СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСНЕЙТРАЛИЗУЮЩИХ АНТИТЕЛ ПРИ ВИРУСНОЙ ДИАРЕЕ - БОЛЕЗНИ СЛИЗИСТЫХ ОБОЛОЧЕК КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Российский патент 2005 года по МПК C12N5/00 A61K39/00 

Изобретение относится к ветеринарии, а именно к ветеринарной вирусологии, и может быть использовано в лабораторной практике для серологической диагностики инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных, в частности для выявления вируснейтрализующих антител к вирусу вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота (ВД КРС).

До настоящего времени основным способом диагностики ВД КРС является длительная процедура, основанная на постановке реакции нейтрализации в первично трипсинизированных культурах клеток макрометодом.

Сущность метода заключается в специфическом действии нейтрализующих антител сыворотки крови подавлять способность вируса вызывать цитопатическое действие в культуре клеток.

Ее проводят в первично трипсинизированных культурах клеток ПЭК (почка эмбриона коровы) или ТБ (тестикулы бычка) по общепринятой методике. В качестве ростовой добавки для культуры клеток используется сыворотка крупного рогатого скота в количестве 10%. Культуры клеток получаются путем трипсинизации органов телят (почки, тестикулы).

Компоненты реакции: исследуемые пробы сыворотки, питательная среда и вирус используются в объеме не менее 1 мл. Реакция ставится макрометодом в биологических пробирках объемом 15 см³. В качестве рабочей дозы используют 100-400 ТЦД₅₀/_мл вируса. Рабочее разведение вируса и испытуемых проб сыворотки смешивают непосредственно перед реакцией, и после инкубации в течение одного часа вносят в сформировавшийся монослой культуры клеток.

Результаты реакции учитываются на 5-7 дни по мере наступления цитопатического действия вируса в контрольных пробирках (Сюрин В.Н. и др. Диагностика вирусных болезней животных: Справочник. - М.: Агропромиздат, 1991. - 528 с).

К недостаткам данного способа относятся:

1. Возможность контаминации нормальной сыворотки и первично трипсинизированных культур клеток КРС антителами к вирусу, а также самим вирусом (цитопатогенными и нецитопатогенными вариантами), что искажает результаты реакции и требует поиска серонегативных к вирусу животных-доноров.

2. Использование длительной и трудоемкой процедуры трипсинизации полученных внутренних органов животных.

3. Наличие гетерогенной популяции клеток в первично трипсинизированных культурах клеток.

4. Наличие больших объемов компонентов реакции и длительность постановки и учета.

5. Использование большого количества пробирок, особенно при массовых серологических исследованиях.

Наиболее близким решением, принятым за прототип, и наиболее близким к заявляемому по технической сущности и достигаемому эффекту, является следующий способ ретроспективной серологической диагностики ВД КРС (Dirk Deregt, Siv Smithson and Gerry C. Kozub. A short Incubation Serum Neutralization Test for Bovine Viral Diarrhea Virus// Can. J. Vet. Res. - 1992. - 56. - 161-164).

Способ включает использование первично трипсинизированной культуры клеток почки эмбриона коровы (ПЭК), полученной из свободного от ВД стада, и 10% сыворотки крови от телят также из свободного от ВД стада. Реакция проводится микрометодом в пластиковых платах.

Учет проводится через 5 дней. Рабочая доза вируса составляет 100 ТЦД_{50/0,1 мл}.

К недостаткам данного способа относится необходимость поиска серонегативного в отношении ВД КРС стада, получение первично трипсинизированной культуры клеток и длительность учета реакции (5 дней).

Технической задачей изобретения является постановка реакции в микропланшетах, замена первично трипсинизированной культуры клеток на перевиваемую, сыворотки крови теленка на сыворотку крови лошади, изменение объема сыворотки крови лошади (до 5%) при культивировании культуры клеток и сокращение сроков учета реакции до 3 дней.

Сущность изобретения заключается в том, что в известном способе выявления вируснейтрализующих антител к вирусу ВД КРС, согласно изобретению, реакцию нейтрализации проводят микрометодом с использованием перевиваемой линии культуры клеток КСТ (коронарные сосуды эмбриона коровы).

Сущность изобретения заключается также в том, что культуру клеток КСТ выращивают в питательной среде Игла MEM с 20 мг/мл канамицина и 10% сыворотки крови лошади.

Сущность изобретения заключается также в том, что реакцию проводят в микропланшетах для культур клеток.

Сущность изобретения заключается также в том, что после инкубации равных объемов (0,05 мл) двукратных разведений исследуемой сыворотки животных и 100 ТЦЦ_{50/0,1 мл} вируса при 37°С в СО₂-инкубаторе добавляют 0,1 мл суспензии культуры клеток КСТ в концентрации клеток 3,5×10⁵ в питательной среде Игла MEM, содержащей 20 мг/мл канамицина и 5% (2,5% конечная концентрация) сыворотки крови лошади соответственно.

Сущность изобретения заключается также в том, что учет реакции проводят через 3 дня.

Учет реакции проводят по мере наступления цитопатогенного действия (ЦПД) вируса в контрольных лунках, содержащих рабочую дозу вируса - 100 ТЦД_{50/0,1 мл}. Высшее разведение сыворотки, полностью нейтрализующее ЦПД вируса в 50% инфицированных лунок, принимается за титр сыворотки. В реакции используются контроли: отрицательный контроль - сыворотки от неинфицированного КРС. Положительный - гипериммунная моноспецифическая сыворотка кролика.

Сущность технического решения раскрыта в примерах конкретного осуществления способа.

Пример 1. Выращивание перевиваемой линии культуры клеток КСТ.

Культуру клеток КСТ выращивают в культуральных матрасах емкостью 25 см³ в питательной среде Игла MEM. Для этого суспензию клеток, ресуспендированных в среде Игла MEM, в концентрации 1,2×10⁵ в объеме 5 мл вносят в одноразовый матрас. В качестве ростостимулирующей добавки в суспензию клеток вносят 0,5 мл сыворотки крови лошади. Смесь перемешивают и помещают в условия термостата при 37°С на 48 часов. По мере формирования монослоя клеток в матрас вносят 5 мл питательной среды Игла MEM без сыворотки крови лошади и инкубируют в течение 3-5 суток до момента постановки реакции нейтрализации.

Пример 2. Подготовка исследуемых проб сыворотки крови от животных.

Исследуемые пробы сыворотки крови от больных животных прогревают на водяной бане в течение 30 минут при 56°С. После этого готовят двукратные разведения проб сыворотки крови от 1:2 до 1:1024 на питательной среде Игла MEM и необходимый объем вируса, содержащего 100 ТЦД_{50/0,1 мл}.

После этого равные объемы двукратных разведений испытуемых проб сыворотки крови животных и 100 ТЦД_{50/0,1 мл} по 0,05 мл смешивают в лунках микропланшета и инкубируют в течение 1 часа при 37°С в условиях СО₂-инкубатора.

Пример 3. Подготовка суспензии культуры клеток.

Культуру клеток КСТ, выращенную в пластиковых матрасах емкостью 25 см³ снимают со стекла при помощи смеси трипсина и версена в соотношении 1:9. Клетки ресуспендируют в питательной среде Игла MEM, содержащей 20 мг/мл канамицина, до концентрации 3,5×10⁵ клеток в 1 мл и добавляют сыворотку крови лошади в объеме 5% к объему суспензии клеток (конечная концентрация 2,5%).

Пример 4. Добавление суспензии культуры клеток в микропланшеты.

По окончании времени инкубации разведений испытуемых сывороток и вируса в каждую лунку микропланшета вносят по 0,1 мл суспензии клеток. Микропланшеты закрывают крышкой и инкубируют в условиях СO₂-инкубатора в течение 3 дней.

Пример 5. Учет реакции.

Реакцию учитывают через три дня после внесения суспензии культуры клеток по мере развития цитопатического действия вируса в контрольных лунках, не содержащих исследуемые сыворотки. Титром сыворотки считают предельное ее разведение, тормозящее развитие цитопатического действия вируса в 50% зараженных лунок с культурой клеток. Положительной считается сыворотка, нейтрализующая 100 ТЦД_{50/0,1 мл} в разведении 1:2.

Ретроспективный диагноз на ВД КРС ставят при четырехкратном и более приросте титров вируснейтрализующих антител в парных пробах сыворотки крови животных, взятых с интервалом в 3-4 недели.

Пример 6. Сравнительное изучение эффективности стандартной методики постановки РН в пробирочной культуре клеток и заявляемой.

Таблица 1
Сравнительная эффективность двух вариантов реакции нейтрализацииИсследовано пробвыявлено положительных /%Соотношение стандартный/ модифицированный метод, %Достоверность (Р)стандартный методмодифицированный метод400241/60,3289/72,383,0<0,05

Из данных таблицы 1 видно, что заявляемый тест выявляет на 12% больше положительных проб, что говорит о его более высокой чувствительности.

Пример 7. Сравнительное изучение величин и разброса титров вируснейтрализующих антител, выявляемых в пробах сыворотки крови крупного рогатого скота при помощи двух методик постановки реакции.

Таблица 2.

Величина и разброс титров вируснейтрализующих антител в пробах сыворотки крови КРС, исследованных двумя вариантами реакции нейтрализации

N=400

Тестстандартный метод (кол-во/%)заявляемый метод (кол-во/%)123123Отриц(<1:2)159/39,8111/27,31:2-1:16200/50,0223/55,81:32-1:25641/10,363/15,8>1:5120/03/0,75

Из данных таблицы 2 видно, что заявляемый метод постановки РН выявил на 12,5% меньше отрицательно реагирующих животных, чем стандартный.

Частота встречаемости величин титров 1:2-1:16 была у заявляемого теста на 5,8% выше, чем у стандартного, а 1:32-1:256 выше на 5,5%. Титры антител 1:512 и выше в стандартном тесте не выявлялись, а заявляемый выявил трех животных, что составило 0,75%.

Таким образом, заявляемый способ позволяет выявлять большее количество положительных проб сыворотки крови исследуемых животных в более короткие сроки в сравнении со стандартным методом постановки реакции нейтрализации.

Заявляемый метод выявляет вируснейтрализующие антитела в более высоких титрах в сравнении со стандартным методом, а количество отрицательно реагирующих животных меньше.

Время исследования 100 проб сыворотки составляет 3 дня.

По срокам постановки диагноза модифицированный метод превосходит стандартный в 2 раза. Стоимость исследования одной пробы при помощи заявляемого метода составляет 86 рублей, при помощи стандартного - 165 рублей, что в 1,9 раза снижает затраты на проведение диагностических исследований.

Способ обеспечивает достижение цели изобретения: за счет повышения эффективности выявления вируснейтрализующих антител к вирусу ВД КРС выявляется большее количество положительно реагирующих животных.

Изобретение относится к области ветеринарии, а именно к способам серологической диагностики инфекционных заболеваний крупного рогатого скота, в частности вирусной диареи - болезни слизистых (ВД КРС), а также оценке напряженности иммунитета у вакцинированных животных. Сущность изобретения состоит в том, что разработан способ, включающий выращивание перевиваемой линии культуры клеток КСТ (коронарные сосуды эмбриона коровы) в питательной среде Игла MEM с 20 мг/мл канамицина и 10% лошадиной сыворотки. Двукратные разведения инактивированных испытуемых проб сыворотки от животных (56°С, 30 минут) смешивают в равном объеме (0,05 мл) со 100 ТЦД_50/0,1мл вируса и инкубируют 1 час при 37°С в CO₂ инкубаторе. По окончании инкубации добавляют 0,1 мл суспензии культуры клеток КСТ в питательной среде Игла MEM, содержащей 20 мг/мл канамицина и 5% (2,5% конечная концентрация) лошадиной сыворотки. Концентрация клеток в культуре составляет 3,5×10⁵. Учет реакции проводят через 3 дня по мере наступления цитопатогенного действия вируса в контрольных лунках, содержащих рабочую дозу вируса. Технический результат - расширение арсенала диагностических иммунологических способов для ветеринарных целей. 1 з.п.ф-лы, 2 табл.

1. Способ выявления вируснейтрализующих антител при вирусной диарее слизистых оболочек крупного рогатого скота, включающий реакцию нейтрализации антителами сыворотки крови животного цитотоксического действия вируса в культуре клеток, отличающийся тем, что реакцию проводят микрометодом с использованием перевиваемой линии культуры клеток коронарных сосудов эмбриона коровы (КСТ)), предварительно выращенной в питательной среде Игла MEM с 20 мг/мл канамицина и 10% сыворотки крови лошади, при этом инкубируют исследуемую сыворотку животных и 100 ТЦЦ 50/0,1 мл вируса при 37°С СО₂-инкубаторе, добавляют 0,1 мл суспензии культуры клеток КСТ в концентрации 3,5×10 в питательной среде Игла, содержащей 20 мг/мл канамицина и 5% (2,5% конечная концентрация) сыворотки крови лошади соответственно, а учет реакции проводят через 3 дня.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что реакцию проводят в микропланшетах для культур клеток.