СПОСОБ ОЦЕНКИ ТОКСИЧНОСТИ ЗАГРЯЗНИТЕЛЕЙ ВОД АЗОВО-ЧЕРНОМОРСКОГО БАССЕЙНА Российский патент 2015 года по МПК G01N33/18 

Изобретение относится к водной экологии и токсикологии и может быть использовано для оценки токсичности вод Азово-Черноморского бассейна при проектировании и прогнозировании хозяйственной деятельности человека, а также для токсикологической оценки действия токсикантов на водные объекты, имеющие рыбохозяйственное значение.

Известны различные способы контроля за состоянием водной среды, которая подвергается хроническому антропогенному воздействию, связанному с поступлением в водоем комплекса токсикантов, в концентрациях индивидуальных веществ на уровне предельно допустимых концентраций (ПДК) и ниже. Из них особое значение имеют способы, использующие тест-объекты. Достоверность оценки загрязнения среды зависит от выбора тест-объекта.

Для оценки токсичности вод Азово-Черноморского бассейна используются штамм люминесцирующих бактерий Ph. phosphoreum (Cohn) Ford (И.Ю. Малыгина, А.М. Кацев. Светящиеся бактерии Черного и Азовского морей. Экология моря. 2003. Вып.64) (1), бактериальный тест «Эколюм», разработанный в России (ТУ 6-09-20-236-93, МГУ, Москва) (2), штаммы бактерий Vibrio fischeri ВКПМ В-9579 (Патент РФ №2346035, МКИ C12N 1/20 2007) (3) и Vibrio fischeri ВКПМ B-9580 (Патент РФ №2342434, МКИ C12N 1/20) (4). Эти штаммы выделены из воды Черного моря. Биотестирование основано на чувствительности биолюминесценции бактерий к действию токсикантов, присутствующих в воде и донных отложениях морских водоемов. В известных способах оценка токсичности основана на определении изменения интенсивности биолюминесценции бактерий при воздействии токсических веществ, присутствующих в анализируемой пробе, по сравнению с контролем. Однако содержание бактериальных культур требовательно к условиям культивирования, необходимо их частое пересевание, что приводит к большим затратам труда и средств.

Известен метод биотестирования при мониторинге прибрежных зон, где в качестве тест-объекта используются эмбрионы иглокожих и двустворчатых моллюсков (И.В. Ходаков. Метод использования ранних эмбрионов черноморской мидии для биотестирования при мониторинге прибрежных зон северо-западного шельфа // Тезисы всероссийской конференции «Экосистемы морей России в условиях антропогенного пресса (включая промысел)», Астрахань, 20-22 сентября, 1994. Астрахань, 1994. - С.352-353) (5), предусматривающий культивирование тест-объектов, где началом эксперимента является момент помещения осемененных яйцеклеток в тестируемую среду. Критерием воздействия тестируемой среды на развитие культуры эмбрионов является достоверное отличие между распределениями эмбрионов по стадиям дробления в контроле и тестируемой среде (хи-квадрат), для его расчета подсчитывают примерно по 500 эмбрионов в каждой повторности контроля и тестируемой пробы после фиксации формалином. Сравнение степени токсичности проб производится при помощи показателей синхронности дробления отдельно для групп одно-, двух- и четырехклеточных эмбрионов, взятых в отношении к контролю.

Известен способ определения токсичности водных сред (АС СССР №1270699, МПК⁴ G01N 33/18, C02F 3/32) [6], включающий исследование адаптации в них гидробионтов - брюхоногих моллюсков, предварительную калибровку степени чувствительности и устойчивости гидробионтов к эталонному токсиканту, проведение тестовых воздействий на опытные серии гидробионтов определенными концентрациями исследуемых сред, обеспечивая постоянство внешних условий и ступенчатое нарастание концентраций при воздействии на каждую из последующих серий гидробионтов, вычисление по ней двигательной активности для каждой концентрации и оценку степени токсичности водных сред.

Установлено, что наиболее уязвимыми к загрязнению и другим изменениям условий окружающей среды являются гидробионты на ювенальной стадии развития. К ним относится икра и личинки рыб. Известно, что икра и личинки из-за недостаточной сформированности систем защиты и невозможности ухода из зон загрязнения могут быть наиболее подвержены интоксикации загрязнителями. Поэтому поиск тест-объектов был направлен на отыскание эмбрионов и личинок рыб, которые могли бы служить в качестве тест-объекта для определения токсичности загрязнителей морских и пресных вод на юге России.

Известен способ определения токсического влияния сточных вод на эмбрионов и личинок морских рыб (Effects of sewage sludge on marine fish embryos and larvae / Costello Mark J., Gamble John С.// Mar. Environ, res. - 1992, - 33, 1. - P.49-74) (7), заключающийся в выявлении достоверного токсического влияния сточных вод на выживаемость эмбрионов сельди (Clupea harengus) и трески (Gadus morhua).

Известен способ определения токсического действия различных загрязняющих веществ (растворенные нефтепродукты, полихлорированные бифенилы, свинец, цинк, ртуть, медь) на рыб, находящихся на ранних стадиях онтогененза (Патин С.А. Влияние загрязнения на биологические ресурсы и продуктивность Мирового океана. - М.: «Пищевая промышленность», 1979. - С.157-160) (8), где в качестве тест-объектов используются икра и личинки Trachurus trachurus, Acipenser guldenstadti, Saimo trutta caspius, Hypophtalmichmys molitrix, Cyprinus carpio, Rutilus frisii kutum. Определены характеристики действия токсикантов LC₅₀ (в мкг/л) на развивающуюся икру и личинки некоторых морских и пресноводных рыб (продолжительность опытов 2-7 суток).

Известна работа по определению биологического последствия совместного воздействия нефтепродуктов и ХОП на эмбриогенез осетровых рыб (Варобьева А.А. Биологические последствия совместного воздействия нефтепродуктов и ХОП на эмбриогенез осетровых рыб // Тез. докл. 1-й науч. - практич. конф. «Проблемы современного товарного осетроводства», Астрахань, 24-25 марта, 1999. - Астрахань, 1999. - С.120-121) (9). Работы велись на икре и на выклюнувшихся эмбрионах осетра и севрюги. Экспериментальным путем установлено, что сочетание смеси хлорорганических пестицидов (ХОП, ДДТ) с нефтепродуктами (дизельное топливо L-0,5 ГОСТ 305-82) более опасно для развивающейся икры и эмбрионов, чем каждого отдельно взятого ингредиента, поскольку нефтепродукты усиливают растворимость пестицидов в воде. Смесь вызвала их гибель в более короткий срок и при меньших концентрациях (в 1,5-2 раза). Во всех случаях более уязвимы эмбрионы на стадии выклева и ранние личинки в сравнении с икрой.

Известна методика оценки влияния загрязнителей водной среды на эмбриогенез рыб (Костров Б.П., Дохолян В.К. Методика оценки влияния загрязнителей водной среды на эмбриогенез рыб // Методы ихтиотоксикологических исследований: Тезисы докладов Первого Всесоюзного симпозиума по методам ихтиотоксикологических исследований. Ленинград, октябрь 1987, - Л., 1987. - С.65-67) (10). Определяли влияние токсических веществ на эмбриональное развитие рыб путем выяснения мутагенной способности загрязнителей. Проведенные исследования на икре и личинках кутума, толстолобика, вьюна, осетровых, лососевых при воздействии токсикантов органической и неорганической природы позволили выявить достоверное возрастание уровня аномальных митозов в концентрациях токсикантов, не вызывающих нарушений эмбриогенеза.

Известен способ оценки токсичности загрязнителей вод дальневосточных морей (Патент РФ №2215290, МПК⁷ G01N 33/18) [11], в котором тест-объекты, в качестве которых используют предличинки японского анчоуса, выдерживают в тестируемых растворах, регистрируют физиологический ответ и о степени токсичности загрязнителя судят по токсилогическим параметрам - ЛК₀, ЛК₁₆, ЛК₅₀, ЛК₈₄, ЛК₁₀₀, где ЛК₁₆ считается пороговой концентрацией (максимально переносимая концентрация, вызывающая гибель 16% эмбрионов).

Выбранные в качестве тест-объектов предличинки японского анчоуса, используются для оценки токсичности загрязнителей вод дальневосточных морей. Наиболее близким к предложенному является, выбранный в качестве прототипа, способ оценки токсического действия пестицидов на водные объекты (Патент РФ №2446396, МКИ G01N 33/18) (12), в котором тест-объекты выдерживают в тестируемых растворах, регистрируют показатели выживаемости, патоморфологические изменения тест-объектов и сравнивают полученные результаты. Преимуществом этого способа по сравнению с известными является повышение точности оценки токсичности пестицидов для водных экосистем за счет учета их тератогенного действия на тест-объекты. В качестве тест-объекта используют эмбрионы осетровых рыб. Тератогенный анализ проводят на стадиях развития эмбрионов осетровых рыб и выклева. Интегральным показателем тератогенного эффекта пестицидов служат патоморфологические изменения у тест-объектов - фиксируют аномалии развития оплодотворенной икры и патоморфологические признаки выклюнувшихся эмбрионов. На основе тератогенного анализа подсчитывают средний процент уродств, а в качестве пороговой концентрации тератогенного действия Э_терК₁₆ устанавливают экспериментальную концентрацию пестицида, оказывающую минимальное тератогенное действие.

Осетровые рыбы считаются одними из наиболее чувствительных видов рыб к воздействию токсикантов, поэтому их используют в качестве тест-объектов при проведении токсикологических исследований, в частности при разработке ПДК пестицидов для рыбохозяйственных водоемов. Для тестирования используют эмбрионов и предличинок осетровых рыб, полученных в заводских условиях. Однако это очень дорогой и дефицитный тест-объект. Кроме того, эмбрионов и предличинок осетровых рыб нельзя использовать для оценки токсичности морских вод, так как их ранний онтогенез проходит в пресной воде. При оценке токсичности природных вод при применении эмбрионов и предличинок осетровых, полученных в заводских условиях, не всегда наблюдается их адаптация к воде конкретного водоема, что снижает достоверность полученных результатов.

Задача, решаемая изобретением, - расширение числа тест-объектов для оценки токсичности загрязнителей воды Азово-Черноморского бассейна, удешевление способа за счет использования более дешевого тест-объекта.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является более достоверная и экономически выгодная оценка токсичности загрязнителей воды Азово-Черноморского бассейна.

Поставленная задача решается тем, что в качестве тест-объекта для оценки токсичности загрязнителей воды Азово-Черноморского бассейна используют бычка-кругляка на ранних стадиях онтогенеза, икру которого, оплодотворенную в естественных условиях, собирают в природном водоеме.

Бычок-кругляк - это наиболее многочисленный вид Азово-Черноморского бассейна, для него характерен оседлый образ жизни и, соответственно, уязвимость в случае возникновения неблагоприятных ситуаций, связанных с загрязнением, гипоксией, гипертермией в местах его обитания. Кроме того, бычок-кругляк - эвригалинный вид, что позволяет его использовать для тестирования природных вод различной степени солености. Использование в качестве тест-объектов бычка-кругляка на ранних стадиях онтогенеза для оценки токсичности воды Азово-Черноморского бассейна позволит значительно снизить стоимость исследований, а также расширить число тест-объектов для оценки токсичности загрязнителей морских и пресных вод Южного региона России.

При этом использование для получения тест-объектов их икры, оплодотворенной в естественных условиях, которую собирают в тестируемых водоемах, повысит достоверность оценки токсичности загрязнителей исследуемой водной среды.

Способ осуществляется следующим образом.

Оплодотворенную в естественных условиях икру бычка-кругляка на стадии ранней гаструлы снимают с субстрата в природном водоеме и помещают в емкости с тестируемыми растворами, выдерживают от начала дробления до выклева, регистрируют физиологические изменения, т.е. показатели выживаемости, патоморфологические изменения тест-объектов, и оценивают степень токсичности загрязнителей.

Пример 1. Определение степени адаптации эмбрионов бычка-кругляка к воде разной солености и установление возможности использования этого вида для исследований в лабораторных условиях. Икра бычка-кругляка собиралась в природном морском водоеме (Таганрогский залив) в период массового нереста. Соленость воды в районе Таганрогского залива составляет 11‰. Оплодотворенную в естественных условиях икру бычка на стадии ранней гаструлы снимали с субстрата и помещали в емкости с пресной водой и водой различной солености (11‰ и 19‰). Продолжительность эксперимента составляла 19 суток. Данные приведены в таблице 1.

Таблица 1 Параметры развития бычка-кругляка в водах различной солености Параметры Инкубация в пресной воде Инкубация в воде соленостью 11‰ 19‰ Эмбрионы (14 суток) Гибель, % 10.4±4.07 5.2±2.06 7.2±1.36 Инкубационный период, сутки 12-14 12-14 12-14 Продолжительность выклева, сут 2.7±0.26 3.4±0.19 3.8±0.48 Патоморфологические признаки отсутствие Мальки (5 суток) Гибель, % отсутствие Длина, мм 8.71±0.03 8.43±0.07 8.40±0.08 Вес, мг 4.52±0.05 4.28±0.03 4.23±0.08 Патоморфологические признаки отсутствие

Из таблицы 1 видно, что выживаемость эмбрионов бычка-кругляка в воде с соленостью, соответствующей месту отбора икры выше, чем в воде с другой соленостью, причем в соленых водах выживаемость выше, чем в пресной. Процент естественной гибели эмбрионов, содержащихся в пресной воде, хотя и был выше, чем в соленой, но не превышал возможный для лабораторных и токсикологических исследований. Патоморфологических признаков у эмбрионов бычка-кругляка не выявлено. Во всех исследуемых средах гибели мальков и патоморфологических признаков у них не отмечалось. Различия морфологических показателей мальков в средах с различной соленостью были незначительными. Результаты исследования степени адаптивности бычка-кругляка к средам различной солености показали, что данный вид рыб может применяться в качестве тест-объекта для проведения лабораторных испытаний, как в пресной, так и соленой воде. В случае необходимости проведения токсикологических исследований высокой точности, например для токсикологической оценки действия загрязнителей на водные объекты, можно использовать «аборигенные» тест-объекты, что осуществимо, т.к. бычки-кругляки - наиболее многочисленный вид Азово-Черноморского бассейна.

Пример 2. Исследование чувствительности бычка-кругляка и осетровых рыб в период эмбрионального и раннего постэмбрионального развития к пестицидной интоксикации. Объектами исследования являлись: эмбрионы и мальки бычка-кругляка (Neogobius melanostomus (Pallas)), эмбрионы и предличинки осетровых рыб: осетра (Acipenser gueldenstaedti), стерляди (Acipenser ruthenus) и бестера (Huso huso L. x Acipenser ruthenus L.). Растворы токсикантов готовились на пресной воде.

Икра бычка-кругляка собиралась в природном морском водоеме (Таганрогский залив) в период массового нереста. Оплодотворенную в естественных условиях икру на стадии ранней гаструлы снимали с субстрата и помещали в емкости с растворами исследуемых пестицидов. Продолжительность эксперимента составляла 14 суток.

Икра осетровых была получена в заводских условиях и затравлена на стадии четырех бластомеров. Икру осетровых рыб помещали в емкости с растворами исследуемых пестицидов. Продолжительность эксперимента от начала дробления до выклева составляла 5-6 суток.

Токсическое действие пестицидов на развивающихся эмбрионов рыб оценивали по следующим показателям: выживаемость, длительность инкубационного периода, скорость прохождения стадий, патоморфологические признаки выклюнувшихся рыб.

Для оценки летального действия пестицидов регистрировали показатели выживаемости зародышей в период эмбриогенеза. Были проведены систематические наблюдения и учет живых и погибших эмбрионов на протяжении опыта, установлена зависимость выживаемости организмов от концентрации пестицида и времени его воздействия. По окончании эксперимента был проведен расчет основных токсикометрических параметров (ЛК₀, ЛК₁₆, ЛЛ₅₀, ЛК₈₄, ЛК₁₀₀) методом пробит-анализа по В.Б. Прозоровскому (Прозоровский В.Б. Использование метода наименьших квадратов для пробит-анализа кривых летальности // Фармакол. и токсикол. - 1962. №1). Результаты экспериментов по показателю выживаемости эмбрионов рыб представлены в таблице 2.

Таблица 2 Выживаемость и показатели эмбриогенеза бычковых и осетровых рыб при действии пестицидов, рассчитанные токсикометрические параметры Объект исследований Экспозиция опыта, сутки Концентрация, мг/л Длительность инкубационного периода, сутки Гибель, % Токсикометрические параметры, мг/л Пенфлуфен Эмбрионы бычка-кругляка 14 контроль 14 0 ЛК₁₆=0.53   0.1 14 0 ЛК₅₀=0.85   0.5 14 10.0 ЛК₈₄=2.32   1.0 18 66.67     5.0 - 100   Эмбрионы стерляди 5 контроль 0 0 ЛК₁₆=0.39   0.1 4.5 0 ЛК₅₀=0.96   0.5 4.75 29.63 ЛК₈₄=2.81   1.0 5.5 51.85     5.0 5.6 100   Биксафен Эмбрионы бычка-кругляка 14 контроль 0 0 ЛК₁₆=0.48   0.1 14 0 ЛК₅₀=0.79   0.5 16 16.67 ЛК₈₄=1.92   1.0 18 73.33     5.0 - 100   Эмбрионы бестера 5 контроль 0 0 ЛК₁₆=0.52   0.1 4.5 0 ЛК₅₀=0.96   0.5 4.55 15.52 ЛК₈₄=2.19   1.0 4.8 51.72     5.0 100 100  

Из таблицы 2 видно, что с увеличением концентраций фунгицидов возрастает длительность инкубационного периода, снижается выживаемость оплодотворенной икры бычка-кругляка и осетровых рыб. В растворах Пенфлуфена и Биксафена с концентрацией 5.0 мг/л погибли все эмбрионы бычка-кругляка и осетровых.

Из таблицы 2 следует, что Пенфлуфен и Биксафен обладают высокой степенью токсичности для обоих видов рыб.

Сравнение токсикометрических параметров эмбрионов бычка-кругляка и осетровых рыб при действии на них фунгицидов показало их незначительные отклонения друг от друга.

Тератологические исследования выявили в растворах Биксафена 1.0 мг/л у эмбрионов бычка-кругляка искривление туловищного и хвостового отделов тела. Атипично развивавшиеся эмбрионы бычка-кругляка в растворах Пенфлуфена с концентрацией 1.0 мг/л оказались нежизнеспособными и погибли перед выклевом.

Тератологические исследования выявили у выклюнувшихся эмбрионов стерляди в растворах с концентрациями 0.5-2.5 мг/л Пенфлуфена водянку перикардиальной полости, головного мозга, у части зародышей - недоразвитие головного отдела, С-образное искривление туловища, укороченный хвостовой стебель.

У выклюнувшихся эмбрионов бестера под действием Биксафена в том же диапазоне концентраций (0.5-2.5 мг/л) наблюдались водянка перикардиальной полости, искривление туловища и хвоста в дорсальном направлении, сильная деформация желточного мешка с образованием перетяжек, не восстанавливающихся после выклева.

Исследования показали, что степень тератогенного действия фунгицидов для выклюнувшихся эмбрионов осетровых рыб, как и для бычка-кругляка, носит дозозависимый характер - с увеличением концентраций возрастало количество патоморфологических признаков.

Следующая серия опытов была проведена на мальках бычка-кругляка и предличинках осетровых. На мальках бычка-кругляка, выклюнувшихся в лабораторных условиях, и на предличинках осетровых рыб, полученных в производственных условиях, изучали влияние пестицидов на раннее постэмбриональное развитие. В 2-литровые емкости с пресной водой вносили исследуемые пестициды, создавая ряд заданных концентраций. А также оставляли контрольные емкости без токсикантов. Мальков бычка-кругляка и предличинок осетровых рыб помещали в экспериментальные емкости. Экспозиция опытов на мальках бычка-кругляка составляла 7 суток, на предличинках осетровых рыб - 6 суток (от выклева до полного рассасывания желточного мешка). В течение экспериментов наблюдали за выживаемостью и поведенческими реакциями мальков и предличинок, проводили тератологический анализ. В конце опытов определяли темп линейного и весового роста организмов. Эксперименты по выживаемости осуществляли на фоне контроля в два этапа: острые - с экспозицией 3-е суток для бычка-кругляка, 2-е суток для осетровых рыб, и подострые, в которых длительность эксперимента для мальков бычка-кругляка составила 7 суток, а для предличинок осетровых - 6 суток (от выклева до полного рассасывания желточного мешка). Данные экспериментов приведены в таблице 3.

Таблица 3 Выживаемость и токсикометрические параметры фунгицидов для мальков бычка-кругляка и предличинок осетровых рыб Объект исследований Экспозиция опыта, сутки Концен-трация, мг/л Гибель, % Токсикометрические параметры, мг/л Экспозиция опыта, сутки Концентрация, мг/л Гибель, % Токсикометрические параметры, мг/л Пенфлуфен Мальки бычка-кругляка 3 0.25 0 ЛК₁₆=0.33 7 0.05 0 ЛК₁₆=0.07   0.5 40 ЛК₅₀=0.58   0.1 40 ЛК₅₀=0.21   1.0 100 ЛК₈₄=0.86   0.5 70 ЛК₈₄=0.61           1.0 100   Предличинки стерляди 2 0.05 0 ЛК₁₆=0.08 6 0.01 0 ЛК₁₆=0.023   0.1 25 ЛК₅₀=0.31   0.05 25 ЛК₅₀=0.081   0.5 60 ЛК₈₄=0.71   0.1 60 ЛК₈₄=0.28   1.0 100     0.5 100   Биксафен Мальки бычка-кругляка 3 0.5 0 ЛК₁₆=0.56 7 0.25 0 ЛК₁₆=0.56   1.0 50 ЛК₅₀=1.74   0.5 10 ЛК₅₀=0.88   5.0 80 ЛК₈₄=5.40   1.0 60 ЛК₈₄=2.68   10.0 100     5.0 100   Предличинки бестера 2 0.05 0 ЛК₁₆=0.45 6 0.1 0 ЛК₁₆=0.18   0.1 0 ЛК₅₀=0.99   0.5 30 ЛК₅₀=0.64   0.5 20 ЛК₈₄=5.48   1.0 80 ЛК₈₄=2.27   1.0 55     5.0 100     5.0 75             10.0 100          

Из таблицы 3 видно, что с увеличением концентраций фунгицидов снижалась выживаемость обоих видов рыб, на основе которой определены токсикометрические параметры фунгицидов.

Рассчитанные среднелетальные концентрации позволили определить, что по степени острой токсичности Пенфлюфен относится к группе особотоксичных пестицидов для предличинок стерляди (ЛК₅₀<0.5 мг/л) и высокотоксичен для мальков бычка-кругляка (0.5 мг/л<ЛК₅₀<5.0 мг/л), в то время как Биксафен высокотоксичен для бычковых и осетровых рыб.

Клиническая картина отравления мальков бычка и предличинок осетровых в растворах с высокими концентрациями фунгицидов проявлялась в смене двух стадий. Первичная стадия возбуждения, когда рыбы судорожно перемещались в боковом положении на дне экспериментальных сосудов, сменялась стадией резкого угнетения двигательной активности, снижалась реакция на внешние раздражители.

Тератологический анализ показал, что в растворах с концентрациями Пенфлуфена 0.1 мг/л и Биксафена 1.0 мг/л наблюдалось снижение линейного роста мальков бычка-кругляка на 5 и 8% соответственно, при этом их масса находилась на уровне контрольных величин.

Снижение темпа линейного и весового роста предличинок стерляди происходило с увеличением концентраций Пенфлуфена. Длина и масса предличинок стерляди, развивающихся в опытных растворах Пенфлуфена с концентрацией 0.05 мг/л, была ниже контроля на 16 и 11% соответственно. В концентрации 0.1 мг/л происходило существенное угнетение линейного и весового роста предличинок на 21 и 46% соответственно.

В растворах Биксафена с концентрациями 0.1 и 0.5 мг/л происходило увеличение массы предличинок бестера (8-12%), при этом их линейные размеры не отличались от длины контрольных рыб, что свидетельствует о нарушении водного обмена у подопытных предличинок бестера (таблица 4).

Таблица 4 Морфометрические параметры развития мальков бычка-кругляка и предличинок осетровых рыб при действии карбоксамидов Объект исследований Экспозиция опыта, сутки Концентрация, мг/л Линейный рост, мм Масса, мг Пенфлуфен Мальки бычка-кругляка 7 контроль 9.38±0.12 3.64±0.16 0.01 9.30±0.09 3.86±0.10 0.05 9.26±0.10 3.42±0.22 0.1 8.90±0.13* 3.52±0.11 Предличинки стерляди 6 контроль 13.41±0.115 14.68±0.371 0.01 12.16±0.296 14.42±0.450 0.05 11.31±0.267* 13.06±0.404* 0.1 10.65±0.316* 7.95±0.462* Биксафен Мальки бычка-кругляка 7 контроль 8.76±0.15 3.87±0.16 0.25 8.48±0.15 3.77±0.12 0.5 8.47±0.08 4.14±0.12 1.0 8.09±0.09* 4.12±0.16 Предличинки бестера 6 контроль 16.92±0.16 38.00±0.71 0.05 16.79±0.19 40.00±0.67 0.1 16.96±0.35 41.00±1.11* 0.5 16.73±0.16 42.50±0.70*

Патологии развития мальков бычка-кругляка наблюдали в течение 7 суток. Пенфлуфен в исследованном диапазоне концентраций 0.01-0.1 мг/л не оказывал тератогенного действия на мальков бычка-кругляка. При действии Биксафена в концентрации 1.0 мг/л у 20% опытных мальков бычков наблюдались искривления туловищного и хвостового отделов.

Патологии развития предличинок осетровых наблюдались в течение 6 суток. Пенфлуфен и Биксафен в концентрациях соответственно 0.01 мг/л и 0.1 мг/л тератогенного действия на предличинок осетровых рыб не оказывал. В растворах Пенфлуфена с концентрациями 0.05 и 0.1 мг/л у 13% и 75% предличинок стерляди соответственно наблюдались укороченные туловище и хвостовой стебель, водянка перикардиальной полости. В растворах Биксафена с концентрацией 0.5 мг/л у 43% предличинок бестера наблюдалось искривление туловища, развитие водянки перикарда и многочисленные кровоизлияния, наиболее интенсивные в области сердца.

Установленные пороги чувствительности осетровых и бычковых рыб к действию фунгицидов, представленные в таблице 5, позволили определить, что эмбрионы бычка-кругляка также чувствительны, как и эмбрионы осетровых к действию Биксафена и чуть менее чувствительны к действию Пенфлуфена. Мальки бычка-кругляка оказались более резистентные к действию обоих фунгицидов по сравнению с предличинками осетровых рыб.

Таблица 5 Пороговые концентрации фунгицидов для бычковых и осетровых рыб на ранних стадиях онтогенеза, мг/л Объект исследований Стадия развития Пенфлуфен Бикеафен пороговая концентрация, мг/л пороговая концентрация, мг/л Бычковые рыбы эмбрионы 0.5 0.5 мальки 0.1 1.0 Осетровые рыбы эмбрионы 0.1 0.5 предличинки 0.05 0.1

Аналогичным способом были проведены исследования чувствительности бычка-кругляка и осетровых рыб в период раннего онтогенеза к действию пестицидов разных химических классов. Данные исследований даны в таблице 6. Из таблицы 6 видно, что все исследованные пестициды оказывают токсическое влияние на оба вида рыб.

Проведенные эксперименты показали, что все исследуемые пестициды токсичны для обоих видов рыб. При этом различия показателей бычка-кругляка и осетровых рыб в период раннего онтогенеза к действию пестицидов разных химических классов были в пределах допустимых значений. Из этого следует, что бычки могут успешно использоваться в токсикологических исследованиях вместо осетровых рыб. Преимуществом использования бычков в качестве тест-объектов является их дешевизна, недифицитность, возможность тестировать природные воды различной степени солености, а также более высокая достоверность анализа, благодаря возможности выделения из тех водоемов, вода которых анализируется.

Все это доказывает перспективность использования бычка-кругляка в качестве тест-объекта для определения токсичности водных сред Азово-Черноморского бассейна.

Пример 3. Была проведена оценка синергического действия пестицидов, обнаруживаемых в воде Азовского моря, на ранний онтогенез бычка-кругляка. Химическое загрязнение среды обитания гидробионтов сложными смесями пестицидов с разной токсичностью и низкими концентрациями обусловливает возможность проявления их синергического действия, т.е. усиления поражающего эффекта на водные объекты при комбинированном воздействии, включая промысловые виды рыб. Синергизм может представлять наибольшую опасность для водных организмов и проявляться в потенцировании (эффект больше, чем суммация) комбинированного действия пестицидов.

Для проведения исследований использовались фунгициды Имазалил (имидазол), Ипродион (карбоксамид), Тебуконазол (триазол) и гербицид Этофумесат (бензофуран), из которых для экспериментов были приготовлены две смеси. В смеси 1 - количество пестицидов соответствовало их содержанию в воде Азовского моря и составляло (мг/л): 0.0008 Имазалил + 0.0002 Ипродион + 0.0021 Тебуконазол + 0.0005 Этофумесат. В смеси 2 - содержание перечисленных пестицидов было увеличено в 10 раз по сравнению со смесью 1, при этом концентрации компонентов в смеси не превышали ПДК для воды рыбохозяйственных водоемов. Смеси пестицидов готовились на морской воде Азовского моря.

Объектами оценки синергического действия комплекса пестицидов являлись эмбрионы и мальки бычка-кругляка (Neogobius melanostomus (Pallas)).

Сбор икры бычка-кругляка проводили из природного морского водоема (Азовское море) в период массового нереста. Оплодотворенную в естественных условиях икру на стадии ранней гаструлы снимали с субстрата и помещали в емкости с растворами смесей пестицидов и контрольные емкости с морской водой. Для оценки токсического действия комплекса пестицидов в смесях 7 и 2 на ранний онтогенез бычка-кругляка проводили два варианта опытов.

1 вариант - воздействие смесей пестицидов на эмбрионы со стадии ранней гаструлы и выдерживание до полного рассасывания желточного мешка мальков. Продолжительность эксперимента составляла 16 суток (11 суток - инкубационный период и 5 суток - после выклева).

2 вариант - воздействие смесей пестицидов на мальков, полученных в лабораторных условиях, сразу после выклева и выдерживание до полного рассасывания желточного мешка мальков. Экспозиция опыта - 7 суток.

Синергическое действие пестицидов в смесях 1 и 2 на развивающиеся эмбрионы бычка-кругляка оценивали по следующим показателям: выживаемость, длительность инкубационного периода, скорость прохождения стадий, патоморфологические признаки выклюнувшихся рыб. В конце опытов определяли темп линейного и весового роста мальков бычка-кругляка. В течение эксперимента наблюдали за их выживаемостью, фиксировали патологии развития.

Наблюдения за выживаемостью икры бычка-кругляка показали, что в растворах пестицидов смеси 1 гибель эмбрионов в течение инкубационного периода не превышала естественную гибель в контроле (таблица 7).

Таблица 7 Выживаемость эмбрионов бычка-кругляка при воздействии смесей пестицидов Длительность инкубационного периода Смесь пестицидов Общее количество эмбрионов в опыте Гибель экз. % 11 суток Контроль 60 7 11.67 Смесь 1 60 2 3.33 Смесь 2 60 6 10.0

Продолжительность этапов эмбриогенеза бычка-кругляка в опытных растворах со смесями 7 и 2 не отличалась от контроля вплоть до выклева. Единичный выклев бычка в обеих смесях начался с 12-часовой задержкой, но его продолжительность, также, как и в контроле, составила 2-е суток. Отклонений от нормы в строении выклюнувшихся мальков бычка, развивающихся в обеих смесях пестицидов, не выявлено.

Наблюдения за выживаемостью мальков бычка-кругляка в растворах смесей пестицидов показали, что ни в одном из опытных сосудов, как в 1-м (экспозиция 16 суток), так и во 2-м (экспозиция 7 суток) вариантах опытов, гибель не зафиксирована.

Результаты изучения линейного и весового роста мальков бычка-кругляка при действии смесей пестицидов в обоих вариантах опытов представлены в таблице 8.

Анализ морфометрических показателей показал, что мальки, эмбриональный период которых проходил в растворах смеси 1 (1-й вариант опыта), оказались крупнее, чем в контроле - их масса на 18% выше массы бычков из контроля. Средняя длина тела опытных мальков также несколько превышала контрольные величины, но достоверных отличий не выявлено.

Стимулирование весового роста мальков бычка-кругляка в данном случае можно рассматривать как адаптивно-компенсаторную реакцию организма рыб на ювенальном этапе развития на воздействие малых концентраций пестицидов.

Таблица 8 Показатели физиологического развития мальков бычка-кругляка при воздействии смесей пестицидов Объект исследований Смесь пестицидов Линейный рост, мм Масса, мг Мальки бычка-кругляка Экспозиция 16 суток Контроль 9.25±0.09 3.90±0.18 Смесь 1 9.46±0.12 4.64±0.06* Смесь 2 9.27±0.07 3.80±0.13 Экспозиция 7 суток после выклева Контроль 9.38±0.12 3.64±0.16 Смесь 1 9.09±0.13 3.37±0.19 Смесь 2 8.98±0.16* 3.17±0.13* Примечание - * - различия по сравнению с контролем достоверны (р<0.05)

В растворах смеси 2 в 1-м варианте опыта масса, и длина тела подопытных мальков находились на уровне контрольных величин. Следует отметить, что комбинированное действие пестицидов в смесях 7 и 2 в 1-м варианте опыта проявлялось в некоторой стимуляции развития мальков, так, например, желточный мешок у них полностью рассосался к 5-м суткам после выклева, тогда как во 2-м варианте опыта - лишь к 7-м.

Негативное действие комплекса пестицидов в смеси 2 на мальков бычка-кругляка было выявлено во 2-м варианте опыта и проявлялось в снижении темпов линейного (на 4%) и весового (на 13%) роста организмов относительно показателей контроля. При этом длина и вес подопытных мальков бычка-кругляка в растворах пестицидов смеси 1 находились на уровне контрольных величин.

Тератологический анализ бычка-кругляка проводился на ключевых стадиях эмбриогенеза. Фиксировались аномалии развития оплодотворенной икры и патоморфологические признаки выклюнувшихся эмбрионов. Патологии развития мальков бычка-кругляка оценивали по окончании рассасывания желточного мешка, рассчитывая процент уродливых особей.

Установлено, что у эмбрионов и мальков бычка-кругляка, содержавшихся в растворах пестицидов смеси 1 и смеси 2, патологий развития не отмечалось.

Анализ результатов проведенных экспериментов показал, что совокупное действие пестицидов Имазалила, Ипродиона, Тебуконазола, Этофумесата в концентрациях, соответствующих их содержанию в воде природных водоемов (смесь 1), не оказывало токсического действия на эмбриональное и раннее постэмбриональное развитие бычка-кругляка. При увеличении концентраций компонентов в смеси в 10 раз (но ниже их ПДК) синергическое действие пестицидов негативно сказывалось на росте и развитии бычка-кругляка (смесь 2).

Таким образом, установлено, что эмбрионы и мальки бычка-кругляка обладают высокой чувствительностью к токсикантам и могут быть рекомендованы для проведения токсикологических исследований водоемов Азово-Черноморского бассейна, имеющих рыбохозяйственное значение, как пресных, так и морских. Этот способ экономичен благодаря использованию недефицитного и дешевого тест-объекта.

Кроме того, при проведении анализа токсичности вод Азово-Черноморского бассейна возможно выделение этих тест-объектов непосредственно из тестируемых водоемов, что повысит достоверность информации при оценке токсичности этих вод.

Использованные источники

1. И.Ю. Малыгина, А.М. Кацев. Светящиеся бактерии Черного и Азовского морей. Экология моря. 2003. Вып.64.

2. ТУ 6-09-20-236-93.

3. Патент на изобретение РФ №2346035, МКИ C12N 1/20.

4. Патент на изобретение РФ №2342434, МКИ C12N 1/20.

5. И.В. Ходаков. Метод использования ранних эмбрионов черноморской мидии для биотестирования при мониторинге прибрежных зон северозападного шельфа // Тезисы всероссийской конференции «Экосистемы морей России в условиях антропогенного пресса (включая промысел)», Астрахань, 20-22 сентября, 1994. Астрахань, 1994. - С.352-353.

6. АС СССР №1270699, МПК⁴ G01N 33/18, C02F 3/32.

7. Effects of sewage sludge on marine fish embryos and larvae / Costello Mark J., Gamble John С. // Mar. Environ, res. - 1992, - 33, 1. - P.49-74.

8. Патин С.А. Влияние загрязнения на биологические ресурсы и продуктивность Мирового океана. - М.: «Пищевая промышленность», 1979. - С.157-160.

9. Воробьева А.А. Биологические последствия совместного воздействия нефтепродуктов и ХОП на эмбриогенез осетровых рыб // Тез. докл. 1-й науч.-практич. конф. «Проблемы современного товарного осетроводства», Астрахань, 24-25 марта, 1999. - Астрахань, 1999. - С.120-121.

10. Костров Б.П., Дохолян В.К. Методика оценки влияния загрязнителей водной среды на эмбриогенез рыб // Методы ихтиотоксикологических исследований: Тезисы докладов Первого Всесоюзного симпозиума по методам ихтиотоксикологических исследований Ленинград, октябрь 1987, - Л., 1987. - С.65-67.

11. Патент РФ №2215290, МПК⁷ G01N 33/18.

12. Патент РФ №2446396, МКИ G01N 33/18 (прототип).

Изобретение относится к водной экологии и токсикологии и может быть использовано для оценки токсичности вод Азово-Черноморского бассейна. В способе тест-объекты выдерживают в тестируемых растворах; регистрируют физиологический ответ и о степени токсичности загрязнителя судят по токсикологическим параметрам. Новым является использование в качестве тест-объектов бычков- кругляков на ранних стадиях онтогенеза, икру которых, оплодотворенную в естественных условиях, собирают в природном водоеме. Технический результат предлагаемого изобретения заключается в расширение числа тест-объектов для оценки токсичности морских и пресных вод Азово-Черноморского бассейна. 8 табл., 3 пр.

Способ оценки токсичности загрязнителей вод Азово-Черноморского бассейна, в котором тест-объекты выдерживают в тестируемых растворах, регистрируют физиологический ответ и по токсикологическим параметрам судят о степени токсичности загрязнителя, отличающийся тем, что в качестве тест-объектов используют бычка-кругляка на ранних стадиях онтогенеза, икру которого, оплодотворенную в естественных условиях, собирают в природном водоеме.