Способ электрофореза вСВОбОдНОМ пОТОКЕ CO СМЕщЕНиЕМи уСТРОйСТВО для ОСущЕСТВлЕНияэТОгО СпОСОбА Советский патент 1981 года по МПК G01N27/26 

(54) СПОСОБ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В СВОБОДНОМ ПОТОКЕ СО СМЕЩЕНИЕМ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО

I

Изобретение относится к технике разделения частиц, отличающихся по электрофоретической подвижности, и может быть использовано дпя разделения биологических смесей.

Известен способ электрофореза в свободном потоке, заключающийся в том, что текущий слой буфера, ограниченный двумя параллельными плоскостями, с введенной в него струей разделяемой смеси подвергают воздействию постоянного электрического поля. Серповидное искажение полосы фракций, обусловленное параболическим профилем скорости вязкого течения слоя буфе- j, pa и профилем электроосмотической скорости в слое буфера, компенсируют подбором дзета-потешшала двух параллельных плоскостей, ограничивающих слой буфера..20

Устройство для осуществления дан- . ного способа содерзкит проточную прямоугольную камеру разделения, проточные злектродные отделения с злектроОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

дами, изолированными от камеры разделения полупроницаемыми мембранами, инжектор для ввода разделяемой смеси, коллектор фракций и источник постоянного электрического напряже/ния tl.

Однако этот способ не обеспечивает быстрой компенсации серповидного искажения дпя каяодой фракции, так как для этого требуется подбор и смена дзета-потенциала плоскостей, ограничивающих слой, дпя получения максимального разрешения только одной фракции.

Известен также способ электрофореза в свободном потоке со смещением заключающийся в том, что текущий спой буфера, ограниченный двумя параллельными плоскостями, с введенной в него струей разделяемой смеси подвергают воздействию постоянного электрического поля. Добавкой в слой буфера электролита, содержащего многовалентн 1е ионы, например, бария, лантана или тория, изменяют электропроводность слоя, создавая тем самым температурный градиент пе толщине слоя буфера. Изменение параболического профиля скорости течения вследствие температурного градиента компенсирует серповидное искажение полосы фракций, обусловленное параболическим профилем скорости вязкого течения слоя и профилем злектроосмотической скорости в слое буфера. Устройство для осуществления известного способа содержит проточную камеру разделения, проточные электродные отделения с электродами, изолированными от камеры разделения полупроницаемыми мембранами, инжектор для ввода разделяемой смеси, коллект фракций, источник постоянного электр ческого напряжения, блок оптического сканирования фракций в камере разделения, блок фотоприемника и блок регистрации кривой распределения фракций :2. Недостатком указанного способа яв ляется малая разрешающая способность так как введение в слой буфера добавок электролита, содержащего многова лентные ионы, приводит, во-первых, к уменьшению электрофоторетической подвижности частиц разделяемой смеси, во-вторых, к коагуляции частиц, обусловленной многовалентны ионами добавок, и в-третьих, к уменьшению устойчивости потока слоя буфера к тепловой конвекции, обусловленной установлением температурного градиента по толщине слоя.

Цель изобретения - повьщ1ение разрешающей способности электрофореза в свободном потоке.

Указанная цель достигается тем, что в известном способе, включающем воздействие на слой текущего буферного раствора с введенной в него струей

разделяемой, смеси постоянного электрического поля, перпендикулярного направлению потока, и сканирование в видимой или ультрафиолетовой области спектра полосы фракций, на кривой распределения фракций выбирают пик отдельной фракции, в слое пористой среды с буферным раствором с помощью дополнительного постоянного электрического поля или однополярных импульсов электрического поля создают замкнутый через текущий слой буфера электроосмотический поток, перпендикулярпроточные электродные отделения с электроде1ми, изолированными от камеры разделения полупроницаемыми мембранами, инжектор для ввода разеляемой смеси, коллектор фракций, источник постоянного электрического напряжения, блок оптического сканирования фракций в камере разделения, блок фотоприемиика, блок регистрации

кривой распределения фракгщй, камера разделения снабжена емкостью с порис той мембраной, емкость соединена с торцами камеры и содержит вспомогательные электродные отделения с электисточником постоянного электрического напряжения или с источником одиополярных импульсов напряжения, причем пористая мембрана состоит из актив50 иой части, расположенной между вспомогательными электродами, и пассивных частей, расположенных меящу вспомогательными электродами и электродами камеры раздепения. Кроме того, вспомогательные электроды расположены параллельно электродам камеры и отделены от пористой мембраны полупроницаемыми мембранами. 64 ный направлению потока буфера, и регулируют направление и эффективную напряженность дополнительного электрического поля до получения минимального перекрытия пика выбранной фракции с соседними пиками других фракций. Для осуществления предлагаемого способа используют обычные для электрофореэа в свободном потоке параметры; стандартный буфер с удельной электропроводностью 5 I б - 8 I О см , скорость потока буфера 0,4-1 см/с, толщина слоя 0,5-1 мм, диаметр вводимой в слой струи смеси 0,1-0,5 мм, напряженность электрического поля в слое буфера 40-100 В/см, В качестве пористой среды используют слой толщиной мм, изготовленный спеканием порошка материала с размерами частиц 50-100 мкм и дзета-потенциалом 40-100 мВ, например стекла, Эффектиь кую величину тока, протекающего в пористой среде, заполненной буферным раствором, регулируют в пределах 30-120 мА. Разделение и анализ смесей проводят при 4-20 С, Указанная цель достигается также тем, что в известном устройстве, созо держащем проточную камеру разделения, 45 родами, соединенными с отдельным На фиг, I изображено предпагаемое устройство, общий вид; на фиг..2 разрез А-А на фиг.; на фиг. 3 - про фили электроосмотического и гидродинамического потоков жидкости через камеру разделения; на фчг. 4 - резул таты расчета- на ЭВМ. Устройство содержит прямоугольную проточную камеру I разделения с рабо чим зазором 2 между двумя плоскопараллелышми стенками 3 из диэлектрического материала, два электродных отделения 4, изолированных от камеры I полупроницаемыми мембранами 5 электроды 6 соединенные с источником 7 постоянного напряжения, инжектор 8 для ввода струи разделяемой см си частиц и коллектор 9 для отбора фра ций в пробирки 10. В нижней части камеры установлены блок 11 оптическо го сканирования и блок 12 фотоприемника, соединенный с блоком 13 регист рации кривой распределения фракций. Через боковые каналы 14 к камере 1 присоединена прямоугольная емкость 1 с пористой мембраной 6. Емкость 15 содеряит дба электродных отделения 1 изолированных от пористой мембра) полупроницаемыми мембранами 18, и электроды 19, параллельные электродам 6t Электроды 19 присоединены к отдель ному источнику 20 постоянного напряже ния (источнику однополярных импульсо напряжения). Сосуд 21 служит для пода чи буфера в камеру разделения. Устройство работает следующим образом. Заполняют камеру Г р11зделения и емкость 15 с пористой мембраной 16 через каналы 14 буфером и непрерывно подают буфер из сосуда 21 в рабочий, зазор 2 камеры 1 разделения. Из инжектора 8 вводят в камеру струю смеси частиц и подают на электроды 6 постоянное напряжение от источника 7. В камере 1 разделения устаиавтгт вается-однородное электрическое попе, направленное поперек потока буфеда. Под действием поля переносимая потоком струя смеси частиц разделяется на ряд фракций, различающихся по электро форетической подвижности (ЭФП). Фракции отводят через коллектор 9 и пробирки 10 и одновременно сканируют в камере разделения в видимой или ультрафиолетовой области спектра блоком 11. Прошедший через камеру световой поток преобразуют блоком-12 фотоприемника в электрический сигнал, который усиливают и отображают в виде кривой распределения фракций блоком 13 регистрации. Ламинарный поток слоя буфера через камеру I имеет параболический профиль ДЕР (фиг.З), вследствие чего частицы отдельных фракций, находящиеся на разном расстоянии от стенок камеры I, движутся с различными скоростями и отклоняются в электрическом поле на разные углы. Начальный профиль Л отдельной фракции трансформируется в конце камеры в профиль f , вершина кота- . рого направлена к катоду ( дпя отрицательно заряженных частиц), и на кривой распределения пик отдельной фракции имеет вид В (фиг. За). Под действием электрического поля в слое буфера возникает также направленный вдоль поля электроосмотический поток (профиль ABC на фиг. 3 который в центре зазора камеры 1 и у стенок имеет взаимно противоположное направление, вследствие чего исходный профиль Об фракции транспортируется в конце камеры в профиль |Ь (фиг.35 ), вершина которого направлена к аноду .(для отрицательно заряженных частиц), и на кривой распределения пик отдельной фракции имеет вид В (фиг.Зб). Одновременное действие этих потоков приводит к результируищим профилям Г (фиг. ЗЬ), которыми и обусловливается наблюдаемое серповидное искажение полос фракций, вследствие чего прсжсходит перекрывание соседних фракций и на кривой распределения отдельные фракции отображаются в виде ассимет- ричных пиков ВВ (фиг. ЗЬ), пологая часть которых направлена к аноду или катоду в зависимости от соотношения величин скорости потока буфера, скорости электроосмотического переноса электрофоретической скорости частиц. На электроды 19 подают постоянное напряжение (или однополярные импульсы напряжения) от отдельного источника 20. В активной части пористой ембраны 16 мезццу электродами 19 возникает электроосмотический поток, пропорциональный величинам эффективиой апряженности электрического поля и зета-потенциала материала пористой ембраны. Этот поток посредством боовых каналов 14 замыкается через раочий зазор 2 камеры 1 и создает в ей поперечный ламинарный поток буфеpa KLM {фиг.З), который трансформирует серповидные профили Г (фиг.ЗЬ ) соседних фракций, перемещая их в нап равлении, противоположном электроосмотическому движению частиц. Направление и величину эффективной напряженности электрического поля в порис той мембране 16 регулируют до достижения минимального перекрытия соседних фракций на кривой распределения, наблюдаемой на блоке 13 регистрации, что соответствует максимальному разрешению двух соседних фракций. Для отдельной фракции этот момент соот- ветствует полной симметрии пика фрак ций на кривой распределения. Часть п ристой мембраны между электродами 19 используют в качестве активной электроосмотической мембраны, которая участвует в активном переносе буфера, а другие части, соединенные с боковыми каналами 14, применяют дл уменьшения взаимного влияния источ - НИКОВ 7 и 20. Для получения равномер ного электроосмотического потока по всей длине мембраны электроды 19 устанавливаются параллельно электродам 6. Электроды 19 отделены от пористой мембраны полупроницаемыми мембранами, для того чтобы исключить попадание продуктов электролиза в ка меру разделения, Пример . С помощью ЭВМ проводят модельный эксперимент по разде лению электрофорезом в свободном потоке со смещением, смеси двух отрицательно заряженных фракций с электрофор етическими подвижностями . 2 мкмСм/В с и 2,1 мкм«см/В«с при толщине слоя буфера 0,08 см, исходном диаметре йтруи смеси 0,04 см, напряженности электрического поля 50 В/см времени разделения 100 с, удельной электропроводности буфера 9Ш Электроосмотический перенос в пористой среде и на границах слоя принима ют равным 4 , что соответствует дзета-потенциалу 60 мВ при удельной электропроводности буфера 9 Ш Ом1см если пористая среда и плоскости, ограничивающие слой буфер выполнены из стекла, имеющего отри,цательный заряд. При наложении элект рического поля на слой буфера полосы фракций в нижней части слоя буфера отклоняются к аноду и принимают форму серпов А (фиг.4) где на оси абцис смещение фракций, а по оси ординат зменение смещения фракций по толщине слоя буфера. Расстояние между фракциями составляет 0,22 см, что достаточно дпя отбора фракций из слоя буфера, но серповидное искажение приводит к перекрыванию полос фракций и уменьшению разрешения. Исходные профили серпов А рассчитывают по формулам, аналогичным приведенным в известных устройствах. Электрофоретическое смещение частиц в слое буфера имеет вид I EU..(4-i)lm () . V -f-t-krd где ,33 XE.d - температурный коэффициент;X - удельная электропроводность буфера; Ug - электрофоретическая подвижность частицы;Е - напряженность электрического поля в слое буфера; t - среднее время нахолздения час-тцы в поле. Смвцение частицы в слое буфера, обусловленное электроосмотическим переносом (профиль ABC на фиг. 3), имеет вид 3.. ,./. AZ .. 1 (2) ) где EUp - скорость электроосмотического переноса жидкости около стенки слоя. Смещение частицы под действием вертикального гидродинамического потока (профиль DEF на фиг. 3) имеет вид 7-412 d Смещение частицы в поперечном потоке буфера в слое за времяl обусловленное электроосмотическим переносом в пористой среде, имеет вид J / -It. , средняя линейная скорость поперечного потока буфера в слое. Смещение частицы приведено для частного случая, когда электроосмотический перенос в пористой среде, замкнутый через слой буфера, осуществляют по .всей длине слоя, где проводят разделение. Тогда полное смеще1дае части1и,1 имеет вид и после ряда преобразований получим 6.. г-п- А Ь U)m i. . ..1 ,e(z)fVeEV()4 nr|EUe m x EU t ()S4N-Az/d .н.ц; , где e горизонтальное смещение частицы в электрическом поле. где V - объемная скорость электроосмотического переноса; S - поперечное сечение слоя буфе кгг х (7) где 3 - ток, протекающий в пористой среде; дзета-потенциал пористой среды; - вязкость среды; - диэлектрическая постоянная среда. При этом электроосмотический перенос замыкается через слой буфера в направлении от анода к катоду и смещает полосы фракций А в направлении, проти воположном электрофоретическому отклонению, и трансформирует профиль полос при постепенном увеличении напряженности дополнительного электричес кого поля (профили В, C,D, Ё на фиг.4 Полная компенсация искажеиия полос

фракций с исходным диаметром 0,04 см .соответствует профилям D . Величина тока в пористой среде при этом составляет 60 мА, а линейная скорость в слое буфера, обусловленная электроосмотическим переносом, - 0,015 см/с. При проведении модельного эксперимента величину тока в пористой среде изменяют в пределах 20-80 мА.

Предлагаемый способ позволяет повысить разрешающую способность электрофреза в свободном потоке не менее чем в 2 раза по сравнению с известным. Кроме того, предлагаемый способ имеет возможность быстрой перестройки от получения максимальной разрешающей способности одной смеси частиц к другой простым изменением напряженности дополнительного электрического поля. Использование предлагаемого способа дает также возможность создания автоматизированных

ПОСТОЯННОГО электрического напряжения, соединенный с электродами, блок оптического сканирования фракций в камере разделения, блок фотоприемии0ка, блок регистрации кривой распределения фракций, отличаю щее с я тем, что проточная камера разделения снабжена емкостью с пористой мембраной, емкость соединена с торца5ми камеры разделения и содержит вспомогательные электродные отделения с электродами, соединенными с отдельным регулируемым источником постоянного напряжения или с источником однополяр0ных импульсов напряжения, причем пористая мембрана состоит из активной части, расположенной между вспомогательными элeктpoдa 0f, и пассивных частей, расположенных между электро5дами камеры разделения и вспомогательными электродами.

3. Устр(йство по и.2, отличающееся тем, что вспомогаустройств разделения, управляемых с помощью ЭВМ. Формула изобретения L. Способ электрофореза в свободном потоке со смещением,включающий воздействие на слой текущего буферного раствора с введеной в него струей разделяемой смеси постоянного эйектрического поля, перпендикулярного направлению потока, и сканирование в видимой или ультрафиолетовой области спектра, отличающийся тем, что, с целью повышения разрешающей способности, в слое пористой среды с буферным раствором с помощью дополнительного постоянного электрического поля или однополярных импульсов электрического поля создают замкнутый через текущий слой буфера электроосмотический поток, перпендикулярный направлению потока буфера, и регулируют направление и эффективную напряженность дополнительного электрического поля до получения минимального перекрытия двух соседних фракций. 2. Устройство для осуществления способа по П.1, содержащее проточную камеру разделения, проточные электродные отделения с электродами, изолированными от камеры разделения полупроницаемыми мембранами, инжектор дпя ввода разделяемой смеси в проточную камеру, коллектор фракций, источник

тельные электроды расположены параллельно электродам камеры разделения. 4. Устройство по п.2, о т л и чающе еся тем, что вспомогательные электроды отделены от пористой мембраны полупрО1шцаемыми мембранами.

Источшио информации у принятые во внимание при экспертизе

l.Sthrichler А., Sacks Т.-Annals of the New Jork Academy of ScFenceV 1973, 209, p. 497-514.

2. Патент ФРГ 2508844, 1976 (прототип).

Jh