СОПОЛИМЕРЫ (N,N-ДИМЕТИЛ-N,N-ДИАЛЛИЛАММОНИЙХЛОРИДА С АКРИЛОВОЙ КИСЛОТОЙ И 2-[4-ГИДРОКСИ-3,5-ДИ(ТРЕТ-БУТИЛ)ФЕНИЛ-ЭТИЛ-КАРБОНИЛ]-ГИДРАЗИДОМ АКРИЛОВОЙ КИСЛОТЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ АНТИМУТАГЕННОЙ, ЗАЩИЩАЮЩЕЙ И СТИМУЛИРУЮЩЕЙ ЭРИТРОПОЭЗ АКТИВНОСТЬЮ ПРИ ДЕЙСТВИИ γ -ИЗЛУЧЕНИЯ Российский патент 1995 года по МПК C08F226/04 C08F226/04 C08F220/06 C08F220/60 

Изобретение относится к новым биологически активным соединениям, а именно к тройным сополимерам N,N-диметил-N,N-диаллиламмонийхлорида с акриловой кислотой и 2 [4-гидрокси-3,5-ди-(трет-бутил)фенил-этил-карбонил]гидразидом акриловой кислоты, обладающим антимутагенной, защищающей и стимулирующей эритропоэз активностью при действии гамма-излучения. Предложенные соединения могут найти применение в биологии, в медицине, а также при решении проблем снижения уровня генетических поражений, вызванных действием мутагенных факторов окружающей среды, в частности, гамма-излучения.

Известны сополимеры винилпиролидона с акриловой кислотой и акрилатом меди, обладающие иммуностимулирующей активностью (1).

Известны сополимеры N,N-диметил-N,N-диаллиламмонийхлорида (ДМДААХ) и акриловой кислоты (АК) (2).

Применение сополимера ДМДААХ с АК, имеющего состав, (мол.): m 32,08% n 67,92% в максимально переносимой дозе (МПД) 250 мг/кг (при однократном в/б введении) при дозе гамма-излучения 150 рад. позволило достичь антимутагенной эффективности 53% защищающей и стимулирующей эритропоэз активности (соотношение молодых форм эритроцитов к зрелым) 1,1-1,3.

Целью изобретения является создание новых тройных сополимеров N,N-диметил-N, N-диаллиламмонийхлорида с акриловой кислотой и 2 [4-гидрокси-3,5-ди-(третбутил)фенил-этил-карбонил]гидразидом акриловой кислоты, обладающих высокой антимутагенной, защищающей и стимулирующей эритропоэз активностью при действии гамма-излучения.

Указанная цель достигается новыми соединениями, а именно тройными сополимерами (ТСП) следующей структуры:
C- CH CH₂-
где m:n:p 32,08:(57,72-67,24):(0,68-10,2), средняя η 0,21 дл/г обладающими антимутагенной, защищающей и стимулирующей эритропоэз активностью при действии гамма-излучения.

Данные соединения получают взаимодействием бинарного сополимера ДМДААХ с АК (11) с соотношением звеньев (мол.): 32,08:67,92% с соединением, относящимся к группе пространственно затрудненных фенолов, а именно гидразидомβ-(4-гидрокси-3,5-ди-третбутилфенил) пропионовой кислоты (ГФ).

Бинарный сополимер 11 проявлял антимутагенную активность (при введении в МПД) 53% и стимулировал эритропоэз в 1,1-1,3 раза при действии гамма излучения в дозе 150 рад.

Соединение ГФ получают по известной методике (3) для дополнительной очистки ГФ перекристаллизовывают из спирта. О чистоте ГФ судят по совпадению температуры плавления полученного образца с описанной в литературе т.пл. 147-148^оС.

Реакцию 11 с ГФ осуществляют в метаноле при 0^оС. Характеристическая вязкость исходного 11 [ η] 0,21 дл/г.

П р и м е р 1. Получение тройного сополимера ТСП-1
m:n:p 32,08:57,72:10,2.

Исходный сополимер 11 в количестве 1 г (1˙10^-2 мол) растворяют при перемешивании с помощью магнитной мешалки в 30 мл метанола, к полученному раствору добавляют поочередно 0,42 г (2,04˙10³ мол) дициклогексилкарбодиимида (ДЦГК) известного в пептидном синтезе водоотнимающего агента и 0,295 г (1,01˙10^-3) ГФ. Смесь перемешивают 2-3 ч при 0^оС. Выпавший осадок отфильтровывают. ТСП-1 получают высаживанием из метанольного раствора в эфир. Для дополнительной очистки ТСП-1 переосаждают из метанола в эфир и сушат в вакууме. Структуру ТСП-1 подтверждают данными элементного анализа и УФ-спектроскопии. Для исходного ГФ характерна отчетливая полоса поглощения в УФ-спектре в области 240-260 нм, в то время как в УФ-спектре исходного сополимера 11 в указанной области полосы поглощения отсутствуют. Данные УФ-спектроскопии тройного сополимера ТСП-1 подтверждают предполагаемую структуру сополимера полоса поглощения в области 240-260 нм отвечает за появление в структуре ТСП-1 ковалентно связанных бензольных колец. Характеристическая вязкость ТСП-1 составляла [ η] 0,21 дл/г. Полученный ТСП-1 имеет состав (мол.): m 32,08% n 57,72% p 10,2% Элементный состав:
Найдено, C 59,19; H 8,43; N 5,78; Cl 8,62%
(C₈H₁₆NCl)_32,08(C₃H₄O₂)_57,72(C₂₀H₃₀O₃N₂)10,2.

Вычислено, C 59,11; H 8,16; N 5,71; Cl 8,85
П р и м е р 2. Получение ТСП-11.

Описанным в примере 1 способом к раствору 1 г сополимера 11 в метаноле добавляют поочередно 0,14 г (6,8˙10^-4 мол) ДЦГК и 0,0058 г (3,37˙10^-4 мол) ГФ. Полученный ТСП-11 имеет состав (мол.): m 32,08; n64,52; p 3,4% характеристическая вязкость [η] 0,21 дл/г.

Найдено, C 56,59; H 8,01; N 4,49; Cl 10,25
(C₈H₁₆NCl)_32,08(C₃H₄O₂)_64,52(C₂₀H₃₀O₃N₂)_3,4
Вычислено, C 56,52; H 7,93; N 4,94; Cl 10,36
П р и м е р 3. Получение ТСП-111.

Описанным в примере 1 способом к раствору 1 г сополимера 11 в метаноле добавляют поочередно 0,028 г (1,36˙10^-4 мол) ДЦГК и 0,0197 г (6,73˙10^-5 мол) ГФ. Полученный ТСП-111 имеет состав (мол.): m32,08; n 67,24; p 0,688; [η] 0,21 дл/г.

Найдено, C 55,14; H 7,98; N 4,53; Cl 11,14
(C₈H₁₆NCl)_32,08(C₃H₄O₂)_67,24(C₂₀H₃₀O₃N₂)_0,68
Вычислено, C 55,18; H 7,91; N 4,56; Cl 11,09
П р и м е р 4. Оценка антимутагенной активности ТСП-1 на растительной тест-системе.

В результате предварительных исследований, проведенных на семенах ячменя (до опытов на животных), было показано, что катионогенные полиэлектролиты проявляют высокую антимутагенную эффективность в отношении защиты генома растений от последствий гамма-излучения. Влияние тройного сополимера ТСП-1 на индукцию гамма-излучением структурных повреждений хромосом у растений оценивают по методу учета хромосомных аберраций в метафазе митоза в меристематических клетках корешков проростков ячменя сорта Московский-121. Используют дозу гамма-излучения 1500 рад, при которой число клеток с аберрациями хромосом и число аберраций хромосом на клетку увеличивается в 9 раз по сравнению с контролем.

Показано, что тройной сополимер ТСП-1 по сравнению с исходным проявляет более высокую антимутагенную эффективность независимо от последовательности воздействия на семена радиации и протектора.

В первом случае непосредственно после облучения семена помещают в чашки Петри на фильтровальную бумагу, смоченную раствором ТСП-1 в концентрации 250 мг/л на период получения 28-36-часовых проростков и момента их фиксации. В проростках, полученных на фоне ТСП-1, число метафаз с аберрациями хромосом в 3,73 раза меньше, чем в варианте с исходным полиэлектролитом. Эффективность защиты на фоне тройного сополимера составляет 90,31% что на 27,63% выше, чем в исходном варианте 11 (62,68%).

Во втором случае семена до облучения замачивают в течение 3 ч в растворах испытуемых сополимеров при концентрации 250 мг/л, затем облучают и непосредственно после облучения отмывают от сополимеров и проращивают до фиксации в течение 28-36 ч на фильтровальной бумаге, смоченной отстоявшейся водопроводной водой. При этом число метафазных клеток с аберpациями и число аберраций на клетку в варианте с тройным сополимером снизилось в 2,08 раза по сравнению с проростками семян, прошедших обработку исходным сополимером. Эффективность защиты при использовании тройного сополимера 75,81% на 25,5% выше, чем при применении исходного 11 (50,31%).

П р и м е р 5. Антимутагенная активность тройных сополимеров ТСП-1; ТСП-11 и ТСП-111 (на млекопитающих).

Мутагенные эффекты у млекопитающих оценивают по числу индуцированных гамма-излучением микроядер в полихроматофильных эритроцитах-ретикулоцитах (молодых формах) костного мозга мышей. Метод выявляет повреждения хромосом (индуцир. гамма-изл.) в эритробластах костного мозга мышей. Используют мышей гибридов первого поколения СВА х С₅₇BL/6I. Гамма-излучение в дозе 150 рад индуцировало число микроядер в 30-40 раз превышающее их уровень у необлученных животных. Эффекты гамма-излучения на эритропоэз оценивают по соотношению молодых форм эритроцитов (ретикулоциты) к зрелым. У необлученных животных на 100 зрелых эритроцитов регистрируют, как правило 70-80 ретикулоцитов (0,7-0,8). При гамма-излучении 150 рад число ретикулоцитов снижается до 40-50 (0,4-0,5) на 100 зрелых форм.

За 30 мин 2 ч до облучения мышам однократно (в/б) вводят водный раствор ТСП-1 в дозах 100 и 150 мг/кг веса животного а ТСП-11 и ТСП-111 в дозах от 25 до 200 мг/кг. МПД ТСП-1 150 мг/кг, для ТСП-11 и ТСП-111 200 мг/кг.

Тройные сополимеры ТСП-1,11 и 111, введенные в указанных дозах интактным животным, не индуцируют микроядер в ретикулоцитах.

ГФ в концентрациях, соответствующих содержанию этого вещества (мас.) в дозе ТСП-1,11 и 111, вводимой мышам не проявляет антимутагенную и защищающую эритропоэз активность (сохранение соотношения молодых форм эритроцитов к зрелым) при действии гамма-излучения 150 рад. В норме для необлученных животных соотношение молодых форм эритроцитов к зрелым составляет 0,8.

ТСП-1 снижает число микроядер в полихроматофильных эритроцитах облученных животных на 58,5 и 68,4% (введено соотв. 100 и 150 мг/кг); при этом защищающая и стимулирующая эритропоэз активность (соотношение молодых форм эритроцитов к зрелым) составляет 0,85 и 0,79 соответственно.

ТСП-11 снижает число микроядер в полихроматофильных эритроцитах облученных (150 рад 1 мин) животных на 71,3; 76,7; 78,0; 71,6; 68,3% при введении соотв. 25; 50; 100; 150; 200 мг/кг массы животного; при этом стимулирующая эритропоэз активность составляла соответственно: 1,17; 1,23; 1,15; 1,22.

ТСП-111 снижает число микроядер в полихроматофильных эритроцитах облученных (150 рад) животных на: 34,3; 55,6; 65,6; 77,8; 90,1% при введении соотв. 25; 50; 100; 150; 200 мг/кг веса животного; при этом защищающая и стимулирующая эритропоэз активность (соотношение молодых форм эритроцитов к зрелым) составляет соответственно: 0,89; 1,15; 1,3; 1,46; 1,58.

Дальнейшее уменьшение содержания ГФ в тройном сополимере нецелесообразно в связи с достижением антимутагенной активности для ТСП-111 в области концентраций, приближающихся к МПД.

Таким образом предложенные тройные сополимеры ТСП-1, 11 и 111 по сравнению с известным структурным аналогом бинарным сополимером 11 обладают более высокой антимутагенной активностью, составляющей 61,4-90,1% (для сополимера 11-53% ). При этом для всех предложенных составов тройных сополимеров характерна защищающая и стимулирующая эритропоэз активность соотношение молодых форм эритроцитов к зрелым при введении ТСП-1, 11, 111 изменяется в диапазоне 0,89-1,58, а при введении двойного сополимера 11 от 1,1 до 1,3.

Использование: в биологии, медицине, а также при решении проблем снижения уровня генетических поражений, вызванных действием мутагенных факторов окружающей среды (гамма-излучение). Сущность изобретения: сополимеры N,N-димметил-N, N-диаллиламмонийхлорида с акриловой кислотой и 2-[ 4-гидрокси-3,5-ди-третбутил)фенил-этил-карбонил] гидразидом акриловой кислоты при молярном соотношении элементарных звеньев 32,08 57,72-67,24 0,68-10,2 соответственно, со средней характеристической вязкостью [ h 0,21 дл/г, обладающие антимутагенной, защищающей и стимулирующей эритропоэз активностью при действии гамма-излучения.

Сополимеры N,N-диметил-N,N-диаллиламмонийхлорида с акриловой кислотой и 2-[4- гидрокси- 3,5-ди-(трет-бутил)фенил-этил-карбонил]-гидразидом акриловой кислоты общей формулы

со средней характеристической вязкостью [η] = 0,21 дл/г при соотношении m n p 32,08 (57,72 67,24) (0,68 10,2), обладающие антимутагенной, защищающей и стимулирующей эритропоэз активностью при действии γ -излучения.