СПОСОБ СТАБИЛИЗАЦИИ УЛЬТРАКОНЦЕНТРАТА ГРИБНОЙ β -ГАЛАКТОЗИДАЗЫ Российский патент 1996 года по МПК C12N9/96 C12N9/38 

Настоящее изобретение относится к способу получения ферментных препаратов для гидролиза лактозы в молочной сыворотке.

Известно использование в качестве биокатализатора для гидролиза лактозы в молочной сыворотке сухих форм грибных бета-галактозидаз, которые в виде порошка добавляются в молочную сыворотку (Cristian E, Sorensen S. Получение и применение лактозы. Патент США N 4007283, 1976 г.Guiraud R, Jacgues E. и др. Способ использования молочной сыворотки. Заявка Франции 2309154, 1976 г. ).

Сухие формы хорошо хранятся, однако при использовании обладают рядом недостатков пылят при растворении, вызывая аллергические реакции, недостаточно равномерно растворяются, что приводит к увеличению дозировки препарата, и, главное, дороги с экономической точки зрения, так как сушка является чрезвычайно энергоемким процессом, к тому же при сушке частично теряется активность препарата.

Для промышленной сушки используется жидкая форма ферментного препарата в виде ультраконцентрата грибной бета-галактозидазы с массовой долей сухих веществ ( 10 12 ) Такой ультраконцентрат может быть использован для гидролиза лактозы в молочной сыворотке, однако он чрезвычайно нестабилен в хранении и уже через двое суток, даже при температуре ( 4 10)^oC, подвергается микробиологическому заражению. Кроме того, низкая массовая доля сухих веществ в ультраконцентрате делает нецелесообразным его низкотемпературное ( при отрицательных температурах ) хранение и транспортировку.

Получение же жидких форм бета-галактозидаз с длительных сроком хранения в неконтролируемых температурных условиях неизвестно.

Известно использование в качестве биокаталиэаторов для гидролиза лактозы в молоке жидких форм дрожжевых бета-галактозидаз под торговыми марками Jactozym и Maxilact (Jactozym. Рекламный материал фирмы Novo. Голландия; Maxilact Рекламный материал фирмы Gist Brocades, Голландия ).

Недостатками этих препаратов является невозможность их хрипения в неконтролируемых температурных условиях и большая дозировка при гидролизе молочной сыворотки. Препараты Jactozym и Maxilact хранят при температуре ( 3 5 )^oC (Jactozym) и (0. 5)^oC (Maxilact) в течение трех месяцев с момента получения.

Целью предлагаемого изобретения является обеспечение длительного срока хранения жидкой формы ( ультаконцентрата ) грибной бета-галактозидазы в неконтролируемых температурных условиях.

Указанная цель достигается концентрированием ультраконцентрата грибной бета-галактозидазы до массовой доли сухих веществ (20 25 ) и добавлением к сконцентрированному раствору стабилизатора ( консерванта ) сорбиновой кислоты в количестве ( 0,02 0,04)% к массе жидкой формы.

Для достижения указанной цели раствор бета-галактозидазы после ультраконцентрирования подвергают дополнительному концентрированию до массовой доли сухих веществ ( 20 25 )% используя известные способы концентрирования ( например, вакуум выпаривание,вымораживание ), и затем добавляют сорбиновую кислоту в количестве (0,02. 0,04 ) к массе концентрата.

Раствор грибной бета-галактозидазы после ультраконцентрирования с массовой долей сухих веществ ( 10 12 )% и активностью (110 130 ) Е/мл заливают в полиэтиленовую канистру и замораживают в холодильной камере при температуре не выше минус 5^oC. После полного замораживания емкость вынимают из камеры и, сняв колпачок, помещают при комнатной температуре в перевернутом состоянии на стеклянную или пластмассовую воронку, под которой помещается сборник. В ходе постепенного размораживания собирают фракцию жидкой формы грибной бета-галактозидазы с активностью ( 280 320 ) Е/мл и массовой долей сухих веществ ( 20 25 )
Более низкая массовая доля сухих веществ в ультраконцентрате грибной бета-галактозидазы делает, как уже указывалось, неэкономичным его хранение и транспортировку. С другой стороны, молочная сыворотка перед гидролизом лактозы подвергается концентрированию до массовой доли сухих веществ ( 20 25 ) и, таким образом, упрощается расчет дозы внесения ферментного препарата. Увеличение же массовой доли сухих веществ в ультраконцентрате свыше 25% ведет к увеличению энергозатрат на концентрирование и необходимости использования дополнительного технологического оборудования ( вакуумвыпарных установок ), в то время как указанный диапазон концентраций можно получить, например, вымораживанием.

В качестве стабилизатора предложено использовать сорбиновую кислоту так, чтобы ее массовая доля в жидкой форме грибной бета-галактозидазы составляла ( 0,02 0.04 )% Такая концентрация сорбиновой кислоты является необходимой и достаточной для получения стабилизированной жидкой формы грибной бета-галактозидазы, способной храниться в неконтролируемых температурных условиях в течение шести и более месяцев без значительной потери активности и без микробиологического заражения.

При массовой доле сообиновой кислоты в ультраконцентрате фермента менее 0,02 через 2-3 месяца обнаруживается микробиологическое выражение при сохранении ферментативной активности. При массовой доле сорбиновой кислоты более 0,04% микробиологического заражения не возникает, но происходит падение ферментативной активности на ( 40 50) в течение первого месяца хранения, в последующем активность продолжает падать.

Испытание других консервантов не принесло желаемых результатов: например, при использовании в качестве консерванта бензойной кислоты через три месяца обнаружена микробная зараженность при сохранении уровня бeта-галактозидазной активности.

Устранение в технологической схеме получения ферментного препарата грибной бета-галактозидазы стадии выслушивания приводит к упрощению технологического процесса, уменьшению расхода энергоносителей и снижению себестоимости препарата, а также снижает загрязненность рабочих мест и окружающей среды.

Пример 1. 3 л раствора грибной бета-галактозидазы после ультраконцентрирования с массовой долей сухих веществ 10% И и 10% и активностью 110 Е/мл заливают в полиэтиленовую канистру и замораживают в холодильной камере при температуре не выше минус 5^oC. После полного замораживания емкость вынимают из камеры и, сняв колпачок, помещают при комнатной температуре в перевернутом состоянии на стеклянную или пластмассовую воронку, под которой помещается сборник. В ходе постепенного размораживания собирают фракцию 500 мл жидкой формы грибной бета-галактозидазы с активностью 280 Е/мл и массовой долей сухих веществ 20%
В пять колб помещают по 100 мл отобранной фракции и добавляют по 10, 20, 30, 40 и 50 мг сорбиновой кислоты соответственно. Колбы закрывают пробками и хранят в нерегулируемых температурных условиях ( 15 30 )^oC в зависимости от времени года Результаты хранения представлены в таблице.

Предлагаемый способ стабилизации жидкой формы грибной бета - галактозидазы позволяет обеспечить ее хранение в неконтролируемых температурных условиях, уменьшить расход ферментарного препарата по сравнению с сухой формой при гидролизе лактозы сыворотки и снизить загрязнение окружающей среды. ТТТ1

Предложен способ стабилизации жидкой формы грибной бетагалактозидазы, заключающийся в ее концентрировании до массовой доли сухих веществ (20... 25)% и последующем внесении сорбиновой кислоты в количестве (0,02...0,04)% к массе жидкой формы. Предложенный способ стабилизации жидкой формы грибной бетагалактозидазы позволяет обеспечивать ее хранение в неконтролируемых температурных условиях, уменьшить расход ферментного препарата по сравнению с сухой формой при гидролизе лактозы сыворотки и снизить загрязнение окружающей среды. 1 табл.

Способ стабилизации ультраконцентрата грибной β- галактозидазы, заключающийся в том, что его концентрируют до массовой доли сухих веществ 20 - 25 мас. с последующим внесением сорбиновой кислоты в количестве 0,02 0,04 мас.