Способ определения состояния фитохрома в растительной клетке Советский патент 1989 года по МПК A01G7/00 

ел

о

00

00

Изобретение относится к способам определения содержания растительных пигментов и может быть применено в фотобиологии, физиологии растений, биохимии, биофизике, ботанике, растениеводстве, марикультуре, биотехнологии.

Цель изобретения - повышение чувствительности определения содержания и состояния нативного фитохрома.

На чертеже представлены графики спектров низкотемпературной (-196°С) флуоресценции фитохрома в клетках стеблей этиолированных проростков гороха (Pisum sativum) После предварительного освещения их дальним краснь1м светом (720-740 нм) (спектры 1, 1 красным светом (660-670 нм) (спектры 2,2) и снова дальним красным светом (спектры 3,3),-спектры излучения флуоресценции (1 -3 ), спектры возбуждения флуоресценции (1-3) и соответствующие разностные спектры: спектр 4- спектр 1 минус спектр 2 и спектр 4 спектр 1 минус спектр 2.

Образцы при комнатной температуре освещают дальним красным светом с длиной волны 720-740 нм, после чего их замораживают в сосуде Дьюара с жидким азотом до -196°С (или в крио- стате до температуры, близкой к тем- пературе жидкого азота, -190 С) и измеряют спектры флуоресценции при ее монохроматическом возбуждении светом с длиной волны 580-660 нм -и спектры возбуждения флуоресценции в области 580-700 нм при регистрации флуоресценции в области 710-800 нм. Затем образцы размораживают до 0°С, осве- щают красным светом с длиной волны 660-670 нм, после чего повторно замораживают и повторно измеряют спектры флуоресценции и ее возбуждения при соблюдении указанных условий. После этого образцы снова размораживают до 0°С,. освещают дальним красным светом с длиной волны 720-740 нм замораживают и повторно измеряют спетры флуоресценции и ее возбуждения.

Доказательством того, что.зарегистрированная при измерении указанных спектров флуоресценция принадлежит фитохрому (его красной форме), является практически полная обрати- мость изменений флуоресценции, вы-, званных красным светом, при последующем освещении образцов дальним красным светом, глубина изменений (около

80%), а также близкое сходство полученных спектров фитохрома в клетке имеющихся в литературе спектров выделенного очищенного фитохрома. Об общем количестве, состоянии и натив- ных свойствах фитохрома в .клетке судят по исходным и разностным спектрам флуоресценции и ее возбуждения.

Интенсивность в максимумах флуоресценции (686 нм) и возбуждения флуоресценции (673 нм) является пока- зателем, отражакщим содержание всего фитохрома в клетке, интенсивность в соответствующих максимумах в.разностных спектрах пропорциональна содержанию фотоактивного при физиологических температурах пигмента. О натив- ных характеристиках фитохрома и их изменениях судят по форме и положению полос в спектрах возбуждения флуоресценции (спектры 1-3) и в спектрах излучения «флуоресценции (1-3) Для иллюстрации этого приведен спектр излучения флуоресценции лио- филизованных этиолированных проростков гороха (спектр 5). Видно, что высушивание приводит к сдвигу спектра на 2-3 нм в длинноволновую сторону по сравнению с исходным спектром (спектр 1 ).

Пример 1. Берут участки стеблей 5-дневных этиолированных проростков гороха (Pisum sativum), имеющие низкое по сравнению с лйстьями содержание протохлсрофилла. Помещают их в пластмассовую кювету (толщина кюветы 0,5 см) и освещают в течение 30 с дальним красным светом с длиной волны 720 нм от осветителя типа Свитязь в комбинации с интерференционным светофильтром (полуширина спектрального интервала 7 нм, интенсивность света 10-100 Вт(м ), после чего кювету с образцом опускают в сосуд Дьюара с жидким азотом, установленный в спектрофлуориметре, и регистрируют спектр флуоресценции фитохрома в области 640-750 нм при спектральной ширине щелей 2 нм и возбуждении флуоресценции светом с длиной волны 580 нм (полуширина спектрального интервала возбуждающего света 2нм). Затем регистрируют спектр возбуждения флуоресценции в области 580-700 нм (спектральная ширина щели 2 нм) при интегральной регистрации излучения в диапазоне 710-800 нм, который определяется областью пропускания комбинагчии граничных светофильтров КС-17 и ФС-6 и границей чувствительности фотоприемника ФЭУ-79 (около 800 им). После этого кювету с об- g резцом вынимают из сосуда Дьюара, образец размораживают до , освещают в течение 30 с красным светом с длиной волны 660 нм, замораживают, погружая в сосуд Дьюара, и регистриру- ю ют спектры флуоресценции и ее возбуждения при аналогичных условиях. Затем размораживают образец до , освещают дальним красным светом с длиной

Получаемые спектральные характеристики фитохрома аналогичны таковым в примере 1. Количество фитохрома определено в 1,4-10 г/л. Глубина превращения красной форм1.1 фитохрома в этих условиях несколько ниже и составляет 80%.

Пример 3. Берут этиолированные проростки гороха и проводят с ними все операции аналогично примеру 1. Световыми условиями проведения эксперимента являются следующие: длина волны действующего дальнего красдлина волны возбуждающего света при регистрации спектров излучения 550 нм, коротковолновая граница диапазона

волны 720 нм, замораживают до 15 ного света 700 нм, длина волны дей- и измеряют спектры. Состояние фито- ствующего красного света 640 нм, хрома в тканях этиолированных проростков гороха характеризуют следующие полученные параметры: положение максимума в спектрах возбуждения флуорес-20 регистрируемого излучения при из- ценции (и, соответственно, спектре мерении спектров возбуждения флуорес- поглощения) 673 нм и в спектре флу- ценции 680 нм (светофильтр КС-18). оресценции 686 нм, а также форма спектров.

Концентрацию фитохрома в клетках проростков, равную 1,3 10 г/л, определяют по интенсивности флуоресПри таких условиях не удается провести определение фитохрома по следую25 щим причинам: глубина фотопревращения фитохрома под действием указанных длин волн невелика/ спектр флуоресценции сильно искажен вследствие влияния фоновой флуоресценции и низценции пигмента в максимумах спектров ее излучения 686 нм и возбуждения 673 нм. Необходимую для такого определения калибровку спектрофлуо- риметра проводят, используя в качестве стандарта образец, например колеоптили ячменя, концентрацию фиПолучаемые спектральные характеристики фитохрома аналогичны таковым в примере 1. Количество фитохрома определено в 1,4-10 г/л. Глубина превращения красной форм1.1 фитохрома в этих условиях несколько ниже и составляет 80%.

Пример 3. Берут этиолированные проростки гороха и проводят с ними все операции аналогично примеру 1. Световыми условиями проведения эксперимента являются следующие: длина волны действующего дальнего красного света 700 нм, длина волны дей- ствующего красного света 640 нм, регистрируемого излучения при из- мерении спектров возбуждения флуорес- ценции 680 нм (светофильтр КС-18).

длина волны возбуждающего света при регистрации спектров излучения 550 нм, коротковолновая граница диапазона

ного света 700 нм, длина волны дей- ствующего красного света 640 нм, регистрируемого излучения при из- мерении спектров возбуждения флуорес- ценции 680 нм (светофильтр КС-18).

ного света 700 нм, длина волны дей- ствующего красного света 640 нм, регистрируемого излучения при из- мерении спектров возбуждения флуорес- ценции 680 нм (светофильтр КС-18).

При таких условиях не удается провести определение фитохрома по следующим причинам: глубина фотопревращения фитохрома под действием указанных длин волн невелика/ спектр флуоресценции сильно искажен вследствие влияния фоновой флуоресценции и низкой собственной флуоресценции фитохрома; спектры возбуждения флуоресценции не удается зарегистрировать вследствие влияния рассеянного возбуждающего света в области главного

Изобретение относится к способам определения содержания растительных пигментов и может быть применено в фотобиологии, физиологии растений и т.д. Цель изобретения - повышение чувствительности определения содержания и состояния нативного фи- тохрома. Образцы при комнатной температуре освещают дальним красным светом с длиной волн 720-740 нм, затем замораживают в сосуде Дьюара с жидким азотом до -196°С и измеряют спектры флуоресценции при ее монохроматическом возбуждении светом с длиной волны 580-660 нм и спектры возбуждения флуоресценции в области 580- ) 700 нм при регистрации флуоресценции в области 710-800 нм. Затем образцы размораживают до , освещают красным светом с длиной волны 660- 670 нм, после чего повторно замораживают и повторно измеряют спектры флуоресценции и ее возбуждения при соблюдении тех же условий. После этого образцы снова размораживают до 0°С, освещают дальним красным светом с длиной волны 720-740 нм, замораживают и повторно измеряют спектры флуоресценции и ее возбуждения. О состоянии и количестве фитохрома в клетке судят по исходным и разностным спектрам флуоресценции и ее возбуждения. 1 ил. о в (Л с

тохрома в которых устанавливают спек

трофотометрически. Глубина превращения фитохрома в образце под действием света составляет 82%. Это говорит, о том, что практически весь присутствующий в тканях проростков пигмент находится в фотоактивном состоянии и что полученные данные характеризуют красную фотоактивную форму фитохрома.

Пример 2. Берут участки стеблей этиолированных проростков гороха и проводят с ними операции аналогично примеру 1. При этом длину волны действующего дальнего красного света и красного света устанавливают соответственно 740 нм и 670 н длину волны возбуждающего монохроматического света при измерении спектров флуоресценции - 660 нм, коротковолновую границу регистрируемого излучения при измерении спектров возбуждения флуоресценции - 720 нм. 0с- тгшьные условия аналогичны примеру

максимума.

И р и М е р 4. Берут этиолированные прорбстки и проводят с ними все операции аналогично примеру 1. Световыми условиями проведения эксперимента являются следующие: длина волны действующего дальнего красного света 700 нм, действующего красного света 700 нм, длина волны возбуждающего света при регистрации спектров фпуо- i ресценции 680 нм, длина волны коротковолновой границы регистрируемого интервала флуоресценции 730 нм. При указанных условиях невозможно провести определение фитохрома в клетке.

Использование предлагаемого способа позволяет повысить чувствительность определения содержания и состояния нативного фитохрома в клетке.

Формула изобретения

Способ определения состояния фитохрома в растительной клетке, включающий исследование спектральных характеристик растительной ткани выращенных в темноте проростков, путем освещения растительных тканей красным светом, измерения спектров повтор- ного освещения дальним красным светом, повторного измерения спектров и вынесения суждения о состоянии фи- тохрома по спектральным характеристикам, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа и врзможности количественного определения содержания фито- хрома в растительной клетке, в качестве спектральной характеристики не- следуют спектры флуоресценции, при этом перед измерением спектров растительную ткань предварительно освещают дальним красным светом, затем

&Х}

вго

61(0 S60

замораживают до температуры (-190)- (-196)С, измеряют спектры флуоресценции при возбуждении флуоресценции в области нм и Спектры возбуждения флуоресценции в области 580- 700 нм при регистрации в области 710-800 нм, затем образцы размораживают до , освещают красным светом перед измерением .спектров, повторно замораживают, измеряют спектры флуоресценции при тех же условиях, перед освещением дальним красным светом размораживают, а перед повторным измерением спектров растительную ткань опять замораживают, а о состоянии и количестве фитохрома в кпетк е судят по исходным и разностным спектрам флуоресценции и ее возбуждения.

лохго

JO

/ V

по

TiO Янн