Способ определения коэффициента диффузии в растворе Советский патент 1989 года по МПК G01N13/00 

1

Изобретение относится к контрольно-измерительной технике, а именно к способам изучения процессов массо- переноса в растворах, например диффузионных, и может быть использовано для определения коэффициентов диффузии биополимеров в биохимии, биофизике, молекулярной биологии и медицине.

Целью изобретения является расширение области применения способа путем обеспечения определения коэффициента диффузии в многокомпонентных растворах и повышение точности путем.

уменьшения ошибок, связанных с неопределенностью начальных условий.

На фиг.1 представлена схема устройства, реализующего предлагаемый способ; на фиг.2 - вид интерференционной картины в полосах конечной ширины и в момент окончания электро- форетического разделения двухкомпо- нентной смеси (сплошные кривые) и вид интерференционной картины диффузионного размытия зон череч время т после выключения электрического поля (пунктирные кривые), b - период по-

Ј -v

00 О

со ел

лос настройки, Y отклонение полос от начального расположения; на фиг.З - вид интерференционной картины в полосах бесконечной ширины в мо- мент окончания электрофоретического разделения, цифрами обозначен номер полосы,, соответствующий порядку интерференции; на фиг.4 - распределение порядка интерференции в момент выключения электрического поля (сплошная кривая) и через время t (пунктирная кривая) для одной фракции при настройке на полосу конечной ширины,

Устройство для осуществления спо- соба (фиг,1) содержит прибор 1 для электрофореза на гориконтальной пластине геля (электродные резервуары, источник питания и стол прибора не показаны), который установлен в иоле зрения голографического интерферометра, содержащего лазер 2, коллиматор 3, светоделитель 4, зеркало 5, голограмму 6 и фоторегистрирующее устройство 7„ Интерферометр собран по схеме записи с наклонным опорным пучком и работает следующим образом. Луч лазера 2 расширяется коллиматором 3, затем светоделителем 4 разде- ляется на предметный и опорный пучки, Пердметный пучок, пройдя через слой геля на пластине 1, попадает на голограмму 6. Опорный пучок зеркалом 5 направляется также на голограмму 6 обеспечивая при взаимодействии с предметным пучком формирование на ней интерференционной картины.

I

Измерения можно проводить при

двух режимах настройки; на бесконечную ширину полосы и на конечную ширину полосы, При настройке на бесконечную полосу труднее определить положение максимального порядка интерференции и его абсолютную величину, если они не кратны 0,5 (фиг.З), поэтому настройка на полосы конечной i ширины предпочтительнее, так как позволяет точно определить эти величины в любом месте зоны (фиг.2). По- рядок интерференции N при настройке на бесконечную ширину полосы равен номеру полосы. Он возрастает от нулевого значения вне зоны биополимера и принимает дискретные значения N 0,5; 1,5;; 2,5 и т.д. для темных полос и 2 и т.д. для светлых поло по направлению к центру зоны (фиг.З)

5

0 5

5

При настройке на полосу конечной ширины порядок интерференции равен отношению смещения полос от начального расположения Y к периоду полос Ь, т.е., N Y/b (фиг.2).

Определение коэффициентов диффузии производится следующим образом. Подготовленный прибор 1 для электрофореза устанавливается в поле зрения интерферометра и осуществляется запись на голограмму 6 интерферциои- ной картины начального состояния геля в системе электрофоретического разделения. Голограмма обрабатывается фотохимическим способом, на гель наносится проба разделяемого биопрепарата и включается электрическое напряжение. Начинается процесс электрофореза, наблюдение за ходом которого осуществляется визуально в реальном масштабе времени на интерференционной картине, образующейся при взаимодействии начального предметного пучка, записанного на голограмме 6 и восстановленного опорным пучком (оно соответствует чистому гелю), с текущим предметным пучком, прошедшим гель с содержащимися в нем зонами биопрепарата. Этот режим соответствует настройке на бесконечную ширину полосы. Для настройки интерферометра на полосу конечной ширины необходимо поворотом зеркала 5 (фиг.1) на небольшой угол (2-3 ) добиться желаемой частоты полос по полю прибора.

В ходе электрофореза начальная проба, внесенная в гель, разделяется на ряд пространственно разнесенных зон, соответствующих отдельным компонентам смеси. Критерием разделения при настройке на полосу конечной ширины является появление между зонами ряда параллельных полос, соответствующих начальной настройке (фиг.2, сплошные кривые). При настройке на .полосу бесконечной ширины критерием разделения является появление зазора (светлого поля) между полосами и с порядком интерференции 0,5 двух соседних зон.

После окончания разделения производится выключение электрического поля и одновременно с этим регистрируется первая интерференционная кар-- тина фоторегистрирующим устройством 7. На фиг.2 этому моменту соответствуют сплошные линии. В дальнейшем направленное движение зон в геле прекращается, а процесс диффузионного размывания зон продолжается, и через время t после выключения поля устройством 7 регистрируется соответствующая этому состоянию вторая интерференционная картина (фиг.2, пунктирные линии). Затем фотоматериал обрал батывается и расчет коэффициента диффузии D производится отдельно для каждой фракции при совместной обра-о ботке полос на первой и второй интерференционных картинах с помощью выражения

15 голографии типа МИКРАТ ЛОИ2, затем на месте съемки проводят фотохимиче кую обработку голограммы и поворот зеркала 5 (фиг.1) осуществляют настройку интерферометра на полосы к

20 нечной ширины.

В углубление в геле вносят проб разделяемой смеси в объеме 10 мкл, на электроды подают напряжение ЬОС В от источника ИПЭ-600 (при это

где N(X,,0) и N(X,1,9 ) - порядок интер ференции на расстоянии X 1 и Хг соответственно от точки с максимальным порядком интерференции на первой интерференционной картине, соответствующей начальному моменту времени (момент выключения, электрического по- 25 напряжение непосредственно на геле

780956

Пластину устанавливают горизонтально на столик прибора для электрофореза, расположенный в поле зрения f- голографического интерферометра. В электродные сосуды заливают трис-гли- циновый буферный раствор (рН 8,6), на гель накладывают контактные фитили. Во время проведения эксперимента

Ю температура окружающей среды составляет 18,5°С.

Осуществляют запись голограммы начального состояния геля в зоне разделения на фотопластине для

15 голографии типа МИКРАТ ЛОИ2, затем на месте съемки проводят фотохимическую обработку голограммы и поворотом зеркала 5 (фиг.1) осуществляют настройку интерферометра на полосы ко20 нечной ширины.

В углубление в геле вносят пробу разделяемой смеси в объеме 10 мкл, на электроды подают напряжение ЬОС В от источника ИПЭ-600 (при этом

25 напряжение непосредственно на геле

Изобретение относится к контрольно-измерительной технике, а именно к изучению процессов массопереноса в растворах, например диффузионных, и может быть использовано для определения коэффициентов диффузии биополимеров в биохимии, биофизике и др. Целью изобретения является расширение области применения способа путем обеспечения определения коэффициента диффузии в многокомпонентных растворах и повышение точности путем уменьшения ошибок, связанных с неопределенностью начальных условий. Новым в способе является то, что градиент концентрации в растворе формируют с помощью электрофоретического разделения. Формирование считают законченным при образовании пространственно разнесенных зон. Эти зоны соответствуют отдельным компонентам раствора. Регистрируют временную зависимость голографической интерферограммы после выключения электрического поля. Коэффициент диффузии отдельного компонента рассчитывают по параметрам участка интерферограммы, соответствующего зоне данного компонента. 4 ил.

ля);

NCXj. c) и N(X4,Ј) - порядок интерференции на расстоянии X3 и X, соответственно от точки с максимальным порядком интерференции на второй интерференционной картине, снятой через время Т с момента выключения электрического поля (фиг.4).

На фиг.4 показано определение величин, входящих в расчетную формулу. При обработке интерферограмм в полосах конечной ширины удобно принять , тогда значения N(X,,0) и N(X,, c ) будут соответствовать максимальным порядкам интерференции в моменты времени 0 и & .

Пример. Определяют коэффициенты диффузии двухкомпонентной смеси следующего состава; альбумин сыворотки крови человека 11 мг гемоглобин из . крупного рогатого скота 5 мг; 0,5 М трис-HCl буфер (рН 6,8) до 1 мл. Общее содержание белка в пробе 1,6%.

Электрофорез проводят по ступенчатой системе, для чего на пластине размером 8x9 см полимериэуют раЧЗр- чий гель с концентрацией мономера 7,5% и концентрацией сшивки 2,5% и формирующий гель с концентрацией ономера 4,5% и концентрацией сшивки 2,5%. Толщина геля 1,8 мм, в стартовой зоне формирующего геля выполнено углубление для внесения пробы размером 10x1,5 мм.

составляет,75 В) и начинают электро- форетическое разделение, наблюдение за ходом которого ведут визуально в реальном масштабе времени по изменению интерференционной картины. После достижения достаточной степени пространственного разделения смеси на фракции (через 60 мин) синхронно выполняют следующие операции: выключают электрическое поле, на фотопленку регистрируют первую интерференционную картину; включают секундомер.

Через 23 мин после этого фиксируют вторую интерференционную картину, соответствующую диффузионному размытию полос (вид полос показан на ,2, где фракция 1 соответствует гемоглобину,а фракция 2 - альбумину).

Перед проведением расчета с полученной ) в ходе фоторегистращш процесса диффузиии пленки увеличенное изображение (в масштабе 20:1) для обоих моментов времени проецируют на

бумагу, соответствующие полосы совмещают и фиксируют. В процессе дальнейшей обработки каждой фракции в соответствии с фиг.4 получены следую- щие числовые данные: для фракции 1

Т 1380 с, Х1 Х, О, Х2 0,6 мм, Х4 0775 мм, N(X,()) 1,15, N(X}/c) 0,833, N(X4,0) 0,645, N(X,,) 0,375; для фракции 2 Т 1380 с, Х, Х, О, Х2 0,5 мм, Х4 0,75 мм,

N(X,,0) 0,60b, N(X,,«) 0,542, N(X4,0) 0,25, N(X4,tr) 0,25.

Подставляя эти значения в расчетную, формулу, получают коэффициенты диффузии соответственно гемоглобина и сывороточного альбумина для приведенных условий эксперимента.

Формула изобретения

Способ определения коэффициента диффузии в растворе, заключающийся в формировании начального градиента концентрации в растворе, регистрации временной зависимости интерферограм- мы раствора, по параметрам которой рассчитывают коэффициент диффузии по диффузионному уравнению Фика, отличающийся тем, что, с

целью расширения области применения способа путем обеспечения определения коэффициента диффузии в многокомпонентных растворах и повышения точности путем уменьшения ошибок, связанных с неопределенностью начальных условий, начальный градиент концентрации в растворе формируют с помощью элек- трофоретического разделения до образования пространственно разнесенных зон, сооответствующих отдельным компонентам раствора, регистрируют временную зависимость топографической интерферограммы после выключения электрического поля, а коэффициент диффузии отдельного компонента рассчитывают по параметрам участка интерферограммы, соответствующего зоне данного компонента.

Ј

Фиг.1

Фракция 1

0,лу7

Фи,г.З

Фракция 2

Фиг.2

N

#(Xf,0)

xf Xj о хг хг

Фа.Ч