Способ диагностики недостатка марганца в растениях Советский патент 1988 года по МПК G01N21/64 

оо

Изобретение относится к области сельско1 о хозяйства и физиологии рас тений, в частности к способам диагностики недостатка микроэлемента мар ганца в растениях, произрастающих в искусственных или естественных усло виях, и может быть использовано для определения функционального состоя ния растения и оптимальной дозы мик роэлемента, тр.ебуемой для удобрения почвы.

Целью изобретения является повы шение избирательности определения функционально-значимого марганца при неразрушающем контроле.

Способ реализуется с помощью им пульсного фосфороскопа Беккереля, который состоит из двух дисков диаме тром 180 мм, насаженных на одну ось.

8каждом из дисков имеется по 20 ще лей (3x18 мм) и эти диски посредством шкивов -и ременной передачи от мотора вращаются с частотой

6 тыс.об/мин. Образец размещается между дисками. Через один диск на объект поступает свет от синхронно работающей со щелью лампы - вспышки ИСШ-400 (частота i Гц, длительность 1 МКС на псловине высоты, знергия

9Дж). Через второй диск, смещенный на угол соответствующий временному интерзалу 250 мкс, свет послесвечения от объекта попадаат на фотоприемник ( 1

1100 В; интерфергнционкый фильтр 680 нм), затем сигнал усиливается предварительным усилителем на микросхеме К544УД1А, интегрируется и подается на самописец ПДП-А.

На фиг, 1 приведена зависимость

отношения

1,/1

сгац

клеток хлореллы от

темновой выдержки перед измерением; на фиг. 2 зависимость величины сигнала послесвечения на первую вспышку (I.,) и стационарного уровня ( ) клеток хлореллы от времени после вспьш1ки.

осуществляется след-ующшСпособобразом.

Растительный материал: срезанный лист или клетки водорослей в кювете, помещают в специальный держатель им пульсного фосфороскопа и выдерживают в темноте в течение опредеяенного времени.

После чего освещают объект серией из 20 вспышек и записывают сигналы

послесвечения объекта. Рассчитывают отношение стаи, 100%, где I, - величина сигнала послесвечения на первую вспьшдку,) стац - величина стационарного уровня.

Фотосинтетический аппарат различ- нь5х видов высших растений и зеленых водорослей имеет в главных чертах об-, щие принципы функционирования. Фотосистема, содержащая марганцевый фермент и осуществляющая окисление воды и вьщеление кислородаs независимо от вида имеет сходную структуру и белковый состав. Поэтому зависимость ве

5

Е

личины отношения

1,/1

стаи,.

ОТ содержания марганца, свойственная гороху или хлорелле, будет коррелировать и у. других видов фотосинтезируюш 1х объектов . Величину отношения, близкую к 30%, следует рассматривать как избыточное насыщение активных центров водоокисляющего фермента фотосистемы марганцем, а величину, близкую к 100% - как глубокий дефицит этого микроэлемента. Значение отношения, близкое к 55 + 3%, соответствует оптимальному, а свьшзе этой цифры - по- . ниженному содержанию марганца в растении. Количество вспышек в серии 20;, достаточное для выхода .кинетики на стационарный уровень ( YJ-TOU.) ; длительность вспышки MKQ, при большей длительности возможно двойное срабатывание некоторых реакционных центров и возникновение трудностей, связанных с временным разделением процессов возбуждения и измерения послесвечения.,

0 Пример 1 , Растения гороз а (сорт Превосходный) в количестве 100 шт. выращивают в климатической камере (ГДР) на среде Кнопа с полньи набором микроэлементов (список А4 +

5 + А7), включающей ,8 мг/л усваиваемого марганца (контроль), и на «налоговой среде, но в отсутствие кар ганца (опыт). Выращивание ведется в течение 45 сут и через каждые 5 сут

0 д 1агностируют недостаток марганца в растениях;, для чего срезают по 5 ли- стьзз с 10 растений, помещают i-ix на 3 м п. а темноту, затем каждьй лист з.гхкр ;;п.т;яют в держателе фосфороскопа,

55 освешают лист серией из 20 вспьш1ек длительностью икс, регистрир-./шт сигнал послесвечения на самописце Гц1Ц1 4 (фи.г, 1) через 250 мкс после каждой вспьшки.

Измеряют высоту сигнала послесвечения I, на первую вспышку и I (.,-„„, в контроле, и образце и рассчитывают отношение I ,/

СТ Цв процентах. Данные приведены в табл. 1,

Таблица

Пример 3. Водоросли Chlorel 1а pyrenoidosa (штамм sP.K) вьфащива- ют в специальном культиваторе на среде тамийя с набором микроэлементов включающем 1,81 мг/л марганца (конт- 25 роль). В опыте содержание марганца составляет 0,1 мг/л. В контроле отношение в процессе роста, культуры водоросли остается постоянным на уровне 52%, тогда как в опыте в первые сутки после пересева клеток нахо- : дится на уровне контроля, но затем увеличивается до 97%. Отставание в накоплении биомассы в опыте на 7-е сут роста культуры составляет 5,6 ра-

Как следует из данных табл. 1, недостаток марганца у опытных растений можно обнаружить уже в первую неделю их роста, хотя видимые анатомические изменения начинают отмечать- 35 а. В процессе роста культуры хлорелся лишь у 2-недельных растений. Медленное наступление дефицита Мп в опыте связано с тем, что этот микроэле- меит запасается в семядолях гороха, присутствует в растворах солей даже марки х.ч. и о.с.ч и в адсорбированном виде содержится на поверхности сосудов для выращивания растений. Таким образом, величина отнснпения у растений гороха при оптимальном содержании марганца составляет 55 + 3%, а при его дефиците возрастает до . ,95 ± 5%.

В практике сельскохозяйственного земледелия встречаются случаи не только недостатка, но и избытка марганца в почве. В связи с этим способ был аппробирован также на растениях, выращенных при избытке марганца.

лы без притока Мп извне клетки, потребляя имеющийся марганец, проходят все стадии дефицита этого микроэлемента. Таким образом, если величина

40 отношения . на 3,5 Сут развития равна 75%, то клетки испытьшают 50%-ный дефицит марганца.

Способ может быть использован для подбора оптимальной дозы удобрений .

45 и эффективности их использования в конкретных условиях.

Пример 4. Способ был испытан в вегетационный период 1985 г. на растениях пшеницы (сорт Миронове-

50 кая 808) и ячменя (сорт Трумпф), находящихся в фазе кущения, в зависимости от внесения максимального количества удобрений и типа обработки почвы (табл. 2). Измерения выполняют

55 как в примере 1

5

10

15

Пример 2, Растения гороха выращивают по- примеру 1 за исключением того, что в опыте в среду добавляют десятикратный избыток марганца (18,1 мг/л). Во время роста видимых анатомических изменений растений в опыте по сравнению с контролем не наблюдается. Одномесячные растения в контроле имеют отношение 55 + 3,8%, а в опыте - 32 + 3%. Таким образом, избыток марганца по сравнению с оптимальным его значением приводит к снижению отношения от 55 до 32%.

В связи с развитием биотехнологии и широким использованием в последние годы одноклеточной зеленой водоросли хлорелла для получения кормовых добавок способ аппробирован на хлорелле.

Пример 3. Водоросли Chlorel- 1а pyrenoidosa (штамм sP.K) вьфащива- ют в специальном культиваторе на среде тамийя с набором микроэлементов, включающем 1,81 мг/л марганца (конт- 25 роль). В опыте содержание марганца составляет 0,1 мг/л. В контроле отношение в процессе роста, культуры водоросли остается постоянным на уровне 52%, тогда как в опыте в первые сутки после пересева клеток нахо- : дится на уровне контроля, но затем увеличивается до 97%. Отставание в накоплении биомассы в опыте на 7-е сут роста культуры составляет 5,6 ра-

20

30

35 а. В процессе роста культуры хлореллы без притока Мп извне клетки, потребляя имеющийся марганец, проходят все стадии дефицита этого микроэлемента. Таким образом, если величина

отношения . на 3,5 Сут развития равна 75%, то клетки испытьшают 50%-ный дефицит марганца.

Способ может быть использован для подбора оптимальной дозы удобрений .

и эффективности их использования в конкретных условиях.

Пример 4. Способ был испытан в вегетационный период 1985 г. на растениях пшеницы (сорт Миронове-

кая 808) и ячменя (сорт Трумпф), находящихся в фазе кущения, в зависимости от внесения максимального количества удобрений и типа обработки почвы (табл. 2). Измерения выполняют

как в примере 1

Обработка

Удобрения

Таблица 2 Отношение

Изобретение относится к сепьско му хозяйству и физиологии растений и МОЖЕТ быть использовано для определения функционального состояния растения и оптимальной дозы микроэлемента, требуемого для удобрения почвы. Цель - повышение избирательности анали-за к функционально-значимому марганцу при неразрушающем контроле. Растительный объект помещают в темноту. При этом все переносчики элект- ротранспортной цепи хлоропластов переходят в исходное стабильное состояние. Затем освещают короткими световыми вспьшзками насыщающей интенсивности. Через 250 мкс после каждой вспышки регистрируют величину послесвечения. Определяют отношение ее уровня после первой вспышки и стационарного уровня после 20-й вспьшпси в процентах: ус г 100%, Если величина отношения I /Ig-r j, лежит в интервале 58-100%, это указывает на недостаток функционально-значимого марганца в растении. 2 ил. 3 табл.

Без43. Jh 234 + 1 j4

Максимум31.1,528+ 2,1

Без37 + 2,128 4- 5

Максимум47+2j642+6

Растения, произрастающие на дан ном типе почвы (серая лесная) без внесения дополнительных количеств удобрений, не испытывают дефицита марганца Внесение максимального ко личества удобрений при поверхностной обработке улучшает функционирование Мп-содержаш,его фермента, но при основной глубинной обработке ухудшает. Таким образом, вносить максимальное количество удобрений целесообразно лишь при поверхностной обработке почвы.

Темновая выдержка объекта перед измерением связана с необходимостью релаксации компонентов электрон-тран спортной цепи хлоропластов к исходно му состоянию за счет самопроизвольного их окисления кислородом воздуха при обратных темновьк реакциях, Оп™ тимальную темнов -то выдержку можно определить следующим образом,

Пример 5. KjieTKH водоросли хлореллы выращивают с ,,81 мг/мп марганца, как в примере 3, в течение 5 сут. Затем 2 мл суспензии клеток с концентрацией хлорофилла 40 мкг/мл помещают в кварцевую кювету, устанав ливают в фосфороскопе, затем через pa3J tti4HHe темновые интервалы времени освещают серией вспьппек по примеру Рассчитывшот величину отношения 1,, в процентах при различной темновой выдержке клеток перед осве™ щением. Экспоненциальная кривая отражает релаксацию компонентов фотосистемы, включающих марганец, в исходное состояние (фиГе О. Релакса™ ция заканчивается через 3-3,5 мин.

Таким образом, З-ЗрЗ-минутная тем новая выдержка является наиболее оп

Пшеница

Ячмень

0

5

30

.,1-

тимальной, так как при более короткой выдержке компоненты фотосинтети ческогр аппарата не успевают релак- сировать до исходного состояния, а при более длительной выдержке падает производительность измерений.

Время регистрации сигнала послесвечения после вспьш1ки света имеет определенный оптимум,

Пример 6. Процедуру выра™ щивания клеток водоросли хлореллы и измерений выполняют по примеру 5 за искл;ючением того что темновая выдержка клеток перед освещением остается постоянной и равна 3 мин, а изменяется время регистрации сигнала послесвечения после вспьш1ки света (фиГо 2). Из графика можно определить, что наиболее оптимальное время после вспыпг- ки составляет 200-250 мкс. При более коротких временах, когда частота вращения дисков составляет 10 тыс, об/мин происходит быстрый износ подшипников фосфороскопа, а при более дпителыш х временах вследствие уменьшения величины сигнала послесвечения уменьшается точность измерений„.

Таким образом, в диагностике дефицита марганца оптимальное значение времени регистра.ции послесвечения равно 200-250 икс

Доказательство избирательности спо соба к функционально-значимому марганцу выполнили путем замены этого металла .на один из семи металлов: Ni, Cos Fe, Vj Zn, Mo, Cu, Клетки водоро- C,TIH хлорелла обрабатьшали мМ гидро- кс$шамина, что приводило к удалению марганца (контроль на атомно-абсорб- щюкном спектрофотоматре AAS-IN),

40

45

ВО

Отношение увеличивалось при этом от 48 + 2 до 97 jf 3%. После добавления к к таким клеткам марганца (2 мкМ) и освещения в течение 30 мин происходило восстановление величины отношения от 97 + 3 до 52 + 4%. Никакой другой металл из указанных подобного эффекта не давал. Следовательно, предлагаемый способ избирателен именно к марганцу.

Другое доказательство избирательности способа к марганцу было выпол

Как видно из таблицы только недостаток марганца в питательной среде приводит к увеличению отношения до 95 i 3%.

Таким образом предлагаемый способ позволяет конт15олировать содержание марганца в растении без его разрушения и всего лишь на участке листа площадью 1 см. В связи с отсутствием стадии химической подготовки пробы резко сокращается время полного анализа одного образца, это время составляет 6 мин. Предлагаемый способ имеет предельную избирательность именно к функционально-значимому марганцу, входящему в ключевой водооки- сляющий фермент и позволяет-выявить недостаток Мп на ранних стадиях роста рас тения, когда еще не произошли видимые анатомические изменения. Формула изобретения

Способ диагностики недостатка мар- ганца в растениях, включающий возбуж

нено путем выращивания растений гороха на средах дефицитных по тому или иному микроэлементу.

Пример 7. Растения гороха (сорт Превосходный) в количестве 20 шт. вьфащивают по примеру 1, но из набора микроэлементов изымают или добавляют в пятикратном избытке один из микроэлементов. Растения, включая контроль, выращивают в 8 сосудах. Измерения послесвечения проводят по примеру 1. Данные приведены в табл. 3.

ТаблицаЗ

5

0

5

0

дение исследуемого материала светом - и измерение оптических характеристик, отличающийся тем, что, с целью повышения избирательности определения функционально-значимого марганца при неразрушающем контроле, объект вьщерживают в темноте в течение 3-3,5.мин, возбуждают люминесцентное свечение серией вспьш1ек насыщающей интенсивностью и длительностью л/1 МКС, после каждой вспышки через 200-250 мкс регистрируют интенсивность свечения и по отношению

100% контролируют содержание

с гац,

марганца, где 1 интенсивность свечения после первой ВСПЬШПСИ, I (-таи.

стационарное значение интенсивности после 20 вспьш1ек, причем значение отношения Yi/Y(.T,u.., лежащие в интервале 58-100%, указьшает на недостаток функционально-значимого марганца в растении.

fOQ

r

j д(глу.