Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к растениеводству, и может быть использовано в селекционных учреждениях биологического профиля при массовых оценках гибридов и сортов кукурузы на холодостойкость.
Цель изобретения - повышение точности и надежности оценки.
П р и м е р. Прежде чем провести определение содержания цис-феруловой кислоты, необходимо установить границы зоны, используемой для анализа. Семена исследуемых сортов кукурузы (200-400 шт) промывают в теплой воде с мылом, затем заливают водопроводной водой, нагретой до 60оС, на 5 мин, после этого оставляют на 2 ч в воде при 30-40оС. Набухшие семена раскладывают на фильтровую бумагу, смоченную водопроводной водой и проращивают в кюветах, закрытых крышками, в термостате (при 27оС) в течение 48 ч. Через 48 ч отбирают растения по длине первичного корня (берут преобладающий класс проростков). Вся дальнейшая работа проводится с этой группой растений, которая служит исходным материалом.
Несмываемой тушью на эпидермис корня наносят две метки на расстоянии 2 и 4 мм от кончика корня. Эти метки ограничивают зону меристемы и растяжения. Часть проростков оставляют в термостате с оптимальной температурой (27оС), другую часть помещают в термостат с температурой 10оС. Измеряя расстояние между метками в контроле через каждые 2 ч, а в опыте из-за замедления роста, через каждые 12 ч, устанавливают промежуток времени, за пределами которого величина отмеченного участка уже не изменяется. Установленный интервал считается временем окончания растяжения клеток в отмеченном отрезке, где клетки начали растяжение при оптимальной температуре.
За этот промежуток времени выделилась новая зона, содержащая клетки, рост растяжением которых начался от момента снижения температуры. Эта зона ограничена с одного конца меристемой (примерно двухмиллиметровый отрезок корня, считая от кончика), с другого - участком клеток, границы которого были помечены тушью ранее.
Появившийся за время экспозиции участок корня с растягивающимися клетками (после отсечения двухмиллиметрового кончика корня, содержащего, главным образом, меристематические клетки), используется для определения содержания в нем цис-феруловой кислоты.
Необходимое для одной пробы количество сырого материала - 1,5-3 г, что соответствует 300-500 отрезкам корня.
Для анализа используется фиксированный кипящим 96% -ным этанолом растительный материал. Концентрация этанола с учетом воды, содержащейся в растительном материале, составляет 70-80% . Для экстракции фенольных соединений к взвеси (размельченный фиксированный материал в спирте) прибавляют 80% -ный раствор этанола, 0,1-0,5 г ЭДТА или диэтилдитиокарбомата натрия. Взвесь помещают в конической колбе, закрытой пробкой с обратным холодильником, в кипящую водяную баню на 30 мин. После экстракции раствор отфильтровывают, остаток на воронке многократно промывают горячим 80% -ным этанолом. Полученный раствор помещают в круглодонную колбу, удаляют из него этанол (в вакууме, при температуре не выше 50оС).
Последовательность процедур здесь следующая: полученный после удаления этанола водный остаток подкисляют раствором соляной кислоты до рН 3, затем эфиром (лучше этилацетатом) из раствора экстрагируют фенольные соединения. Из эфира фенольные соединения переводят в 5% -ный раствор гидрокарбоната натрия. Из подкисленного раствора (раствора гидрокарбоната, содержащего фенольные соединения, нейтрализованного и затем подкисленного до рН 3 соляной кислотой) фенольные соединения вновь экстрагируют эфиром. Эфир упаривают досуха в токе холодного воздуха в затемненном месте. Остаток растворяют 1,5-2 мл 96% -ного раствора этанола и наносят на хроматограмму (0,4-0,6 мл на каждую хроматограмму).
Двумерное разделение на хроматограмме проводится в темноте.
В первом направлении используется 5% -ный раствор уксусной кислоты, во втором - система - н-бутанол - уксусная кислота - вода (4: 1: 5, по объему, верхнюю фазу). Расстояние между фронтом растворителя и стартовой линией в первом направлении должно быть не менее 30-40 см.
На хроматограмме цис-феруловая кислота легко обнаруживается по характеру флуоресценции в ультрафиолетовом свете (синяя, переходящая в светло-синюю в парах аммиака), по качественной реакции с диазотированным п-нитроанилином (ДПНА). После опрыскивания раствором ДПНА), приготовленным по Прохазка, (Прохазка, 1962) стереоизомеры феруловой кислоты (цис- и транс-изомеры) окрашиваются в ярко-малиновый цвет, переходящий в ярко-голубой после последующего опрыскивания хроматограммы 5% -ным раствором карбоната натрия. Rf цис-феруловой кислоты в 5% -ном растворе уксусной кислоты равна 0,65-0,69, во второй системе растворителей - 0,90-0,95.
Содержание элюированной 96% -ным этанолом с непроявленной хроматограммы цис-феруловой кислоты определяется спектрофотометрически по поглощению при длине волны 283 нм. Для расчета используется формула
C = 
, где С - количество цис-феруловой кислоты на 1-миллиметровый отрезок корня;
А - интенсивность поглощения;
Vсп - общий объем спиртового экстракта;
Vхр - объем спиртового экстракта, нанесенного на хроматограмму;
Р - степень разбавления спектрофотометрируемого раствора;
0,0396 - коэффициент погашения для цис-феруловой кислоты;
B - толщина кюветы при спектрофотометрировании;
N - число зон, используемых для одной пробы;
l - длина зоны, мм.
Пониженная температура вызывает изменение содержания цис-феруловой кислоты, но изменения в содержании несущественны в клетках, закончивших рост. В клетках, рост растяжением которых начинался от момента снижения температуры, изменения значительны и направленность их у сортов с различной устойчивостью неодинакова: у устойчивого сорта наблюдается снижение содержания свободной цис-феруловой кислоты, у неустойчивого - возрастание (см. таблицу).
Более удобным показателем может служить коэффициент, характеризующий отношение содержания цис-феруловой кислоты в тканях при 10оС к содержанию этого соединения в тканях такой же зоны при оптимальной температуре (27оС). Этот коэффициент представлен в таблице. Сравнивая значения коэффициента, можно заметить, что показатель ниже единицы характеризует устойчивый сорт, показатель больше единицы - неустойчивый сорт.
Преимущества предлагаемого способа заключаются в следующем.
Растительный материал нарезается по предварительно установленным границам зоны, включающей клетки, перешедшие к растяжению от момента снижения температуры и на протяжении экспозиции растений при этой температуре.
Для определения содержания цис-феруловой кислоты используется биохимический метод, способствующий повышению точности способа, а полученные результаты позволяют расширить возможность ранжирования исследуемых сортов и гибридов по степени устойчивости.
Содержание цис-феруловой кислоты характеризует особенности процесса растяжения в условиях действия пониженной температуры клеток корней в различных по устойчивости сортов и гибридов кукурузы.
(56) Авторское свидетельство СССР N 854330, кл. A 01 H 1/04, 1979.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| Способ оценки устойчивости растений к низким положительным температурам на ранних этапах онтогенеза | 1979 |
|
SU854330A1 |
| Способ оценки устойчивости растений к низким положительным температурам | 1977 |
|
SU615899A1 |
| СПОСОБ ОЦЕНКИ ХОЛОДОСТОЙКОСТИ РАСТЕНИЙ | 2001 |
|
RU2206977C1 |
| Способ оценки холодостойкости овощных культур | 1985 |
|
SU1337004A1 |
| Композиция, содержащая олигомер производного гидроксикоричной кислоты, её применение, устройство, семена, способ повышения толерантности к стрессу растений, способ модулирования содержания пролина в растениях | 2016 |
|
RU2751596C2 |
| Способ определения температурных границ зоны закаливания растений к низким температурам | 1985 |
|
SU1335179A1 |
| Способ получения холодоустойчивого посадочного материала батата | 2022 |
|
RU2787700C1 |
| СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОТНОСИТЕЛЬНОЙ УСТОЙЧИВОСТИ СОРТОВ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ К ОБЫКНОВЕННОЙ КОРНЕВОЙ ГНИЛИ ЗЛАКОВ | 1999 |
|
RU2166245C2 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОТОМСТВА КАРЛИКОВОЙ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ | 2022 |
|
RU2809196C1 |
| Бактериальный стимулятор роста растений | 2018 |
|
RU2690420C1 |
Изобретение относится к сельскому хозяйству. Цель изобретения - повышение точности и надежности оценки. После воздействия низких температур на двухсуточные проростки кукурузы выделяют участок корня, рост растяжением которого начался в условиях снижения температуры. В этих клетках пониженная температура вызывает изменение в содержании цис-феруловой кислоты (ЦФК). В выделенном растительном материале содержание ЦФК определяют спектрофотометрически. Отношение содержания (10С) к содержанию ЦКФ при оптимальной температуре (27С) определяет степень холодостойкости. При значении этого отношения меньше единицы растения относят к устойчивым, более единицы - к неустойчивым. 1 табл.
СПОСОБ ОЦЕНКИ УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ КУКУРУЗЫ К НИЗКИМ ПОЛОЖИТЕЛЬНЫМ ТЕМПЕРАТУРАМ НА РАННИХ ЭТАПАХ ОНТОГЕНЕЗА, включающий действие низкой температуры на двухсуточные проростки, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и надежности оценки, после воздействия выделяют участок корня, рост растяжением которого начался в условиях снижения температуры, определяют в нем содержание цис-феруловой кислоты и по отношению ее содержания при пониженной температуре к содержанию при оптимальной температуре определяют степень холодостойкости, считая, что при значении этого отношения менее единицы растения относят к устойчивым, более единицы - к неустойчивым.
