Способ определения глубины залегания структур в микроскопических препаратах Советский патент 1993 года по МПК G01N21/85 

Изобретение относится к технике микроскопических измерений и может найти применение для определения глубины залегания различных биологических структур в пленочных макро- и микроскопических анатомических препаратах и гистологических срезах.

Цель изобретения - повышение точности и производительности измерений.

Поставленная цель достигается тем, что в способе определения глубины залегания структур в микроскопических препаратах, включающем освещение препарата источником света, фокусировку микроскопа последовательно на одну из поверхностей препарата и на структуру внутри него в регистрацией прошедшего через препарат

света, согласно изобретению, препарат освещают расходящиеся пучком света, при регистрации фотографируют изображение препарата для воздух положений источника света, смещаемого в плоскости, параллельной плоскости препарата, на величину S, фокусировку на структуру внутри препарата осуществляют с шагом т, не превышающим глубину резкости микроскопа, а глубину залегания структуры в препарате определяют по формуле

00

S

о

N3

Ј

hi

,М,

Н ± (п - 1 jm I H

гтлй

+ (n-1)m, (1)

где п 1,2,3,..., N - номер шага перефокусировки;--

Н - расстояние между плоскостью, в которой расположен источник света, и выбранной поверхностью препарата;

li(n - величина смещения проекции препарата на сопряженной паре микрофотог- рамм на n-м шаге перефокусировки.

Способ заключается в следующем.

1. Микроскопический препарат устанавливают и фиксируют на предметном столике микроскопа. Из устройства микроскопа ис- ключают конденсор. Препарат освещают точечным источником света, который можно перемещать на стандартное расстояние S в горизонтальной плоскости, параллельной плоскости предметного столика микроско- па и расположенной на расстоянии Н от выбранной поверхности препарата, из положения si в положение s и обратно.

2. Фокусируют микроскоп таким образом, чтобы передняя граница глубины рез- кости микроскопа совпала с выбранной поверхностью препарата (фиг.1). Контроль за точностью фокусировки осуществляют путем смещения точечного источника света на стандартное расстояние. При этом струк- туры, лежащие на поверхности препарата, должны оставаться неподвижными.

3. Обычным микрофотографическим способом получают две сопряженные микрофотограммы: одну - из положения точеч- ного источника si, другую - из положения S2 (фиг.2).

4. Проводят перефокусировку микроскопа с шагом т. Повторяют п.З Повторяют п.4 до тех пор, пока не будет просмотрен весь препарат сверху вниз или наоборот.

5. На сопряженных парах микрофотограмм на изучаемых структурах находят однозначнодифференцируемыесветоконтрастные точки. После смещения сопряженных пар в каждой паре измеряют величины смещений проекций найденных точек (фиг.З) li(n).

6. По формуле (1) определяют глубину залегания hpn изучаемой структуры в мик- роскопическом препарате по отношению к верхней поверхности последнего при просмотре сверху вниз (при этом перед дробью ставится знак +, а в числителе - знак либо по отношению к нижней поверхности последнего при просмотре снизу вверх (при этом перед дробью ставится знак -, а в числителе - ).

Предложенный способ микроскопических измерений основан на следующей гео- метрической закономерности, при этом Pi и Р2 - передняя и задняя границы пространства глубины резкости микроскопа; si и S2 - положения точечного источника света; s - расстояние между этими положениями; Н расстояние от точечного источника света до передней границы глубины резкости микроскопа; ai - светоконтрастнаядочка на структуре внутри препарата, а и а - центральные проекции этой точки из si и S2 на Pi; hi -глубина залегания точки по отношению к Pi; отрезок si.sa параллелен PL Центральные проекции точки ai на плоскость PI имеют Следующие свойства:

1) если точки а1,а2,аз,..,а| лежат в одной плоскости, параллельной Pi, то lf 2 1з... h;

2) чем больше hi, тем больше h ;

3) чем меньше Н, тем больше h ;

4) чем больше s, тем больше li. Из подобия пирамид А и В следует отношение

s Н - h i h hi

из которого получают формулы

h - H|i h ҐTTI

позволяющую определять глубину залегания структур внутри пространства глубины резкости микроскопа по отношению к его передней границе.

При первой фокусировке микроскопа глубина залегания структур, попавших в пространство глубины резкости микроскопа, по отношению к выбранной поверхности преперата определяется по формуле (3). При второй перефокусировке микроскопа глубина залегания структур препарата, попавших в пространство глубины резкости микроскопа, по отношению к выбранной поверхности препарата будет определяться из формулы

т(Н±т)

TTF

+ т,

(4)

где т - шаг перефокусировки. Если Т - глубина резкости микроскопа, то m Т, так как в противном случае при перефокусировке микроскопа часть пространства препарата не будет попадать в пространство глубины резкости микроскопа.

Продолжая эти рассуждения, можно предположить, что общая формула нахождения глубины залегания структур в препарате по отношению к верхней поверхности препарата, справедливая для любого шага перефокусировки п, будет иметь вид (1). Справедливость этого предположения доказывается методом математической индукции (Виленкин Н.Я. Индукция.

Комбинаторика. - М.: Просвещение, 1976, с. 11-12).

При п 1 выражение (1) истинно, поскольку оно принимает вид формулы (3). Если предположить, что при n k выраже- ние

h. + IH -ffi P+O. + i)

истинно, тогда при п k + 1 получают выражение

jH±№tr№ +Bi+fl- 5

которое является ни чем иным, как выражением (1) при п k + 1. Следовательно, оно истинно при любых натуральных значениях п. Для просмотра всего микроскопического

препарата необходимо сделать п у шагов перефокусировки, где L - толщина препарата.

Пример. Точечный источник света установлен таким образом, что s 5000 мкм, Н 10000 мкм; шаг перефокусировки m 10 мкм, глубина резкости микроскопа Т 10 мкм, толщина препарата L 20 мкм.

При наложении двух сопряженных микрофотограмм, полученных при п 1, установлены для четырех светоконтрастных точек на интересуемых структурах следующие величины смещения их проекций:

О;ill Hi If И 3, 12 4, 1з 5, Ц 2 (мкм)

При наложении двух сопряженных микрофотограмм, полученных при п 2, установлены для двух светоконтрастных точек на интересуемых структурах следующие величины смещения их проекций:

/.: -л

И 4, 2 2 (мкм)

По формуле (1), учитывая, что препарат просматривался сверху вниз, определяют глубину залегания этих структур:

if ; а f :. hi 6, h2 8, h3 10, , hi 18, h2

14 (MKM).

Предложенный способ обеспечивает следующие преимущества по сравнению с известным:

1. Определение глубины залегания структуры внутри микроскопического препарата проводят по параметру, измеряемо

5

10

5

Л

25

30

35

40

45

50

55

му в горизонтальной плоскости, т.е. в плоскости поля зрения микроскопа, что по точности значительно выше, чем измерения вдоль оптической оси микроскопа, проводимые по прототипу.

2. Одновременно с повышением точности измерений достигается повышение производительности измерений, так как одновременно регистрируются все смещения структур, попавших в поле зрения микроскопа, и по одной сопряженной паре микрофотограмм можно получить значения глубины залегания практически всех светоконтрастных точек этих структур, В прототипе одним измерительным приемом можно получить значение глубины залегания лишь для одной структуры.

Способ реализуется устройством (1), которое содержит смещаемый точечный источниксвета, микроскоп, микрофотографическую приставку.

Устройство работает следующим образом:

1). Закрепленный на предметном столике микроскопа препарат освещают точечным источником света из положения последнего si и производят фоторегистрацию изображения препарата.

2). Перемещают точечный источник света в положение S2 и производят повторную фоторегистрацию изображения препарата. Полученные таким образом микрофотограммы будут представлять сопряженную пару.

3) Производят перефокусировку микроскопа на следующий слой препарата с шагом m и повторяют пп. 1 и 2. Перефокусировки повторяют до тех пор, по-1 ка не будет просмотрен весь препарат.

Изобретение поясняется фиг. 1-5.

На фиг.1: 1 - микроскопический препарат; 2 - точечный источник света; 3 - микроскоп; 4 - микрофотографическая приставка; 5 - пространство глубины резкости микроскопа; 6-L;7-T;8-s; 9 - h(1); 10- kj(1); 11 -Н.

На фиг.2: 1 и 2 - сопряженная пара микрофотограмм; 3 и 4 - изображения све- токонтрастной точки ai.

На фиг.З: 1 - наложенные друг на друга сопряженные микрофотограммы; 2 - изображения светоконтрастной точки (а и a j).

На фиг.4 и 5: 1 - Pi, 2 - Ра; 3 - si; 4 - 52: 5 - s; 6 - Н; 7 -ai; 8 - а,-; 9 - 10 - ; 11 - h,-; 12-А; 13- В.

Формула изобретения

Способ определения глубины залегания структур в микроскопических препаратах, включающий освещение препарата источником света, фокусировку микроскопа последовательно на одну из поверхностей препарата и на структуру внутри него с регистрации прошедшего через препарат света, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и производительности измерений, препарат освещают расходящимся пучком света, при регистрации фотографируют изображение препарата для двух положений источника света, смещаемого в плоскости, параллельной плоскости препарата, на величину s, фокусировку на структуру внутри препарат осуществляют с шагом т, непревышающим глубину резкости микроскопа, а глубину hf залегания

2,

структуры в препарате определяют по формуле

ф. ,Ц + ()т

где п 1,2,3,.., N - номер шага перефокусировки;

Н - расстояние между плоскостью, в которой расположен источник света, и выбранной поверхностью препарата;

li nj - величина смещения проекции преп арата на сопряженной паре микрофотограмм на n-м шаге перефокусировки.

Использование: микроскопические измерения, а именно определение глубины залегания различных биологических структур в пленочных макро- и микроскопических анатомических препаратах и гистологических срезах. Сущность изобретения: фотографируют изображение препарата для двух положений источника света, смещаемого в плоскости, параллельной плоскости препарата, на величину S, при этом фокуси: ровку на структуру внутри препарата осуществляют с шагом т, не превышающим глубину резкости микроскопа, а глубину залегания структуры с препарате находят по определенной формуле. 5 ил. ел с

Фив.1

Фиг. 2.

Фие,3