуальным вопросом современной фармацевтической химии остаётся поиск простых и экологичных методов синтеза новых антимикробных соединений. Среди таковых продолжают активно изучаться замещённые 1H-пиразолы (1-4).

Известны ацилированные производные диазоспиросоединений, близкие по строению, обладающие ростоподавляющим действием по отношению к данным микроорганизмам в достаточно низких концентрациях 64-32 мкг/мл (1).

Известны фенилзамещенные диазоспиросоединения, близкие по строению, проявляющие активность в отношении грамположительных (Staphylococcus aureus, Enterococcus fecalis и Streptococcus agalactiae) и грамотрицательных (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae и Proteus vulgaris) микроорганизмов при минимальной ингибирующей концентрации (МИК) от 0.6 до 1.3 мкг/мл (2).

Раскрытие сущности изобретения

Техническая проблема заключается в получении нового класса веществ, обладающих антимикробными свойствами и пригодных для использования в медицине.

Технический результат заключается в расширении арсенала фармацевтических средств за счёт нового представителя замещённых пиразолинов.

Технический результат достигается тем, что синтезировано новое соединение 3-амино-2-фенил-1,2-диазаспиро[4.4]нон-3-ен-4-карбонитрил формулы (I)

(I),

обладающее антимикробными свойствами в отношении грамотрицательных (таких как Pseudomonas aeruginosa) и грамположительных (таких как Staphylococcus aureus) бактерий.

Осуществление изобретения

Синтезировано и изучены антимикробные свойства 3-амино-2-фенил-1,2-диазаспиро[4.4]нон-3-ен-4-карбонитрила (I).

Трёхкомпонентный синтез 3-амино-2-фенил-1,2-диазаспиро[4.4]нон-3-ен-4-карбонитрила (I) осуществлялся по простой экологичной методике в одну стадию исходя из фенилгидразина, динитрила малоновой кислоты и циклопентанона с использованием в качестве растворителя дистиллированной воды.

Методика: Смесь 3 ммоль циклопентанона, 3 ммоль динитрила малоновой кислоты и 0,008% триэтиламина растворяли в воде, затем добавляли 3 ммоль фенилгидразина и подвергали ультразвуковой активации при температуре 50°С в течение 1 часа. Кристаллы отфильтровывали, промывали гексаном и сушили на воздухе. Выход: 0.49 г (68 %), светло-коричневые кристаллы.

Температуру плавления определяли в открытом капилляре. Т_пл = 178-180°С.

Состав и строение полученного соединения установлено с помощью элементного анализа, ИК, ¹H и ¹³C ЯМР-спектроскопией. Элементный анализ выполняли на автоматическом CHNS-анализаторе VarioMICROcube (Германия).

Найдено, %: C 69.72 H 6.57 N 22.98 Вычислено, %: C 69.97 H 6.71 N 23.31

Спектры ¹Н и ¹³С ЯМР записаны в ДМСО-d₆ на спектрометре Varian (США) 400 МГц (¹Н) и 100 МГц (¹³C), внутренний стандарт ТМС.

Спектр ЯМР ¹Н (ацетон-d6), δ, м. д.: 1.36-2.27 м (8H, C₄H₈, циклопентановое кольцо), 6.66 с (2H, NH₂), 7.35 с (1H, NH), 7,14-7,95 м (5H, ArH). Спектр ЯМР ¹³C (ацетон-d6), δC, м. д.: 21.63, 23.79 (C7, C8), 34.06, 37.00 (C6, C9), 51.96 (C5 спиро), 84.45 (C4-CN), 114.78 (CN), 121.51, 128.96, 137.11, 138.83, 139.55 (Фенил), 144.82 (C3-NH₂). HSQC ¹H/¹³C (ацетон-d6), м. д./м. д.: 1.66/23.79 (H7/C7), 1.90/21.63 (H8/C8), 2.00/34.07 (H6/C6), 2.04/37.00 (H9/C9). HMBC ¹H/¹³C (ацетон-d6), м.д./м.д.: 1.90/51.96 (H8/C5 спиро), 1.70/51.96 (H7/C5 спиро), 7.20/84.45 (H10 аром./C4).

ИК спектры записаны на ИК-Фурье спектрометре IRAFFINITY-1 (Shimadzu, Япония) в таблетках KBr (CAS: 7758-02-3, Merck Germany).

ИК-спектр, ν, см^-1: 2225 с (CN), 2941 с, 2951 с (CH₂), 3050.5 (Ar-H), 3226 ш, 3329 с, 3406 с (NH).

Для оценки антимикробной активности синтезированного соединения определяли полумаксимальную эффективную концентрацию (EC₅₀), сравнивая с препаратом «Ципрофлоксацин» (ОАО «Синтез» Россия, г. Курган). Антимикробную активность оценивали в отношении золотистого стафилококка (Staphylococcus aureus ATCC 25923), кишечной палочки (Escherichia coli K-12) и синегнойной палочки (Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027), полученных из Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов. Исследования проводились с использованием метода измерения оптической плотности бактериальных культур при росте на жидкой питательной среде LB, содержащей дрожжевой экстракт (5 г/л), триптон (10 г/л) и хлорид натрия (5 г/л).

Таблица 1.

EC₅₀, мкг/мл
Штаммы бактерий P. aeruginosa
ATCC 9027 S. aureus
ATCC 25923 E. coli K-12 Соединение I 67±12 21,2±0,3 - Ципрофлоксацин 69±7 36±4 0,56±0,16

Соединение I проявило выраженную антимикробную активность в отношении Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus, сравнимую с веществом сравнения - ципрофлоксацином. В отношении Escherichia coli в исследуемых концентрациях соединения антимикробная активность не была выявлена. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности дальнейшего поиска антимикробных соединений в ряду арилзамещённых амино-1H-пиразолкарбонитрилов.

Методика оценки антимикробной активности.

Культуру бактерий засеивали на жидкую среду LB на 18 часов. Затем 100 мкл культуры добавляли к 25 мл жидкой среды LB и инкубировали при 37°C в течение 1 часа. В каждую лунку 96-луночного микропланшета вносили по 150 мкл жидкой питательной среды LB. Добавляли в первые лунки по 24 мкл растворов исследуемого соединения и вещества сравнения в ДМСО в концентрации 10 мг/мл, подвергали их двукратному разведению от 400 до 0,195 мкг/мл и вносили в каждую лунку планшета по 150 мкл 1-часовой бактериальной культуры, содержащей примерно 10⁵ клеток в 1 мл.

Проводили измерение оптической плотности в каждой из лунок при 0 часов инкубации при помощи планшетного ридера Multiskan Ascent (Thermo Scientific, Финляндия) на длине волны 595 нм. После этого планшеты инкубировали в шейкере-инкубаторе в течение 1-8 часов при 37°С. Каждый час производили измерение оптической плотности при 595 нм в каждой лунке планшета. Полученные данные обрабатывались с помощью программного пакета Excel 2007 (Microsoft, США) и на основе графика определялось значение EC₅₀ соединений (мкг/мл).

Все эксперименты по определению антимикробной активности проводили в 3 повторностях. Статистический анализ данных проводили с помощью программного пакета Excel 2007 (Microsoft, США). Результаты представлены в виде средних значений с указанием доверительных интервалов при P = 0,05 (уровень доверительности 95%).

Литература:

1. Гуревич П. А. и др. Ацетилирование 2-(3-амино-1, 4-диазаспиро [4.5] дек-3-ен-2-илиден) малононитрила и определение антимикробной активности полученных соединений по отношению к S. Aureus //Вестник Казанского технологического университета. 2013. Т. 16. №. 20. С. 141-143. eLIBRARY ID: 20463317

2. Girgis A. S., Barsoum F. F., Samir A. Regioselective synthetic approaches towards 1, 2, 8, 9-tetraazadispiro [4.1. 4.2] trideca-2, 9-dien-6-ones of potential antimicrobial properties //European journal of medicinal chemistry. 2009. Т. 44. №. 6. С. 2447-2451.

3. Meshcheryakova A. A., Neumoina K. S., Sorokin V. V. Three-Component Synthesis of Spiropyrazolines Derived from Benzohydrazides //Russian Journal of Organic Chemistry. 2023, vol. 59, no. 8, pp. 1309-1314. https://doi.org/10.1134/S1070428023080031

4. Ивонин М. А., Бурыгин, Г. Л., Мещерякова, А. А., Тюлькина, И. Р., & Сорокин, В. В.. Цитотоксическая активность некоторых представителей ряда бензимидазоло[1,2-а]хиназолина, пиридо[1,2-а]пиримидина и пиразолокарбонитрилов //Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии. 2018. С. 37-39. eLIBRARY ID: 36562436.

Изобретение относится к области фармацевтической химии, а именно к новому соединению формулы (I), которое обладает антимикробными свойствами в отношении грамотрицательных и грамположительных бактерий и может найти применение в медицине и ветеринарии. 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

(I)

1. Соединение формулы (I)

(I).

2. Соединение по п. 1, обладающее антимикробными свойствами в отношении грамотрицательных и грамположительных бактерий.