СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИЧНОСТИ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ Российский патент 1996 года по МПК G01N33/18 

Изобретение относится к экологии, а именно к способам оценки уровней загрязнения окружающей среды, и может быть использовано
для простого, относительно быстрого получения объективной информации об уровне суммарного загрязнения естественными, техногенными физическими и химическими факторами окружающей среды, ее отдельных компонентов-почвы, воздуха, речной и питьевой воды, пресноводных донных отложений;
для последующего выявления в них токсичных фракций и отдельных токсикантов;
для количественного выражения вредности отдельных не только физических, но и химических токсикантов, их сочетаний и суммарной токсичности окружающей среды, ее отдельных компонентов в единых сравнимых между собой единицах биологического эквивалентного действия радионуклидов;
для установления объективного контроля за состоянием общего уровня техногенного загрязнения в любой точке местности и на обширных пространствах.

Общеизвестны три основные группы способов определения суммарного уровня загрязнения окружающей среды и ее отдельных компонентов:
1. Группа взаимосвязанных аналитических и последующих расчетных методов, с помощью которых вначале определяется содержание лишь некоторых из многих находящихся в окружающей среде токсикантов, а затем уровень суммарного загрязнения среды оценивают по существующим нормативным предельно допустимым концентрациям, активностям, которые были разработаны для отдельно изолировано действующих факторов, а не для реально существующих условий многофакторного воздействия, при которых наблюдается и простое суммирование неблагоприятного влияния всех токсикантов, и могут одни факторы резко усиливать действие других, а поэтому оценка суммарного загрязнения среды бывает неточной и прогнозирование неблагоприятных последствий заниженным и часто ошибочным. Использование этой группы способов является трудоемким, дорогостоящим, длительным во времени и окончательное заключение о степени вредности среды обитания приходит тогда, когда уже свершилось воздействие многофакторного загрязнения на экосистемы, на человека, после которого остается лишь получать информацию о суммарном загрязнении среды с помощью второй группы способов регистрации натурных неблагоприятных последствий загрязнения сразу на чувствительных короткоживущих видах животных, растений, а затем и на людях.

2. Опережающую информацию получают с помощью экспериментов на лабораторных, домашних и сельскохозяйственных животных. Однако эти опыты также являются трудоемкими, дорогостоящими, проведение их длительно во времени. Использование же известных способов биоиндикации с помощью более просто организованных биологических объектов, например водорослей (Брагинский Л.П. и др. 1987; Lukavsky J. 1986), безпозвоночных, насекомых, рыб, амфибий (обзор Mayer F.L. 1988) требует меньше затрат и времени, однако эти биообъекты чувствительны не ко всем токсикантам химической (Помазковская И.В. и соавт. 1988) и особенно физической природы или малочувствительны к ним. Кроме того, использование для биоиндикации местных биообъектов из загрязненных местностей еще больше снижает чувствительность способов, так как местные популяции из-за постепенного естественного отбора содержат особей и их потомков с приобретенной генетической резистентностью к токсическим факторам среды.

Прототипом изобретения способа биоиндикации является модель развивающихся эмбрионов и личинок морских ежей, которые имеют много достоинств. В своей естественной среде обитания (море) они являются одним из наиболее чувствительных биоиндикаторов уровня загрязнения [2] так как они высокочувствительны ко многим физическим и химическим токсикантам, в частности к тяжелым металлам (обзор Христофорова Н.К. 1989), углеводородам (Ващенко М.А. Найденко Т. Х. 1978), ионизирующей радиации (Rustag R.C. 1975), к радионуклидам (тритию, цезию 137, стронцию 90, пестицидам и минеральным удобрениям (Грищенко А.М. и соавт. 1991). Условия инкубирования эмбрионов хорошо изучены (Бузников Г.А. и Подмарев В.К. 1975), просты и не требуют больших затрат. Сами развивающиеся объекты являются удобными для прижизненного наблюдения и регистрации результатов токсикологических исследований по влиянию на процессы оплодотворения яйцеклеток, деление клеток, образование отдельных органов, скелета и уже используются как наиболее надежный биотест для определения суммарной токсичности морской воды, как среды своего обитания [3] промстоков (Oshida Ph.S. e.c. 1981).

Главным недостатком или упущением является то, что эмбрионы и личинки морских ежей используются пока только для определения суммарной токсичности морской воды, как среды своего обитания, в то же время их можно при определенных условиях использовать и для биоиндикации наземной и пресноводной окружающей среды. Для использования их в этих целях имеются лишь затруднения технического плана: необходимо или доставлять взрослых морских ежей как продуцентов половых продуктов из экологически чистых зон в места биоиндикации или везти небольшие навески исследуемых проб к местам обитания морских ежей.

Для количественной характеристики токсичности используются общепринятые показатели минимально-, средне- и абсолютнолетальных доз (ЛД₁₀, ЛД₃₇, ЛД₅₀, ЛД₁₀₀), которые для химических токсикантов выражаются в массовых или объемных единицах, для физических факторов в других единицах активностей, и ими невозможно пользоваться при определении суммарной токсичности всей среды обитания или, наоборот, при вычленении роли отдельных химических и физических факторов в суммарной токсичности. Кроме того, это показатели не прямые, а обратные и это затрудняет оперативную оценку состояния уровней загрязнения окружающей среды.

Поэтому возникает необходимость разработки единого прямого показателя, пригодного для сравнительной количественной оценки вредности любого отдельного физического или химического токсиканта, их всевозможных сочетаний и окружающей среды в целом.

Прототипом способа количественного выражения токсичности является общепринятая в радиобиологии единица бэр (биологический эквивалент рада) единица поглощенной дозы разного вида ионизирующих излучений с их неодинаковой относительной биологической эффективностью (ОБЭ), равная биологическому эффекту рентгеновского излучения 100-200 кэВ или гамма-излучения кобальта 60. Введение этой единицы позволило не только проводить сравнительную количественную оценку разноэффективного ионизирующего излучения, но при необходимости более точно количественно оценить полученную биообъектом суммарную дозу от различных источников и возможность более уверенно прогнозировать вредное влияние воздействия радиации.

Для реально существующих условий многофакторного загрязнения окружающей среды не только физическими, но и химическими токсикантами не разработан пока единый показатель, по которому можно было бы оценить суммарный уровень многофакторного загрязнения и роль в нем любого физического или химического фактора.

Цели изобретения.

1. Разработать простой, многоинформативный, экономически выгодный способ быстрого получения информации об уровне суммарного загрязнения почвы, речной и питьевой воды, воздуха, донных отложений и определения удельной роли в ней различных фракций токсикантов.

2. Разработать способ количественного выражения вредности не только отдельных физических, но и химических токсикантов, их сочетаний и суммарной токсичности среды в единых прямых интегральных показателях.

Поставленные цели достигаются тем, что для биоиндикации были использованы развивающиеся эмбрионы и личинки морских ежей, этих существующих в природе высокочувствительных биоиндикаторов уровней техногенного загрязнения своей морской среды обитания и уже используемых для определения суммарной токсичности морской воды, но примененных по новому назначению для определения суммарной токсичности и тератогенности несвойственных морским ежам компонентов среды обитания почвы, воздуха, речной и питьевой воды, пресноводных донных отложений, выявлению в них фракций токсикантов; для количественной прямой оценки введением относительной единицы токсичности, равной биологическому действию на эмбрионы 1-го пикокюри стронция 90.

I Способ определения токсичности и тератогенности почвы, речной и питьевой воды, воздуха, донных отложений осуществляли следующим образом.

П р и м е р 1. Определение суммарной токсичности и тератогенности почвы или донных отложений.

Двукратно уменьшающиеся навески (5; 2,5; 1,25 и т.д. г) высушенных образцов исследуемой почвы или донных отложений помещали в пенициллиновые флаконы, добавляли по 9,9 мл профильтрованной морской воды, суспензию взмучивали, оставляли на 3 ч для осаждения взвешенных частиц, затем осторожно добавляли по 3 тысячи только что оплодотворенных яйцеклеток (99-100% оплодотворения) серых морских ежей Strongylocentro tusintermedius в 100 мкl морской воды. Пробы дублировали трехкратно и инкубировали при 21^оС в течение 60 ч. При условии нормального развития эмбрионов и личинок в параллельных контрольных пробах, где была только морская вода, учитывали суммарно количество погибших, остановившихся, задержавшихся в развитии и аномальных особей. Рассчитывали ЛД₅₀ по Керберу и Симсону (1975) и количество бэс в пробах и в 1 кг почвы или донных отложений (см. способ 2, пример 6).

П р и м е р 2. Определение токсичности и тератогенности питьевой или речной воды.

Сразу уравновешивали по солевому составу исследуемые пробы, для чего к одному объему речной или питьевой воды добавляли один объем упаренной вдвое в термостате профильтрованной морской воды. Затем в пенициллиновых флаконах готовили двукратно уменьшающиеся разведения речной или питьевой воды в 10 мл морской воды, добавляли по 3 тысячи оплодотворенных яйцеклеток и далее инкубировали, учитывали результаты и оценивали токсичность как в примере 1.

П р и м е р 3. Определение токсичности и тератогенности воздуха.

Инкубация развивающихся эмбрионов и личинок проводилась при продувании через морскую воду с эмбрионами с помощью компрессора для аквариума и микротрубочек воздуха со скоростью 0,167 м³/ч в течение 60 ч. Учитывали результаты как в примере 1. Рассчитывали ЛД₅₀ и количество бэс в 1 м³ воздуха.

П р и м е р 4. Определение удельного веса в суммарной токсичности почвы водорастворимой фракции.

К 15 г почвы добавляли 30 мл морской воды, взмучивали, инкубировали 3 ч при 21^оС, получали экстракт путем фильтрования через обеззоленную фильтровальную бумагу и определяли токсичность двукратно уменьшающихся разведений как в примере 2 с последующим определением в процентах токсичности водорастворимой фракции от суммарной токсичности почвы.

П р и м е р 5. Определение удельного веса токсичности нерастворимых в воде альфа-излучателей радионуклидов в суммарной токсичности почвы или донных отложений.

Проводили как в примере 1, только параллельно в других флаконах перед добавлением оплодотворенных яйцеклеток поверхность почвы осторожно покрывали кружком из фильтровальной бумаги, который задерживает альфа-частицы из-за их короткого пробега. Учитывали результаты и выражали токсичность в единицах бэс (как в примере 6 и 9) в пробах с фильтром и без фильтра, разницу между ними рассматривали как удельный вес токсичности альфа-излучателей (нерастворимых в воде) в суммарной токсичности почвы.

II. Способ определения и использования универсальной единицы токсичности, пригодной для прямого количественного выражения токсичности не только отдельных химических, физических факторов, суммарной токсичности компонентов окружающей среды, но и вычленения удельного веса вредности отдельных токсикантов осуществляли следующим образом.

Вначале определяли токсичность отдельных радионуклидов, пестицидов, минеральных удобрений, затем в диапазоне токсичности, близкой к ЛД₅₀, определяли какая величина конечного эффекта поражения эмбрионов и личинок припадает на единицу активности радионуклида, принимали эту величину за единицу биологического эквивалентного действия самого радионуклида и с помощью ее проводили оценку сравнительного влияния других радионуклидов, химических токсикантов, компонентов окружающей среды и удельного веса токсикантов, их фракций в суммарной токсичности. Для всех исследованных радионуклидов, химических факторов была выявлена общая закономерность их действия: чем выше была концентрация химического токсиканта или выше активность радионуклида, тем на более ранней стадии блокировалось развитие особей и каждая предыдущая стадия была в два раза более устойчивой к токсикантам, чем последующая. Это дало возможность использовать одну таблицу для выражения токсичности для широкого диапазона концентраций или активностей токсикантов.

П р и м е р 6. Определение ЛД₅₀ и единицы биологического эквивалента стронция-90 (бэс), составление таблицы для выражения токсичности в бэсах самого стронция-90, других радионуклидов, химических токсикантов.

В пенициллиновых флаконах готовили двукратно уменьшающиеся разведения азотно-кислого стронция-90 (удельная активность 1,4 х 10^-4 кюри/мг) в 100 мкl 0,1 н. азотной кислоты, нейтрализовали рН добавлением по 100 мкl 0,1 н. NaOH, затем по 9,7 мл профильтрованной морской воды и по 3 тысячи оплодотворенных яйцеклеток в 100 мкl морской воды. Инкубацию развивающихся эмбрионов, учет результатов и определение ЛД₅₀ проводили как в примерах 1 и 2.

ЛД₅₀ для стронция-90 оказалась равной 6,25 (9,53-2,01) х 10^-11 Ки/10 мл морской воды или 2,3125 (3,5260-0,0740) Бк/10 мл, или 4,45 (6,88-1,44) х 10^-7 мг/10 мл. В области ЛД₅₀ повышению активности радионуклида на 1 пКи в 10 мл морской воды сопровождалось увеличением на 0,8% (у 24 из 3000 особей) аномалий развития и гибели личинок. Эту величину минимального повреждающего действия радионуклида принимали за единицу биологический эквивалент стронция 90 (бэс).

Экспериментальным путем было установлено, что при ступенчатом двукратном нарастании активности стронция в 10 мл воды от 0 до 125 пикокюри (1,25 х 10^-10 Ки/10 мл) наблюдалось дозозависимое увеличение аномалий развития и гибели личинок на стадии средних плутеусов-1. При дальнейшем нарастании активности стронция-90 от 2,5 х 10^-10 Ки/10 мл до 1 х 10^-6 Ки/10 мл обнаруживалось блокирование развития особей на все более и более ранних стадиях вплоть до остановки первого деления всех оплодотворенных яйцеклеток при активности 1,024 х 10^-6 Ки/10 мл и выше стронция. Эти экспериментальные данные позволили выразить зависимость величины биологического эффекта для широкого диапазона изменения активности радионуклида в одной таблице (табл. 1), по которой, имея результаты определения влияния на эмбрионы только одной пробы в одной концентрации или активности самого стронция-90 или другого токсиканта, можно быстро определять и выражать их токсичность в одних единицах эквивалентного действия.

П р и м е р 7. Выражение токсичности радионуклидов, химических токсикантов в универсальных единицах бэс.

Определены ЛД₅₀ для некоторых радионуклидов, пестицидов, минеральных удобрений (как в примерах 2 и 6) на модели развития морских ежей (табл. 2). Учитывая то, что ЛД₅₀ для стронция-90 или любого другого токсиканта содержит 62,5 бэс для пробы 10 мл воды или 6250 бэс для 1 л, определяем сколько бэс содержится в единице веса токсиканта или для определенной активности радионуклида.

Если результаты определения радионуклидов выражены в специфических единицах, то пересчет на содержание бэс следующий:
1 мкКи (1 х 10^-6 Ки) стронция-90 соответствует 1000000 бэс
-"- цезия-137 72928 бэс
-"- тритиевой воды 86,2 бэс
1 Бк или распад/c от стронция-90 соответствует 27 бэс
от цезия-137 1,971 бэс
от тритиевой воды 0,00233 бэс
П р и м е р 8. Выражение суммарной токсичности питьевой или речной воды, бэс.

Получены результаты (пример 2), что проба 5 мл питьевой воды, уравновешенная по солевому составу 5 мл морской упаренной вдвое морской воды вызывает аномалии развития у 28,0% личинок на стадии средних плутеусов-1. По табл. 1 находим, что это соответствует при стадии средних плутеусов-1 (25 + 10) 35 бэс в пробе воды 5 мл или х 200 7000 бэс в 1 л воды.

П р и м е р 9. Выражение суммарной токсичности почвы или донных отложений, бэс.

Получены экспериментальные данные о том, что проба почвы (пример 2) навески в 5 г без фильтра вызывает 78% остановок дальнейшего развития на стадии оплодотворенных яйцеклеток и 22% блокирования деления на стадии 2-4 бластомеров. По табл. 1 определяем, что блокирование 78% оплодотворенных яйцеклеток соответствует действию (716800 + 81920) бэс, а 22% эмбрионов на стадии 2-4 бластомеров (102400+ + 10240), всего от навески почвы 5 г -911360 бэс или 182272000 бэс в 1 кг почвы.

П р и м е р 10. Вычленение удельного веса токсичности отдельных уже известных факторов физической и химической природы в суммарной токсичности почвы или донных отложений.

С помощью других аналитических методов установлено, что в исследуемой почве (пример 9) содержится 28 мг/кг хлорофоса, 5,32 х 10^-7 Ки/кг цезия-137 и 1,33 х 10^-7 Ки/кг стронция 90. По табл. 2 определяем, что содержание хлорофоса соответствует 546868 бэс, наличие в почве цезия-137 и стронция-90 по примеру 7 соответствует 72928 и 133000 бэс, а снижение токсичности почвы с фильтром (пример 5) до 153531000 бэс/кг свидетельствует о том, что удельный вес альфа-излучателей в почве еще дополнительно составляет 28741000 бэс/кг.

Всего токсичность уже известных токсикантов в данной пробе почвы с суммарной токсичностью 182272000 бэс/кг составляет 29459666 бэс/кг, или 16,16% Остальные 83,84% суммарной токсичности могут определяться еще неизвестными находящимися в данной пробе почвы токсикантами физической и химической природы или их неблагоприятными сочетаниями.

Эффективность предлагаемых способов определяется прежде всего высокой чувствительностью эмбрионов и личинок морских ежей ко многим токсикантам не только химической, но и физической природы (табл. 3).

Использование развивающихся эмбрионов морских ежей не требует больших затрат и позволяет получать относительно быстро информацию о токсичности факторов: для сильнотоксичных проб за 2-3 ч, слаботоксичных за 60 ч.

В 1990 году с помощью предлагаемых способов нами определена суммарная токсичность и тератогенность 2007 проб донных пресноводных отложений и 3728 проб почв, отобранных на Украине в различные сроки до и после аварии на Чернобыльской АЭС.

По донным отложениям установлено, что средняя их токсичность в Киевском море и его притоках еще до момента аварии на ЧАЭС была значительной (табл. 4; 24,0 млн.бэс/кг), в 96000 раз превышала среднюю токсичность морских донных отложений экологически чистых мест Дальнего Востока (250 бэс/кг) и была эквивалентной токсичности 2,4 х 10^-5 Ки/л стронция-90.

После аварии на ЧАЭС токсичность донных отложений Киевского моря без учета действия уже распавшихся за 4 года короткоживущих радионуклидов существенно (р < 0,0005) увеличилась в 3,65 раза в 1986 году, причем картографически выявляется протяженный шлейф высокотоксичного пятна из реки Припять. На этот послеаварийный период 1986 года зарегистрирована высокая средняя токсичность донных отложений в Каневском море (64,4 млн. бэс/кг) и низкая пока (3,3 млн. бэс/кг) в Кременчугском.

Уже зимой 1986 летом 1987 года отмечено достоверное (более чем вдвое) уменьшение средней токсичности донных отложений в Киевском море.

В 1989 году зарегистрировано дальнейшее снижение токсичности проб донных отложений Киевского моря, реки Припять, но одновременно в 4 раза увеличилась токсичность донных отложений в Кременчугском море и оставалась достаточно высокой в Каневском, что свидетельствует о перемещении с годами неизвестно какой по счету волны высокотоксичных пятен вниз по течению р. Днепр к Черному морю.

Средняя токсичность проб почвы из Чернобыльского района до аварии на ЧАЭС (18,1 млн. бэс/кг) в 14480 раз превышала уровень токсичности почв экологически относительно чистых мест Дальнего Востока (1250 бэс/кг). После аварии на ЧАЭС она существенно (р < 0,001) повысилась вдвое до 38,0 млн./кг бэс (без учета действия уже распавшихся короткоживущих радионуклидов) в 1986 году. В смежных районах Киевской области (Иванковском, Вышгородском), в целом по Житомирской области суммарная токсичность почв была близкой. В 1986 году в южных, юго-западных районах Киевской области, даже в Крымской и других южных областях Украины зарегистрирована высокая (лишь на 25% меньше северных районов) токсичность почв. Однако в последующие годы отмечено существенное снижение токсичности почвы в южных областях Украины, в южных районах Киевской области, в то же время во всех северных районах Киевской и Житомирской областей отмечалось обязательное существенное нарастание токсичности почвы по сравнению с высоким послеаварийным уровнем в 1986 году. Так, в самом Чернобыльском районе такое повышение токсичности отмечено в 1987 и 1989 годах вдвое, в Полесском, Вышгородском и восточных районах Киевской области, в Житомирской области в 1988 году, в Иванковском районе Киевской области в 1989 г. По состоянию на 1989 год индексы токсичности почвы оставались высокими по многим обследованным областям Украины, а картографически выявлены высокотоксичные пятна не только в Киевской, Житомирской, но и в Черниговской, Винницкой, Донецкой, Днепропетровской, Крымской, Львовской, Ивано-Франковской, Черновицкой областях.

По городу Киеву определена токсичность почв, отобранных из точек наблюдения за экологической обстановкой в 1987 году (6 проб, средняя токсичность 33,8 млн. бэс/кг) и в 1990 году (792 пробы, 15,3 млн. бэс/кг). Картографически высокотоксичные пятна почвы как бы подковой охватывают город по окраинам. Выявлены отдельные высокотоксичные пятна по разных районах города. Установлено, что по Киеву имеется 19,5% точек, где уровень суммарной токсичности почвы в 2-20 раз превышает токсичность почвы на полях орошения, куда сходятся часть нечистот и промстоков из Киева, 27,2% точек территории города находятся на уровне загрязнения полей орошения (ЛД₅₀ почвы 204 (342-122) мг).

Таким образом, с помощью модели развивающихся эмбрионов и личинок морских ежей возможно количественно оценить за короткое время суммарную токсичность донных пресноводных, морских отложений, почвы в любой отдельной точке местности, а при массовых определениях становится возможным выявить крупные и мелкие высокотоксичные пятна, контролировать их изменение во времени и пространстве.

Полученные результаты биоиндикации могут быть полезными для более объективной количественной оценки состояния уже сложившейся экологической обстановки, уровней загрязнения среды физическими и химическими техногенными факторами, вычленения удельного веса отдельных факторов в суммарной токсичности среды в комплексе с другими методами исследований.

Полученные данные могут служить в качестве исходных для установления более оперативного контроля за состоянием окружающей среды, контроля за эффективностью мероприятий по ее оздоровлению.

Использование: для объективного относительно быстрого получения количественной информации об уровне суммарной вредности почвы, воздуха, речной и питьевой воды, пресноводных донных отложений. Сущность изобретения: способ осуществляют с помощью развивающихся эмбрионов и личинок морских ежей, которые для своей среды обитания служат естественным индикатором уровня техногенного загрязнения и являются высокочувствительными к токсическому действию радионуклидов, пестицидов, металлов и других токсикантов, уже используются для лабораторного определения суммарной токсичности морской воды. Вредность отдельных химических, физических токсикантов, их сочетаний и суммарную токсичность выражают в биологических эквивалентах стронция - 90. 4 табл.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИЧНОСТИ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ, включающий исследование тест-объекта в контрольной и опытной пробах с последующей оценкой токсичности по изменению физиологических параметров, отличающийся тем, что в качестве тест-объекта используют эмбрионы и личинки морских ежей в морской воде, к которым добавляют исследуемые пробы окружающей среды в виде почвы, или воздуха, или речной и питьевой воды, или пресноводных донных отложений, или отдельных физических и химических компонентов, или их сочетаний, а оценку токсичности проводят по летальности и количеству аномалий развития эмбрионов и личинок по сравнению с контрольной пробой с выражением токсичности в относительных токсических единицах - биологических эквивалентах стронция-90.