Способ получения инозин-5 @ -монофосфата Советский патент 1985 года по МПК C07H19/20 

, : рорегсчпю ггяосчгг о к rOj;,),;; Mi:lii-; :in;, fiiioxUMJiii, н чапц. i i;, ;.(1пер;1п-чстпоппни;му пин-оПу и ,:,ч( 5кохим1пкч кил релкгин И и ме;:мци11Ск 1Х И))(;:а1 ат(м .

iiijUT ; ,41 смосоО V Слня niniui

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИПОЗИН5 -МОНОФОСФАТА из природных источников сьгр± я, отличающийс я тем, что, с целью упрощения способа, в качестве источника сырья . используют мышцы малоценных пород рыб которые измельчают и вьщерживают в течение 6-8 ч в присутствии хлористого калия, целевой продукт экстрагируют 5-8%-ньпч раствором хлорной или серной кислоты, после фильтрования сорбируют на активированном угле, элюируют смесью этиловый спирт-вода25% нь Й a rмиaк в соответствии 25:

бак-ojiiVM ЛГ5б|;), пкл10чл 1:ии; фп,;, ; pori.UIHv К/.П ЬТ Vp;i,)f: ЖИ;1, И „ i .

пи|1 :;ч;1ь; ;п л на ;10110обмсмп; и .чин ipn::;i ( . viiapi-:ia;i:t: , cr а:;;;:, ni ; ;ри о;ч,ч;;;к;1ении и с;,;;1ку :U::f-кч i ::;ч ;ivKTn -1 I,

.;о;:г;ггч ами ланжчч о и:об;- xiiiMNiTC я ()С мкопч, чи.чупонкя ;ip v;;:-;ич;г ; ; (irpa шгченнрггг, лостуч-а ис тч: чч;;:;

,, 4J41 СВНЧаИО с (Ч1,1Г-Ч ГТЧ- ;

сиег иачизи1)(111чИчмч ччкроо)ганизмя ) П(1((1и срччч состаиа, ч такдс; ( и Л.пигел ьчос:тЛ) 1пил1.лл.:а ( ЛЧ.,

ЛЛГЛ) ||ргЛЛ,.ЧСТ/5 .

BfXTFU тогч, исги;;ичпл а лччл: стоя:11е1Л) ьп1Кроб1-);.Ч(ЛЧ1че(Ллч с.; ;;ччч ч. (..ччч и,гл )аст чыч о:, ii |.

r-4)ri4i ЧЛ и л О1Ч.1 .

к а ч л }лгая л лчч ; чч м.м, 4ii,i :,. сч (1 сч()слч. I:.. i Л- Ч Ч Ч Л1 ч;- -члм-/ -мличгЫклш Ч . ч ;-ч1чсч :р/ ч.лч;НИ1(Л Ч1. исгюлh4,-ior :чч::;1ч,.; лчл )IX riLlI);4i р1ЧО , i-Ч ЛЛ-Чк чЧчЧЛ h ЧЧ :

л нчЛсрЖ Л а т ч ;чч Ч чe г.- ч ч чч- чугс чч- И :-;л11р;;ч 14)4(1 сачпл:. ч,ччч ч npiviyKi (ЛЧ)ачиру:{Л )-Н,,гч чгч;ч1-р(1г хлчр;;сй пли серной ..ч, (

ЧЛГЧ J:Tp л на }ЛЛ ГСрбЛ1ЛЧ1Л на ЯКГ|ЛЧ:рЧнаУЛЧЛ: , ЧЛНЖруКЛ СЧЧ1.ЧЛЧ{1 i; ч;Л CHiip , 5Л-Ц)И aMN4iai. ЧЧЧ.ЧЧ)икчль ч ;; ( / : { 1 3 j , арч г ч лч л л,о 15-2()ч :лч1,ерлл ;пч yix-Л1 Ч1ЛЧЛЧ ч хЧЧСЛО (1бр;ЛЧЧ Ч Л ЧМЛЧЧЧ1. Ч и ч ЛЛ;ч Л:1 е : 1И 1 ; 1 1 :Чи;ЛЧ: 1Л: л-полкисл ;:0;- ло рН ;,Я-ч,2 ч ч(ч1::чч ч i

ИГЛ7 ЧЧ. гЛЧЛЛЧ: fiLl Ч)Ч ЧЛ-Ч.

сырья почполяет искл1очи1Л; 1-01Л7гталийнг)1й и дорогостоящийирСЛ(кл; лчлуче} И1- микробнаяьпогч- лролл-л-ллii а ,

Кроме того, (люсллТа закл 0чается в исгтользоваЛш естосгвеи О1Л) фсрмснта1Л- нН{ го лренра чения име л|целл)ся п тканях (ii;u рыГ) 3 -ЛМР в 3-1МР пол л.ейст И1о;ч (ллт рикле1Л1чн(1Й ЛМР-ам 1Н(лчи1рс г азы

I Т , . ;с; а чг ч ч. лл а::; : ч л . чччччч 14;л,1-:, ;;:ч jiaiMi р yhir , чччзрчччыч ;;jii,4: ;paT:i:

ч Ч)ПЛЧ1 ч;Ч-71Л ЧЛЧТЧЧ ч, ,Ч (4vrn;ia ( :u : : ЧИЧЛ; Л ч Ч рЛ i к 1- г:ф;чл ч: : мчл я -.чл ч;Л Ччi l:)0(i) .

Фчл :ЧГ1)Ч t 1:: чр:.;; л л ;

лч . (ФЧч;чЛ чч:Ч: ., ;1ЛИ1

ЧЛчаЧЧЛ ч уГЧЧ Г-ГЧУ-Ч - l ;14 -ЧЧЧ

чличчччч; чч ; ч ч:чг1чч1Ч ч ;;ч ч , -у .ЧЧЧ1V4 ка:1): --Л pac-rHC a ч-лМ/ и,

л:чч ;::ил ;V4-4i4ipa ч|ч , Л.л :Ч-:,.i-4-ЧЛЧаЮГ ЧЧЧЧЧ 1ЛЛЧ;П:Ч. ;; ля . ..,: 1Ч(

Л ч;:;ч:лмсму ч;лл ч ,, ра.чЧ/ьлчл п;: .ллЗ;- :; с.чл ч;лп.лл; Л1ЧЛ : г ак;И л1Ч(лчиллтго , а чч:-М КЛЛ1ЧЛЛЛЧЧС а ьч.чплл Ччанного уг.;лл --Л ч-..,;,,.;о Ч , ЧЧЧ ЧГ:|: ЧЛИИ Ч -Рл Л1

ч л л:чьч..л л листил.чир., ллчю; ч , ч- ,ото -;С:Трнлс:С}Ч1; i л. - : , чЛ1ЧПГ;ук:Г ЧИССЬ)

;л; Л; л .лг.:-;-; 2ч; 2ц : 1 . Лллсцикл слл ai aijiyiv : :Ф:ф ларичают ч л.акус бьабатиизльчг 1 авным объемом аюилшетата. ;:iacTBOp, содержащий 3 - IМ ; нодкьСчг;як); до рП 2,0 20%-ной НС i и О1.:аж;;ают 5-1МР ч-краткым ох,лаж,11,енного до 96/ч-Л1(5Го элил(;-вого спирта. Осадсч (отделяют центрифугированием, пр1 Мь;нают 3 м-п oxjia i-.:j(;HH«io 96/о-ногс ( спирта, высушивают в Мчсикат;л е над члс калслигым Са(Ь; .

(макс:имум иоглошонкя при 2ЬО им). (. о ед н о н и о ох ;i р а к т en и а о н а и о хр т о Граф:1ческс1 1 полпижиосГ1 ю относмтыько эт; ; О -1иог() сбразпя -IMP п систгме раст-юрителе; ; i-i-iiiionafioji , н-бута);о,п, ацетон, мура15ьи1;ая кислота, трихлоруксусяая кислота 0,1 М ЭДТА, взятых в количестпс. 20, ДО, J J. 9j, 15 и 1 Mi cooi ;и;тствечяо (система J ).

II р N о р 2. I кг .: р1,:5ь; размел ь а ют на мясорубке, к фаршу лойаУ Ляк;-1- 7,1 ; КС; 1 , раствореинтго т: 50 .г листи.члиропаииой поды, пеоемсп ива;П , н те-;ен;;с 7 ч т;пи 20(. .;атс добавляют 1 л 6%-пой ПС 0 и кстратлфуют Tj тпчслйе I л, (ЬильтруюТ; осалок залива от 1 л л,1СТ1 лл1-фоваиной водь, лпрпмеши ак1Т и через 1 ч атльтруют. 1рочрачн «с фильтраты об .р;тиня;от , определяют содержание нукдеоткла.

мсрсм зерен (,.l) ми определяют ;-надогич С лр мрру 1 . Фи./ьтрат дролус кают л су;-;Т ко;1оьл у со скоростью 0,8 ; дромывку проводят Я „ 001 раствором iiCtO; пол сп€4чтрос; тометрнческ м котт ролам , Эл(1;п) ;лот смесью 96/-нлй :л;и,1О,-ый спггсг : пода : 25%-ный ;Н,0 ;: соотношении 25:23:2 Ьрак1.1И;о, сг дср;ка1:1ую 5 удар ;лают в валумо до i 5/ содпржа пш нуклеотид; (. астло:1;елис iipti 2ЬО HN;) . измеряют обГзСм 1 Л;иеи грата и обрабатьишют объемом ами,лаиетата Водный растлор, содержаний 5 --IMP, Г1о;:;, гОх-ной НС 1 до pi 1,8 и осаждают 1;елене)й гдэодукт 5-кра.тным ofvbCMOM 96Л-но1Д этилово .) слпрта, o;;J;aждe i oI до . Осадок очделяют иедтрдцугдроreihiiCNi po ;ь:ьai vr ) мл охлаж.Д ;;нюго э гкдового спирта, Ь1су1и :г5ак)1 в зкслкаторе Haj4 прокаленHbir-i СаС i,- .

5ыход 105 мг препарата, с одержа ие основного ве1 ;ества 96; (максимум 1 оглощел)1 2зО им). Соединение а р а к г с р-; з о ва но к р (зма то гр афич ее к ой п од вижност ь.о о носит )Но э тал онИ01Л1 (-;бразда 5 -1МГ в систе:-1е ( ана;;лл1ЧН( примеру 1).

П о и у. е Г 5, 1 кг сердечной рыбы к -1жуч д3мслгл- а1от па мясоР-бке, ;: -papiny добавлк;1Т 7,4 г КС 1 , ра:1мор л:н11Г( 5 ЬО 1ч: дистил.пирован1:ОЙ :-.ел;;;, перолл.л иак1 i д кыдержнва -

течение 1 ч, затем фильтруют. Осадс1 яа.пивают л дистиллированной воды, перемешивают и через 1 ч фильтруют .fipеЗрачные фильтраты объе.диняют и пропускают через колонку с актив1 рованньЕ углем ЛГ-3 (предварительно определив содержание нуклеотида в экстракте и cop6L HOH i io емкость угля по д)имеру 1) со скоростью 0.9 мл/мин/см поперечного сечения кол-OHKii. Пpo ; шa:oт 0,001 N раствором е2.-Ч спектрофотометрическ-:м КеНтролем. Элюир пот 5 -IMP 9( этиловый спирт: в ода: 25.7-нь-й в соотношении 25;22;3, Фракцию, содержащую нуклеотид,5 упаривают в вакуу7-1е до 15% содср-жан я целевого продукта (контролт, по поглощению при 250 им) , из repяют объем и обрабатывают равным: объемом амилацетата. Водный расвор, содержагш-1Й 5 -IMP, подкисляют до p;i 2,2 20%-ной НС1 и осаждают делевой продукт 10-кратнь м объемом охлажденного до 95%-ного этиловогг спирта. Осадок отделяют центрифуптрованием, промывают 3 мл охлажделного этилового спирта и высушивают в эксикаторе над прокаленным СаСЬ .

;1-1ход 110 МГ препарата, содержа1П1е основного вещества 95%. Соедиление охарактеризовано хроматографнческой подвижностью относительно эталонного образца 5-IMP в системе А (аналогично примеру 1).

Обработка измельченного сырья хлоргк:ты;.1 калием в течение 6-8 ч необход;1 -;а для полного превращения тка:..:евой ЛМР в 1МР с помощью наиболее эффективного а:чтизатора A tP-aминoгидролазы - моновалентньгх катионов . Время обработки установлено эксприментально с помощью хроматографического анализа измельченной ткани на содержание адениннуклеотидов: за время, меньше 6 ч, часть AMP остается 3 неизменном виде, а увеличение времени обработки ( 8 ч) не приводит к повышению Е;ькодда IMP, а только к увеличению продолжительности процесса.

Экстрак1щю нуклеотидов эффективно приводят с помощью разбавленных кислот, для ул1рО|дения способа выбраHhi хлорная Iiли серная кислота. При иг 1,Ч(чк111 1И кис/югм с цц i:ii McHOi 5- Ipoifi ::, i;i;i I ii. : ):( :к1к:1ия нуклсотидл, ( чГ;-, IK i:i: 0(:iKi: п ДiHpraivic я .;i,iKi vp,:ЦИИ, чГ(1 затрулнжуг juiji jneiiinyii ci-McTKv, П1)име 1ение кис, 6(it:( 8/ Hi ripniio;i;irr к у.чучплшиш экччра . 1 no сравнонию с 5-Я/- ;о1) КхИ1р:/нтраиней. f-ibioop aKTiuiHTMinaiiHOio уг.чя n 1ча чесгле сс рбеита определяется IfN;, Ч1Ч} ГИ; обеСПеЧИППСТ сорбцию liyK/UCiTiuia np,4NU) нз кисл.ого экстрякт;: , Ч7о З а-П1те,пьпо упроигпет спосоС по c:i5aлисдп 1{1 с iicnoji зонанисм rnKi-ix c:o беясов, как ио(ообм(нпы( смол -:, когда перед сорбцией проюдяг ntMiTраднзацию экстракта со cпeпllaJИ ;. подбором зна -:ений рН (например, 3 извесгпом устройстве). DnionponaniiC с:месы() этидоныи спирт: вода: аммиак: общепринято м Kfi,;iono4Hoii хроматографии, подбор соотиопюний проведен с учетом одти ма.ьности процесса элюироваиия Д{)и мшгимальпом расходе реагептов. Упаривание до 1 5-20% содержа ия ;(уд.деотида является оцтимальн,1м ii спягьчио с nepacTBc:ipHMOCTbio tMJ; uv:{ liij;-: 1 Ир; ,. .:: i; :|Up;;{.-:-;o oi; Ч . cini- .:i , : ;,ii;;j);i . liiiLлржп;; я ;;:..тi.;ги;:,а н:.;;:К (1 :; г с: IMPIU i.i :;;:.лп iitv: ;pi 1 yi. r,i iii-Ki ii;: pnc jsi);;: c;iii ;i-i , . ()Opa;ui:K /;:-1и;гч;; та o:.; i; :ля удлл1 ;л: :игмепГ(н i;-i -j при с oi:iiH(( нии /юат: ами. laiii;: ficiii.int: 1: 1 уда.: и етс я ч hinKpirrCMi , .1 npl: с 0( rnrOUJl-HH;; :2 ,ас с,я перл диоиад1.пг1 поль:;О1 г ;1ис ::СЛ 1чД;ГТ; бс-з удуд:ч:н;15 очистки от пшКич о. Осалаигнпс деле:-о; о дроду:чг.: :):и:jo ii,iM спи1)том ; с(чг iio;i Ciii;K :( иj-nier-;, чс: ч:1, nt обсч::;счп; асг дс;/д1 д-о Осаждение IMF дроводят пгги сждаж до 0-2 (;, Умемылеиие те-пературЬ ниже ( пе приводит к пов лие1Л110 В1лхода JtejieisoiD пукдег. , а повьчаение темпеддтгуры Biiiiuc (. веде к ц(ггерям за час:т чдого р створ(Гия умеи ч :ения етп к;)ис:длди