Способ отсчета микродозы при прецизионной микроинъекции водного раствора в микрообъект пневматическим давлением и устройство для его осуществления Советский патент 1980 года по МПК A61M5/20 

J5 sr:-: s:- f.,--. Целыб изобретения является повышение точности отсчета мнкродозы, а также снижение рабочих давлений rijpif микройнъекции. Цель достигается тем, что при осуществлении способа отсчета микро .дозы при прецизионной мнкроинъекции водного раствора в микрообъект после, заполнения конической части кон Чйка мйкропипеткиинъецнруемьам раст вором повышают давление воздуха до величины, соответстэу|рщей началу перемещения мениска в направлении к кончику микропипетки, рассчитывают конусность внутренней поверхности кончика микрооипетки К по зависимос ти: -р-н где Л. коэффициентноверхностногонатяжения на границе инъецируемый раствор - собстве ный пар; давление, соответстбукадее чалу перемещенная мениска инъецируемого раствора в коническом острие микропипетки;высота от мениска до кончи .ка острия микропипетки; затем рассчитывают давление , со ответствующее останову мениска в мо , когда в кончике микропипетки останется заданная величина микродозы V после приложения этого давления, по формуле 2 PC И, подав это давление внутрь микропипетки, вытесняют избыток инъецируемозго раствора из микропипетки, после чего вводят ее в микрообъект и подарт внутрь микропипетки давление Р, определяемое по зависимоетигде. г - радиус выходного отверстия конического острия лшкропипетки, Кровле того, после определения ко нусности К рассчитывают давление во духа РЗ j ; подаваемого в микропипетку, соответствующее заданному объему микро дозы У по формуле; У.к Л р| 1в,Г5о. ВВОДЯТ ВОДНЫЙ раствор В микрообъект Под давлением воздуха Рд Кроме того, устройство для осуществления способа отсчета микродозы при прецизионной микроинъекции водного рАствора в микрообъект снаб жено редуктором давления, связанным выходом ёгулятора внешнего давлени а крАн для подачи и снятия давления выполнен трехпозиционным, причем

72H07 его дополнительный вход соединен посредством пневмопривода, снабженного Манометром, с выходом редуктора давления. На фиг. 1 изображено устройство для осуществления способа отсчета ткродозы при презиционной микроинъекции водного раствора; на фиг. 2кончик микропипетки; на фиг. 3 положение кончика микропипетки, введенного в микрообъект;на фиг. 4 и. 5 - схемы, иллюстрирующие способ отсчета микро озы. Широкая часть микропипетки 1 устройства (фиг. 2) должна иметь диаметр 1-3 мм и длину 10-60 мм. Первое сужение 2 микропицетки имеет угол нак-„ лона 15-20, После этого следует постепенно сужакадийс до нескольких NMKpoH участок 3, имеющий длину 8-15мм. Угол наклона этой части настолько мал , что считать этот участок цилиндрическим. Участок 3 переходит в коническое острие 4 с конусностью порядка,1:8, 1:10. Внутренний диаметр выходного отверстия 5 кончика микропипеткинаходится в пределах 0,1-1 мкм. Чем тоньше кончик, тем меньш может быть TpaBNMpOBaH микрообъект при введении в него микропипетки. Таким образом, внутренняя полость б кончика микропипетки имеет цилиндрическую переходящую в коническую форму. Микропипетка (фиг. 1) кончик которой опущен в сосуд 7 с инъецируе.мым раствором, установленным на столике 8 с окуляром-микрометром микроскопа, широкой частью жестко и герметично закреплена в держателе 9, который жестко установлен, например, на трехкоординатном микроманипуляторе 10, позволяющем вводить кончик микропипетки в инъецируемый раствор или в микрообъект. Штуцер 11 держателя гибким трубопроводом 12 связан с выходом 13 трехпозиционного крана 14 для подачи и снятия давления. Отверстие 15 поворотной части трехпозиционного крана 14 попеременно связывает выход 13 (а, следовательно и внутреннюю полость микропипетки) либо с атмосферой (верхнее полоjKeHHe отверстия Г5 - атмосфера ) , либо через дополнительный вход 16 с выходом понижгиощего редуктора 17 давления через пневмопровод 18 и прецизионный манометр 19 (горизонтальное положение отверстия 15 отсчет.), либо с регулятором 20 внешнего давления посредством пневмопровода 21, тройника 2.2 и пневмопровода 23 (нижнееположение отверстия 15 инъекция). Причем для установки дозы необходимо давление порядка 0,5-2 йтм, устанавливаемое с высокой точностью, а для инъецирования из кончиков диаметров 0,2-0,5 мкм порядка 15-5 атм, которое может быт установлено с меньшей точностью. Способ осуществляется следующим образом. Для определения конусности устанавли-вают кран в положение атмосфера, опускают кончик микропипетки в инъецируемый раствор (фиг. 1), за счет капиллярных сил инъецируемый раствор заполняет внутреннюю полость конического острия и частичнЬ цилиндрическую часть микропипетки (положение lмениска, фиг. 4) (наблюдение за заполнением можно производить под г мкроскопом) . Положение крана 14 при этом - атмосфера. Затем переводят кран 14 в положение отсчет и, постепенно повышая давление воздуха, переводят мениск инъецируемой жидкости в положение I (фиг. 4) (мениск должен расположить ся в коническом острие, вблизи его основания). Давление Р , соответствующее этому положению, фиксируют. Затем замеряют оптическими средствами, например, с помощью окуляр-ми рометра МОВ-15 высоту Н от мениска до острия. Подавлению Р и высоте Н определяют конусность 2 ос т.к. P --Rгде Кд - внутренний радиус кончика микропипетки в сечении по положению I; оС - коэффициент поверхн остного натяжения на границе инъецируемый раствор - собстве ный пар. Так как инъецируемый раствор и внутреннее содержимое большинства биообъектов представляют собой силь но разбавленные водные растворы, вследствие чего их граничное поверх ностное, натяжение практически равно ;нулю, а вода практически полностью смачивает чистую поверхность стекла (т.е. угол смачивания равен нулю то капиллярное давление, которое необходимо преодолеть для перемеще ния менискд, зависит от радиуса капилляра и эта зависимость вьфажает,гя формулой Р в условиях полного смачивания. В связи с малым углом конуса, вн ся незначительную погрешность в измеренис радиуса R, принимаем R R;,. где R отрезку ОА (фиг. 4), приче отрезок ОА перпендикулярен образующей конуса (jB действительности 2: , а не R , но вследствие малог угл конуса можно для упрощения рас четов принять, что Р . После того, как определена конус ность К f( , задаются объемом доз Vf и.находят давление Р , ему соответствующее по формуле гажи у 2, Эта формула выводится с;ледующим образом (фиг. 4) . Vrirn H -i-iK Объем дозы где - объем конуса с радиусом основания о -Лпп - половина объема пара % З. с .радиусом RX. Из уравнениянаходи1ч п - j i | H-i.-lK тРгользуясь зависимостью р . определяет P) и после преобразований, получаем с,.. к 3| V, К 2,1-2,1 К Если повысить давление внутри микропипетки с EJ до Рц , отсчитав его по образцовому манометру с ценой де ления 0,025 атм (кран в положении отсчет), кончик микропипетки опущен либо в инъецируемый раствор, либо в питательную среду, в котором находится биообъект, что удобнее, избыток инъецируемого раствора выдается из микропипетки через выходное отверстие в кончике, а в кончике микропипетки останется заданная доза Vj инъецируемого раствора. Теперь, чтобы выдавить заданную дозу, например в цитоплазму, микрообъекта, следует ввести кончик микропипетки в цитоплазму, кран поставить в положение инъекция и подать давление Р. , где г - радиус выходного отверстия микропипетки. Для выдавливания всей дозы требуется давление , однако это давление подавать не следует в связи с возможностью попадания вохдухав цитоплазму вслед за дозой инъецируемого раствора. Целесообразно внести незначительную погрешность в величину дозы, уменьшив Р„ на величину порядка 5%, но исключить возможность попадания воздуха в цитоплазму. Радиус выходного кончика микропипетки может быть определен одним из известных методов. После проведения инъекции кончик м кропипетки выводят из микрообъекта, выключают подачу воздуха, а кран ставят в положение

атмссфера (фиг. 1).

Пример . Проводилась инъекция дозы V 10 мкм в воду из микропипетки с внутр&нним диаметром кончика 6,5 мкм (г 0,25 мкм). Предварительно теоретически было доказано и практически проверено, что

72H07

8 .

инъекция в воду и в цитоплазму гигантского нейрсна Limnaea stagnalis происходит при одинаковых давлениях. Результаты опыта представлены в табл. 1 (в формулы подставлены значения коэффициента поверхностного натяжения f для воды - 73 дин/с

Высота Н отсчитывалась по окуляр-микрометру КОВ-15, установленному на микроскоп БИОЛАМ 70 Рб. Таблица 1

Для установки дОзы на манометре устанавливалось давление 1,70 кг/см при этом кснчик микропипетки был опущен в Ёоду, это давление подавалось в широкую часть микропипетки, в результате чегЬ устанавливалась дОза 10 МКМ. При подаче давления порядка б атм вся вода из кончика выходила в воду в сосуде, за исключением небольшого количества, оставшегося в самом кончике острия для г 0,25 мкм.

.«

-0,050,05 I 0,25 MUM.

5,7 атм.

0,г5-

Устройство обеспечивает установку заданной величины давлений Р , PJ, по образцовому манометру при кране, установленном в положение отсчет , и следовательно, точное определение конусности и тачную установку заданной дозы Yj , соответствующей давлению Р, , а при положении itpaHa инъекция обеспечивает подачу высокого давления для прохождения мениска инъецируемого раствора к самому кончику острия и его остановку.

После определения конусности К вышеописанным методом определяют давление воздуха РЗ , соответствующее объему микродозы V., вводят кончик микропипетки в цитоплазму и, устанрвйв это давление на манометре 19 (положение крана - отсчет), выдавливают микродозу Vj в цитоплазму после чего вынимают кончик микропипетки из объекта, а кран ставят в положение атмосфера

31

1

V,,.K

6(75/

где р - давление, соответствующее остановке меНиска при определении конусности. (Эта формула выводится из формулы объема усеченного конуса) Объем усеченного конуса с основаниями 2 2Е2(фиг. 5)

Va ( +R +R),

но

R - R - 2 , 1 - р «а- Pj Подставляя эти значения в формулу для V2, решая уравнение относительнс Р , получим

При мер . Инъецировалась доза 30 мкм воды в воду из микропипетки С внутренним диаметром кончика 0,5 мкм. Коэффициент поверхностюго натяжения брался для воды 75 дин/см. Высота Н (фиг. 5) замерялась окуляр-микрометром МОВ-15,

установленн.ым на микроскоп БИОЛАМ 70Рб.

Результаты опыта представлены в табл. 2. После введения кончика микропипетки в микрообъект редуктором 17 н манометре 19 при положении крана. 14 отсчет устанавливалось давление 1,45 атм, которое одновременно подавалось в микропипетку,благодаря чему выдавливалась заданная доза 30 мкм. Устройство обеспечивает: замер да пений Р и Pj с точностью до 0,012 ат следовательно отсчет дозы производится также с высокой точнос -тью, ибо точность отсчета дозы определяется,точностью замера давле НИИ Pg .. Этот способ.отсчета микродозы об печивает высокую точность дозирования, отмечается простотой осуществления в производстве и значительно повьошает производительность труда исследования (до 20 инъекций в 1 ч) Формула изобретения 1. Способ отсчета микродозы при прецизионной микроинъекции водного раствора в микрообъект пневматическим давлением, включающим заполнение конического кончика микропипетки вод ным раствором, введениеего под давлением, определение величины микродозы как объема конуса, о т л и ч аю щ и и с я тем, что, с целью„повышения точности отсчета микродозы, после заполнения конической части кончика микропипетки инъецируемым раствором, повышают давление воздуха до величины, соответствующей на;чалу перемещения мениска в направлении к кончику микропипетки,рассчитывают конусность внутренней поверхности кончика микропипетки К по зависимости : коэффициент поверхностного где Л натяжения на границе инъеци руемый раствор - собственны давление, соответствующее н чалу перемещения мениска инъецируемого раствора в ко ническом острие микропйпетки ;

Та б л и, ц а Т Н - высота рт мениска до кончика острия микропипетки; атем рассчитывают давление Pj( , соответствующее останову мениска в момент, когда в кончике микропйпетки останется заданная величина микродозы V после приложения этого давления, по формуле .: IvKIl , 2,1-2,i-K и, подав это давление внутрь NOIKPOпипетки, вытесняют избыток инъецируемого раствора из микропипетки, после Чего вводят ее в микрообъект 1и подают внутрь микропйпетки давление. РЗ , определяемое по зависимости Р г. . где г - радиус выходного отв ерстия конического острия микропипетки.2. Способ по п; 1, от Л И Ч ающ и и с я тем, что, с целью сннже- . ния рабочих давлений при микроинъекции, после определения конусности К рассчитывают давление воздуха Pj, подаваемого в микропипетку/соответствующее заданному объему микродозы Vj по формуле; вводят водный раствор в микрообъект под давлением воздуха Pg 3. Устройство осуществления способа по пп. 1 и 2, содержащее itoKpoпипетку пневматический кран для подачи и снятия давления, манометр . для замера внешнего давления, регулятор внешнего давления, микроскоп с окуляр-микрометром, отличающ е е с я тем, что оно снабжено редуктором давления, связанным с выходом регулятора .внешнего давления, а кран Для подачи и снятия давления выполнен трехпозиционным, причем его дополнительный вход соединен посредством пневмопровода, снабжен