СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ МЕТАСТАЗОВ В ПЕЧЕНИ Российский патент 1995 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к медицине, точнее к методам биохимических исследований, и может быть использовано в онкологии.

Известен способ диагностики поражений печени, основанный на определении в сыворотке крови активности гамма-глутамилтрансферазы ( γ-ГТ), позволяющий определять различные формы патологии органа.

Однако использование известного способа для дифференциальной диагностики метастазов в печени невозможно, т.к. повышение активности γ -ГТ в сыворотке крови выявляется при поражениях печени различной этиологии - холангитах, активных формах цирроза, гепатите.

Известен способ дифференциальной диагностики метастатических поражений печени, заключающийся в определении в сыворотке крови методом электрофореза печеночного изоэнзима щелочной фосфатазы (ЩФ - ее α-фракции) Viot M., Joulin K, et al. ). Значение выявления - изофермента щелочной фосфатазы в сыворотке крови для диагностики печеночных метастазов.

Однако и этот способ дифференциальной диагностики не может быть использован для выявления метастазов в печени, т.к. во-первых, выявляет появление α₁ -изоформы ШФ при различных патологических процессах в печени, во-вторых, дает отсутствие α₁-изоформы ШФ при верифицированных другими способами метастазах опухоли в печени, в-третьих, предполагает использование токсичных веществ и дорогих металлов, и, в-четвертых, осложняется необходимостью проведения дополнительного электрофореза белковых фракций, т.к. у разных людей фракции ШФ расположены по-разному.

Для осуществления метода на стеклянные пластины наносят полосы ацетат целлюлозы. Пластины помещают в горизонтальном положении в аппарат для электрофореза для насыщения буфером. В электродных сосудах используется веронал-мединаловый буфер 0,05 М, pН 8.4. Сыворотку крови больного наносят на пластину с помощью микропипетки. Затем включают источник питания и проводят форез 1-2 ч. После электрофоретического разделения образцы переносят в кювету из органического стекла и заливают субстратом, подогретым до 37^oС, рН 9,4. Состав субстратного раствора: а) бидистиллированная вода; б) 0,2 М трис; в) 10%-ный раствор глицерофосфата натрия; г) 0,09 М р-р Ca(NO₃)₂; д) 0,5 М р-р Mg(NO₃)₂. Инкубируют образцы в течение 60 мин при 37^оС. Затем вынимают пластины из субстрата и обрабатывают в четырех сменах раствора аммиака по 15 мин. После этого образцы выдерживают на свету в 0,5%-ном растворе нитрата серебра до появления коричнево-черных полос, соответствующих локализации фермента. Одновременно в аналогичных условиях опыта на отдельной пластине проводят форез белков той же сыворотки крови. Образцы для разделения белковых фракций фиксируют в 5%-ном растворе уксусной кислоты и 70%-ном этиловом спирте. Затем высушивают в течение 30 мин в растворе амидо-черного. Обесцвечивание фона проводится в 2,5%-ном растворе глицерина, приготовленного на 2% -ной уксусной кислоте. После описанных манипуляций изучаемые образцы сканируют на денситометре.

Описываемым методом установлено, что α₁ -изофермент ШФ отсутствует в сыворотке крови здоровых лиц. При верифицированных метастазах рака в печени α₁-изофермент обнаруживается в 60% случаев. Вместе с тем, в группе больных с вирусным гепатитом α₁-изоформа выявляется в 27% случаев, в группе больных с циррозами и у лиц, перенесших гепатит, - в 15%.

Цель - повышение точности способа.

Поставленная цель достигается тем, что к сыворотке крови больных добавляют гомогенат печени здоровой крысы, отмывая печень от крови физиологическим раствором, приготавливая из нее 10% гомогенат на 5 мМ Na-фосфатном буфере с тритоном Х-100, рН 7,2. Затем инкубируют 1 мл гомогената печени с 0,1 мл испытываемой крови в течение 60 мин при 37^оС.

Таким образом, предлагаемый способ, в отличие от известных способов, предусматривает инкубацию гомогената печени здоровой крысы с сывороткой крови больных и определение активности γ -ГТ.

Способ осуществляется следующим образом.

Печень здоровой крысы отмывают от крови физиологическим раствором, готовят из нее 10%-ный гомогенат на 5 мМ Na-фосфатном буфере с 0,1%-ным тритоном Х-100, рН 7,2. Затем 1 мл гомогената инкубируют с 0,1 мл испытуемой сыворотки крови больного в течение 60 мин при 37^оС.

Активность γ -ГТ в инкубированной среде (0,025 мл) определяют унифицированным методом с использованием наборов реактивов Био-Лахема-тест, поставщиц а/о Хемапол, Права, Чехословакия. Контролем служит гомогенат печени крысы. Активность γ-ГТ выражают в условных единицах на 1 л инкубированной среды, означающих количество мП п-нитроанилина, освобожденного из субстрата под действием фермента за 1 мин при 37^оС. Увеличение активности гамма-глутамилтрансферазы в 2 и более раз в инкубированной среде (гомогенат печени + сыворотка крови) по сравнению с контролем (гомогенат печени) достоверно свидетельствует о наличии метастазов рака в печени.

Предлагаемым способом было проведено исследование у 114 больных, из них: 31 человек - с верифицированными метастазами в печени, 54 человек - онколольные без метастазов в печени и с доброкачественными опухолями, 21 человек - с острыми гепатитами А и В и хроническим холециститом, 8 - человек с активными циррозами печени.

Данные изменения активности γ -ГТ в исследуемых группах больных приведены в табл.1.

Как видно из таблицы, активность γ -ГТ в системе гомогенат печени + сыворотка крови у больных с верифицированными метастазами в печени в среднем в 7 раз - от 2 до 10 раз превышает активность фермента в гомогенате печени, используемого в качестве контроля. Активность γ -ГТ, определенная с помощью предлагаемого метода, у больных с другими нозологическими формами поражения печени, либо равнялась активности фермента в контрольной пробе, либо была ниже ее. Таким образом, повышение активности γ -ГТ в системе сыворотка крови + гомогенат печени в 2 и более раз по сравнению с контролем является доказательством наличия метастазов в печени. У всех обследованных больных результат анализа, проведенный предлагаемым способом совпадал с клиническим диагнозом.

В табл. 2 приведены данные статистической обработки получаемых результатов.

П р и м е р 1. Больной М. 37 лет и. б. N 13977/р, поступил в отделение химиогормонотерапии Ростовского научно-исследовательского онкологического института (РНИОИ) 04.01.87 с диагнозом лимфогранулематоз, метастазы в печени под вопросом, 09.01.87 г. у больного была определена активность γ -ГТ предлагаемым способом. Для этого у больного натощак был произведен забор крови в количестве 2 мл. После центрифугирования крови отбирали сыворотку 0,1 мл сыворотки крови инкубировали с 1 мл 10% гомогената печени в течение 60 мин при 37^оС. В 0,025 мл инкубированной среды по унифицированной методике была определена активность γ-ГТ, которая составила 7,0 Е/л. Активность фермента в контроле (гомогенат печени) составила 7,5 Е/л. Таким образом, результат анализа не показал увеличения активности γ -ГТ в системе сыворотки крови + гомогенат печени по сравнению с контролем, что свидетельствует об отсутствии метастазов в печени. Гепатосцинтиграфия, проведенная 23.01.87 г. показала отсутствие метастазов в печени, наличие диффузного поражения печени - хронический гепатит.

П р и м е р 2. Больная Ф., и.б. 4535/о, поступила в отделение химиогормонотерапии РНИОИ 05.01.87 г. с диагнозом рак молочной железы, генерализация процесса, метастазы в печени под вопросом. 09.01.87 у больной была определена активность γ -ГТ предлагаемым способом. Активность фермента в контроле составила 7,5 Е/л, активность γ -ГТ в системе сыворотка крови + +гомогенат печени - 125 E/л, т.е. в 16 раз превысила показатели контроля. Это свидетельствовало о наличии метастазов в печени. Больная экзитировала 20.01.87 г., на вскрытии в печени обнаружены множественные метастазы.

П р и м е р 3. Больная З., и.б. N 4627/к поступила в отделение гинекологии РНИОИ 19.09.86 г. с диагнозом рецидив рака яичников. У больной по поводу рака яичников 17.05.82 г. была удалена матка с придатками. Первый рецидив заболевания - в июле 1985 года, второй - в ноябре 1985 г. Релапоротомия, проведенная 01.11.85 г. показала наличие метастазов в забрюшинных лимфоузлах и печени. 09.12.86 года у больной предлагаемым способом определена активность γ -ГТ. Она составила 22,5 Е/л при активности в контроле равном 7,5 Е/л. Увеличение активности фермента в три раза по сравнению с контролем свидетельствовало о наличии метастазов в печени. Гепатосцинтиграмма, полученная 13.01.87 г. показала наличие метастазов в печени, подтвердив ранее поставленный диагноз.

Использование предлагаемого способа по сравнению с существующими имеет следующие преимущества:
- дает возможность надежно и обоснованно выявлять метастазы в печени, дифференцируя их от других патологических состояний;
- позволяет избежать использование в работе дорогостоящих и токсичных веществ;
- не требует при выполнении дорогостоящей специальной аппаратуры;
- позволяет проводить исследования с меньшей затратой времени, значительно повышая информативность и точность исследований.

Использование: медицина, точнее методы биохимических исследований, может быть использовано в онкологии. Цель - повышение точности способа. Сущность изобретения: инкубируют сыворотку крови больного с гомогенатом печени здоровой крысы, определяют активность гамма-глутамилтрансферазы (γ-ГТ) и при повышении ее активности в 2 и более раза, по сравнению с контролем, диагностируют метастазы в печени. Использование позволяет надежно диагностировать метастатическое поражение печени и сократить время проведения анализа почти в 4 раза, исключить применение дорогостоящих и токсичных веществ, сложной аппаратуры. 4 табл.

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ МЕТАСТАЗОВ В ПЕЧЕНИ, включающий определение активности фермента в биологическом материале, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, к сыворотке крови больного добавляют 10%-ный гомогенат печени лабораторной крысы в соотношении 1:10, смесь инкубируют в течение 60 мин при 37^oС с последующим определением в нем активности гаммаглутамилтрансферазы и при повышении значения этого показателя в 2 раза и более по сравнению с контролем, которым является гомогенат печени крысы, диагностируют метастазы в печени.