Способ выявления возбудителя чумы Советский патент 1992 года по МПК C12Q1/04 G01N33/53 

«Ai-,- „i,..-.v.j;.U-i-

(46) 15.02.9.. Бюл. № б

(21)4442300/13

(22)17.06.88

(71)Всесоюзный научно-исследовательский противочумный институт Микроб

(72)Н.Н. Суриков, А.Ф. Касьян,

А.Ю. Пашин, А.И. Кологоров и Н.Г. Пономарев

(53)576.8.078(088.8)

(56)Наставление по применению имму- ноглобулийов диагностических чумных люминесцирующих сухих, Саратов, 1982.

(54)СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ .ЧУМЫ.

(57)Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть ис.пользовано при микробиологической диагностике чумы и других особо опасИзобретение относится к области микробиологии и может быть использовано для диагностики чумы.

Целью изобретения является ускорение и повышение чувствительности способа.

Пример 1. В центрифужную пробирку объемом 11 мл добавляют последовательно 1 мл 100% глицерина рН 7,2-7,4 окрашенного каким-либо красителем (метилвиолет, конгорот.и т.д.), наслаивают 0,5-1 мл забуферен- ного 80% глицерина рН 7,2-7,6, добавляют 5 мл исследуемой пробы, подозрительной на зараженность бактериями чумы,, в которую предварительно вносят чумные диагностические люминесцирую- щие иммуноглобулины до рабочей концентрации, которая соответствует 1:50 для иммуноглобул;ШОБ с рабочим титных инфекций. Целью изобретения является ускорение и повышение чувствительности способа. При исследовании объектов внешней, среды на наличие возбудителя чумы применяется центрифугирование в градиенте плотности глицерина. Пробы предварительно обрабатывают специфической люминесцирую- щен сывороткой.- В результате чего достигается концентрация микробов в объеме 80% глицерина с одновременной окраской их люминесцирующимн иммуноглобулинами. Посторонние частицы, имеющие плавучую плотность большую по сравнению с плотностью возбудителя чумы, оседают на дно центрифужной про--

лUp

бирки 3 табл.

ром 1:8 (для иммуноглобулинов с титром 1:16 и 1:32 рабочая концентрации соответствует разведению 1:100, а д-ля иммуноглобулинов с титром 1:64 рабочей концентрацией является разведение 1:150). Затем пробу инкубируют при комнатной температуре в течение 3-5 мин и центрифугируют 10 мин на центрифуге с ротором диаметром 180 мм при 5000 об/мин (2500 g).

После центрифугирования четко разграничиваются три слоя: верхний - 5 мл надосадочной жидкости; средний - 0,5-1 мл эабуферештого 80% глицерина, который содержит микробные клетки и нижний - 1 мл 100% глицерина с посторонними частицами (земля, песок, пыль и т.д.). Для дальнейшего исследования с помощью пипетки Пас- тера, шприца или лмтоматг еокс; ; пикя

4Х

о о

N

VI

петки отбирают средний слой 0, 5-1 мл забуференного 80% глицерина, содержащий микробные клетки и помещают в стрильную пробирку. Затем из этой пробы отбирают материал для посева на питательные среды, для заражения лабораторных животных и петлей № 2 де- |лают мазки на обезжиренном предметно |стекле. Мазки закрывают покровным стеклом, на края которого наносят раплавленный парафин таким образом, чтбы образовалась герметическая камера помещают в крышку чашки Петри и просматривают под люминесцентным микроскопом, отмечая количество микробных клеток и степень специфического свечения. От начала до конца исследования занимает 16-18 мин.

Пример 2. Способ ускоренного выявления возбудителя чумы апробирован в следующих условиях: в 2 чашки Петри помещают садовую землю (2 г), затем в каждую вносят по 5 мл взвеси Jersinia pestis в физиологическом растворе концентрацией 5 О7 и 10. м.кл. в 1 мл. Культуру выращивают на агаре Хоттингера в течение 48 ч при 28 и 37°С.

Чашки помещают в термостат при 28 С до полного высыхания. Затем с чашек делают смыв 10 мл забуференног физ. раствора рН 7,2-7,4. Всего проведено 10 опытов. Результаты (сводны данные по 10 опытам) представлены в табл. 1.

Из представленных результатов следует, что способ является более эффективным по сравнению с общепринятым при ускоренной диагностике возбудителя чумы, т.к. среднее число светящихся бактерий, выращенных при 37°С в 10 полях зрения при общепри-- нятом методе исследования составляет 2iO,3 при исходной концентрации 10 м.кл. результат отрицательный. При разработанном методе число светящихся Микробных клеток составляет 14±3 и 2Ј0,2, соответственно, что в 7 раэ эффектнее,

, Среднее число светящихся бактерий выращенных при 28°С в 10 полях зрения при исследовании разработанным методом составляет 1,2+0,2 и 2±1 при исходной концентрации микробов 10 и 10 м.кл. в 1 мл соответственно, а при исследовании общепринятым методом результат отрицательный,

5

0

5

Q

0

5

0

5

0

5

Пример 3. Проведено испытание активности, чувствительности и специфичности способа в сравнении с традиционным методом флуоресцирующих антител.

Результаты испытания активности и чувствительности представлены в табл. 2, специфичности в табл. 3.

Установлено, что предложенный метод по своей активности превосходит традиционный метод, т.к. при его применении интенсивность свечения клеток штамма J. pestis E.B. как выращенного при 28°С, так и при 37 С, а также сухой вакцины ЕВ возрастают на лдин порядок.

Чувствительность заявленного метода при исследовании минимальных концентраций (1-10 м.кл. в мл) микробных клеток штамма J. pestis ЕВ, выращенных при 28°С и 37°С в 3 раза выше, .чем у общепринятого метода (см табл. 2). Специфичность заявленного метода исследована с помощью возбудителя псевдотуберкулеза (шесть эталонных штаммов серотнпов I, II, III, IV, V, VI) и кишечного иерсиниоэа (штаммы - 97,373} в концентрациях 1 ЧО6, 1 -107; 5Ч07 и 5 -108 м.кл. в - мл.

Установлено, что при изучении специфичности заявленного и общепринятого способов заметного расхождения результатов не отмечено (см, табл. 3).

Предлагаемый способ по своей активности и чувствительности превосходит общепринятый метод флуоресцирующих антител, не отличаясь от него по своей специфичности. Способ может быть использован с целью индикации возбудителя чумы в смывах с объектов внешней среды. Формула и.з обретения

Способ выявления возбудителя чумы, включающий центрифугирование исследуемого материала, приготовление мазка обработку специфическими лю- минесцирующими иммуноглобулинами с последующей микроскопией, отличающийся тем, что, с целью ускорения н повышзиия чувствительности способа, перед центрифугированием люминесцирующие иммуноглобулины вносят в исследуемый материал, центрифугирование полученной смеси осуществляют в градиенте плотности глицерина, а для приготовления мазха используют слой 80л глицерина.

10 II 12

I J. p tit EB/28I 10

г J. p.ltii ЕВ/281-Ю1

3J. fwitia ЕВ/285 МО

4J. petti ЕВ/37I 10

5J. p««ti( IB/37I -lo

J. BB/375 10

7 Cm iiicum EBI 10

в - - -it| |rf

Сны.

9 J. pe«ti« EB/28I 10

J. p«iti« EB/28I Iff

J. p.iti. EB/371 10

Сим El/37 J.

1 10

444

ДНШ1Ч.

«ДМНМЧ.

Ф0ННКЧ.

4-+

единим.

«+ 2

н.кл. i пол aptHHi

количество поле --#

едиянх.елиинч.

6-в Н.КЛ. ПОЛ «D«H««

болью количество пол

3-6 м.хл. пол

дммт. «дннич. 2 нж.л 2 н.кл. 8 м.кл 6-14 н. хл лап

вольное колнч стю н кл пол больяо количество пол реяня

--++--+ + +- + +44+4. + +

2 н.кдА 8 м.кл в лол ярвння

«-4444-444+44tt44 444

7 н«кл II н.кл 6 х.кл4-20 ы.гл поле зрения

4-44

дммичнъм м.кл пол ярения

4+ 4-4444

4-5 м.кя пол 1рення

44

едкикчмм н. кл поле р«мкя 3-5 н.кя пол рения

2- 4 н ил V лолс ярен

10 - 13 и.кл пол эреяня 2-3 н.кл я пол уремия 10-12 н.кя поле 1рения

Таблица I

Т « я я а I

«+ 2

н.кл. i пол aptHHi

6-в Н.КЛ. ПОЛ «D«H««

2- 4 н ил V лолс ярен

10 - 13 и.кл пол эреяня 2-3 н.кл я пол уремия 10-12 н.кя поле 1рения

., VI/28

единич.

++ 7 и.хл

4 м.кд

2 м.кд

++. 2 н.кл

о

NO

О

-4

едиыкч.

+4-f

единич.

f

едннич.

+

едиыич.