УСТРОЙСТВО ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ПРОЦЕССА АГРЕГАЦИИ ТРОМБОЦИТОВ Российский патент 1996 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к устройствам для анализа биологических материалов с использованием физических методов, в частности, для исследования суспензии клеток при агрегации путем измерения их диэлектрической проницаемости.

При диагностике и в ходе контроля лечения болезней, связанных с нарушением свертывающей системы крови, состояние которой зависит от агрегационной способности тромбоцитов, необходимы устройства,позволяющие точно и надежно, с высокой степенью достоверности, регистрировать кинетику агрегации тромбоцитов, что представляет собой сложную техническую задачу.

Известны устройства для исследования агрегации тромбоцитов, содержащие измерительную ячейку, мешалку, источник света, оптическую систему, фотоэлемент и регистрирующее устройство ( см. а.с. СССР N 1024841, G 01 N 33/48, 1983; пат. США N 4522494, G 01 N 33/48, 1985). Указанные устройства позволяют регистрировать изменение оптической плотности (светорассеяния) плазмы, обогащенной тромбоцитами, при агрегации. Недостатком указанных устройств является низкая точность определения агрегационной способности тромбоцитов, т.к. изменение регистрируемой оптической плотности зависит не только от образования агрегатов, но также и от изменения формы тромбоцитов, их размеров, концентрации, состава и оптических свойств среды (плазмы крови), что вносит существенную погрешность в процессе измерения. Различные авторы приводят значения погрешности измерений агрегации тромбоцитов оптическими устройствами от 5% до 20%
Известны устройства электронные агрегометры, содержащие измерительную ячейку, специальные электроды и электрическую схему для измерения импеданса или электрической проводимости образца разбавленной цельной крови при воздействии индуцирующих агрегацию агентов (см. Cardinal D.C. Flower R.J.The electronic aggregometer. A novel device for assessing platelet behaoior in blood Y. Pharmacol. Methods. 1980. N 3,P.135-158; з.ЕПВ N 0164473, G 01 N 33/48, 1985).

Недостатком указанных устройств также является недостаточно высокая точность измерения около 10% При этом агрегацию тромбоцитов определяют по изменению электрических характеристик цельной крови, что не позволяет определять величину параметров самого процесса агрегации тромбоцитов, поскольку активированными тромбоцитами выделяются наружу факторы свертывания крови, которые взаимодействуют с другими форменными элементами крови и инициируют образование агрегации тромбоцитов.

Известно также устройство для исследования агрегации тромбоцитов, содержащее измерительную трубку, мешалку и установку для измерения времени протонной магнитной релаксации импульсными методами ЯМР образца плазмы крови, обогащенной тромбоцитами (см.а.с.СССР N 663384, А 61 В 10/00, G 01 N 33/48, 1978).

Недостатком указанного устройства является значительное время между двумя последующими измерениями (10-15 с), что не позволяет с достаточной степенью достоверности и надежности регистрировать кинетику агрегации, особенно при быстропротекающем процессе. Еще одним недостатком является недостаточно высокая точность измерений от 1% до 5% в зависимости от величины относительных изменений измеряемых параметров.

Недостатки указанных выше устройств частично устранены в устройстве для исследования агрегации тромбоцитов (см. а.с. СССР N 874033, А 61 В 10/00, 1981). Указанное устройство является наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к заявляемому устройству и выбрано в качестве прототипа. Устройство содержит установку для диэлектрических измерений в 3-ем диапазоне длин волн и измерительную трубку, помещенную в датчик (резонатор) установки. Образец плазмы крови, содержащий тромбоциты, набирают в тонкую (радиус 1 мм) измерительную трубку объемом 0,3 мл и помещают в резонатор установки для диэлектрических измерений, после чего измеряют диэлектрическую проницаемость образца.

Недостатком этого устройства является то, что оно не позволяет достоверно наблюдать кинетику изменения диэлектрических параметров в процессе агрегации тромбоцитов. Это обусловлено тем, что для образования агрегатов тромбоцитов необходимо постоянное интенсивное перемешивание образца (500-1000 об/мин), что невозможно обеспечить в тонкой и длинной (капиллярной) измерительной трубке. Применять для этих целей трубки большего диаметра также нельзя, поскольку в плазме с тромбоцитами содержится более 90 воды, которая обладает большими диэлектрическими потерями, и, чтобы обеспечить минимальное поглощение энергии электромагнитного поля и связанный с ним тепловой эффект, образец должен быть возможно меньшего диаметра (см. например. Изменение диэлектрических констант водных растворов в 3-ем диапазоне длин воли. Гаташ С. В. и др. Вестн.Харьк. ун-та, 1987, N 307, с.83-86). Поэтому при использовании устройства для определения агрегационной способности тромбоцитов измеряют диэлектрическую проницаемость образца до агрегации тромбоцитов и после агрегации, набирая его в измерительную трубку из внешнего сосуда, в котором перемешивают образец и куда добавляют индуктор агрегации. Можно проводить измерения и в процессе агрегации, однако на процедуру набора образца в трубку, установку ее в резонаторе и последующую н стройку прибора требуется 30-40 с. Кроме того, это приводит к снижению точности измерения из-за погрешности установки трубки в резонаторе и сравнительно длительному нахождению образца в трубке без перемешивания.

Целью изобретения является повышение точности измерения агрегационной способности тромбоцитов за счет обеспечения возможности автоматического дозирования процесса измерений.

Поставленная цель достигается тем, что в известном устройстве для наследования процесса агрегации тромбоцитов, содержащем установку для диэлектрических измерений в СВЧ-диапазоне и измерительную трубку, помещенную в датчик (резонатор) установки, согласно изобретению, дополнительно введены смесительная ячейка, система автоматического набора образца в измерительную трубку и приспособление для промывки и продувки трубки, при этом измерительная трубка жестко закреплена в датчике (резонаторе) установки и соединена одним концом со смесительной ячейкой, а другим с системой автоматического набора образца и приспособлением для промывки и продувки трубки.

Смесительная ячейка выполнена в виде полиэтиленовой цилиндрической кюветы, в нижней части которой расположена магнитная мешалка.

Блок автоматического набора образца содержит шприц, поршень которого выполнен с возможностью возвратно-поступательного движения с помощью двух электромагнитов, блок управления электромагнитами и регулируемые фиксаторы хода поршня.

Узел для промывки и продувки содержит комплект взаимозаменяемых баллонов для подачи жидкости или воздуха и гибкий шланг, подсоединяемый через вентиль и делитель к измерительной трубке.

Наличие смесительной ячейки, соединенной с одним концом измерительной трубки, жестко закрепленной в резонаторе, и системы автоматического набора образца, соединенной с другим концом измерительной трубки, к которому также подсоединено приспособление д я промывки и продувки трубки, реализуют возможность многократного и быстрого отбора пробы из смесительной ячейки в измерительную трубку в течение процесса агрегации небольших объемов (приблизительно 0,05 мл³) смеси, регистрации ее диэлектрических параметров и возвращения ее в смесительную ячейку. При этом не происходит существенного нарушения хода процесса, т.к. время набора, измерения и сброса в кювету в предлагаемом варианте выполнения всех основных элементов устройства составляет 0,1-1 с, что значительно меньше времени агрегации (приблизительно 600 с), а объем, отбираемый для каждого измерения пробы, не более 0,05 объема тромбоцитарной взвеси в кювете (1 см³). Агрегационная способность тромбоцитов в случае индуцированной агрегации определяется по изменению параметров взвеси в начальный момент времени после добавления индуктора и после окончания агрегации. Критерием сравнения при этом является точность определения разницы этих показаний ( в данном случае диэлектрической проницаемости). Жесткое закрепление трубки в датчик резонатора и наличие автоматической системы набора образца, а также системы промывки и продувки трубки позволяет исключить погрешность установки измерительной трубки в резонаторе и существенно уменьшает погрешность за счет исключения нарушения процесса агрегации, что составляет приблизительно 10-15% общей погрешности измерений и повышает точность измерения агрегационной способности на эту величину по сравнению с прототипом.

Выполнение смесительной ячейки в виде полиэтиленовой цилиндрической кюветы с расположенной в ее нижней части магнитной мешалкой обеспечивает возможность интенсивного перемешивания образца 500-1000 об/мин с дальнейшей подачей в тонкую измерительную трубку.

Блок автоматического набора образца в измерительную ячейку, выполненный в виде шприца и поршня управляемого электромагнитами, позволяет обеспечить периодическую и быструю подачу образца в измерительную трубку и выталкивание его обратно. Строго дозированный объем образца, подаваемого в измерительную трубку, изменяется с помощью фиксаторов, которые ограничивают ход поршня.

Выполнение узла для промывки и продувки трубки, содержащим взаимозаменяемые баллоны для подачи жидкости или воздуха через гибкий шланг в измерительную трубку позволит быстро промывать и высушивать ее (за время до 1 мин) без изменения своего положен я в резонаторе установки, что повышает точность измерений в результате обеспечения идентичных начальных условий для различных образцов.

Авторам неизвестны технические решения, имеющие совокупность существенных признаков, сходных с признаками, отличающими заявляемое решение от прототипа.

Это дает основание считать, что заявляемое техническое решение соответствует критерию "существенные отличия".

На чертеже показана общая схема устройства для исследования агрегации тромбоцитов.

Устройство включает в себя установку для диэлектрических измерений 1, датчик (резонатор) 2, в котором жестко закреплена измерительная трубка 3, нижний конец которой соединен со смесительной ячейкой 4 с магнитной мешалкой 5, в а верхний посредством гибкого шланга 6 и делителя потока 7 через микровентили 8 с баллоном 9 для промывки и продувки трубки и блок 10 автоматического набора образца. Блок 10 содержит шприц 11, поршень 12 которого выполнен с возможностью возвратно-поступательного движения, осуществляемого с помощью двух электромагнитов 13 и подвижной металлической пластинки 14. Ход поршня цилиндра ограничивается двумя регулирующими фиксаторами 15. Управление электромагнитами осуществляется посредством блока 16.

В предпочтительной форме выполнения устройства в качестве установки 1 для диэлектрических измерений использован диэлектрометр 3-см диапазона, включающий в себя: генератор, в котором в качестве источника СВЧ-колебаний использован клистрон типа К-54, блок АПЧ для непрерывной подстройки частоты СВЧ-генератора по частоте измерительного резонатора (датчика) 2, содержащего измерительную трубку 3, прецизионную систему измерения частоты на базе частотомера типа 43-34-а с приставкой ЯЗ-4-51 и преобразователем типа 4-5-13; регистрирующее устройство (самописец или ЦПУ). Интервал времени между считываниями на транскрипторе ЦПУ соответствует временным интервалам набора и выпуска образца в измерительной трубке. Техническая реализация установки 1 для диэлектрических измерений может быть также несколько иной (см. например, Николаев О.Т. и др. Диэлектрометр 3-см диапазона, Вести. Харьк.ун-та, 1983, 248, 0.85-86 или С.В.Гаташ и др. Измерение диэлектрических констант водных растворов в 3-см диапазоне длин волн, Вестн.Харьк. ун-та, 1987, N 307, с. 83-86), что не имеет принципиального значения для достижения цели изобретения.

Смесительная ячейка 4 выполнена в виде полиэтиленовой цилиндрической кюветы с рабочим объемом 0,3-0,5 мл, в нижней части которой расположена магнитная мешалка 5. В предпочтительной форме может быть использована промышленно выпускаемая " Мешалка магнитная ММ-5" ТУ 25-11.834-80 выпуска 1985, питающаяся от сети 220 в 50 Гц, что обеспечивает постоянное перемешивание образца в заданном объеме в режиме 600-1000 об/мин.

Узел 17 для промывки и продувки трубки 3 в предпочтительном варианте содержит баллон 9 для подачи промывочной жидкости (дистиллированной воды), который может быть выполнен в виде шприца, груши или упругого сосуда, и подсоединяться через гибкий шланг 6, правый или левый вентили 8 и делитель 7 потока к измерительной трубке 3. Баллон для подачи воздуха (можно подогретого) выполнен в виде груши или насоса ( на чертеже не показаны).

Блок 10 автоматического набора образца содержит шприц 11, поршень 12 которого выполнен с возможностью возвратно-поступательного движения с помощью электромагнитов 13 (например, типа АМ3, МКУ -48РА И.501.060) и подвижной металлической пластины 14. Блок 16 управления электромагнитами в предпочтительном варианте содержит стандартный генератор импульсов, например, Г3-114, Г5-7А или отметчик времени П68401, набор последовательно соединенных делителей частоты и управляющий триггер с выходными транзисторами типа КТ-604, соединенных с источником питания УИП-2, который в свою очередь питает электромагнит 13.

Устройство работает следующим образом. Образец исследования плазма крови, обогащенная тромбоцитами, помещается в смесительную ячейку 4. Туда же добавляются индукторы агрегации или другие вещества. Далее образец находится в смесительной ячейке при постоянном перемешивании посредством магнитной мешалки 5 в режиме перемешивания, соответствующего стандартным агрегометрам 600-1000 об/ мин. Подача образца в измерительную трубку 3 осуществляется путем включения одного из электромагнитов 13, в результате чего перемещается пластинка 14, соединенная с поршнем 12, продвигая его в направлении, при котором увеличивается внутренний объем шприца 11 и исследуемый образец втягивается в измерительную трубку 3. Объем образца, который набирается в трубку 3, определяется ходом поршня 12, зависящим от величины перемещения пластины 14, регулируемой с помощью фиксаторов 15 и составляет 0,03-0,1 мл в зависимости от радиуса трубки 3. Далее осуществляется измерение диэлектрической проницаемости образ а путем автоматической регистрации диэлектрической постоянной за счет измерения сдвига собственной резонансной частоты. Указанные измерения осуществляют в установке 1. Регистрирующим элементом, как указывалось выше, является цифровой частотомер типа 43-34, информация с которого считывается транскриптором ЦПУ. Интервал времени между считываниями задается на транскрипторе в соответствии с временными интервалами набора и выпуска образца в измерительной трубке.

Временной интервал с учетом времени на подачу образца в измерительную трубку 3 и выталкивания его в смесительную ячейку 4 составляет 1-3 с. После проведения измерения диэлектрической проницаемости образца один из электромагнитов 13 выключается и одновременно включается другой электромагнит, перемещая пластинку 14 и поршень 12 шприца 11 в противоположном направлении, что приводит к уменьшению объема шприца 11 и выталкиванию образца из измерительной трубки 3 обратно в смесительную ячейку 4. Более подробно работа системы 10 автоматического набора образца выглядит следующим образом.

Управление магнитами 13 осуществляется с помощью блока 16, содержащего генератор стандартных импульсов, набор последовательно соединенных делителей частоты и управляющий триггер. С выхода генератора на блок делителей частоты постоянно подается последовательность импульсов одной частоты следования. В зависимости от необходимой временной программы измерений управляющий триггер подключается к соответствующим выходам набора делителей частоты, что определяет интервалы времени его нахождения в каждом из двух возможных состояний. На выходные транзисторы (КТ-604) управляющего триггера подается напряжение +100 в от источника питания УИП-2, которое поступает на обмотку одного из двух электромагнитов 13 (в зависимости от состояния триггера).

Таким образом, заданная программно-временная последовательность переключения триггера из одного состояния в другое и обратно, определяет временные интервалы между подачей и выпуском образца в измерительной трубке. Например, при подаче двух последовательностей импульсов с различных выходов блока делителей, одна с частотой следования 1 с, а другая 3с, на два входа управляющего триггера (через логическую систему совпадения) триггер будет находиться в одном состоянии 1 с, а в другом 2 с (полный цикл 3 с). Соответственно в течение 1 с образец будет находиться в измерительной трубке, а в течение двух последующих секунд трубка будет пустая.

Время собственно набора и выхода образца в смесительную ячейку 4 составляет 0,1-0,5 с. Затем смесительная ячейка 4 заменяется, а измерительная трубка 3 остается закрепленной в резонаторе 2, промывается и высушивается. Для этого закрывают правый вентиль 8 и открывают левый вентиль 8, к концу гибкого резинового шланга присоединяют баллон для подачи жидкости 9, например, шприц, грушу или упругий сосуд, заполненного промывочной жидкостью (дистиллированной водой), и подают ее через гибкий шланг 6, левый вентиль 8 и делитель 7 в измерительную трубку 3 (при промывке жидкость вытекает через нижний открытый конец трубки 3), затем баллон с жидкостью отсоединяют от шланга 6 и на его место присоединяют баллон для подачи воздуха (например, резиновую грушу или насос), с помощью которого продувают через измерительную трубку 33 воздух (можно подогретый). В результате таких операций измерительная трубка быстро промывается и высушивается (за время до 1 мин) без изменения своего положения в резонаторе установки, что повышает точность измерений в результате обеспечения идентичных начальных условий для различных образцов ( устранение погрешности установки трубки в резонаторе).

Таким образом, заявляемое устройство обеспечивает наблюдение кинетики агрегации с интервалами между двумя измерениями до 1 с без нарушения хода процесса агрегации (длительность времени агрегации составляет приблизительно 600 с) для строго определенной для каждого измерения пробы (не более 0,05 объема тромбоцитарной взвеси в кювете объемом до 1 см ³. При этом повышается точность измерения (по сравнению с прототипом) за счет устранения погрешности, вызванной неточностью установки измерительной трубки в датчике (в прототипе она составляет 10-15% от общей погрешности измерений), а также за счет увеличения числа измеряемых за единицу времени значений диэлектрической проницаемости образца.

Изобретение относится к устройствам для анализа биологических материалов с использованием физических методов, в частности, для определения изменения диэлектрической проницаемости суспензии клеток при агрегации. Изобретение обеспечивает возможность наблюдения кинетики процесса с одновременным повышением точности определения агрегационной способности тромбоцитов, что достигается периодической подачей образца из смесительной ячейки в жестко закрепленную в датчике измерительной СВЧ-установки трубку с помощью блока автоматического набора образца. Устройство содержит установку 1 для диэлектрических измерений в СВЧ-диапазоне и измерительную трубку 3, помещенную в датчик /резонатор/ 2 установки. Новым в устройстве является то, что оно содержит смесительную ячейку 4, выполненную в виде цилиндрической полиэтиленовой кюветы с магнитной мешалкой 5, блок 10 автоматического набора образца со шприцем 11, двумя электромагнитами 13, блоком управления 16 и фиксации хода поршня шприца, узел для промывки и продувки трубки с взаимозаменяемыми баллонами 9 для подачи жидкости и воздуха. 3 з.п. ф-лы, 1 ил.

1. Устройство для исследования процесса агрегации тромбоцитов, содержащее установку для диэлектрических измерений в СВЧ-диапазоне и измерительную трубку, помещенную в датчик, отличающееся тем, что, с целью повышения точности измерения агрегационной способности тромбоцитов, за счет обеспечения возможности автоматического дозирования процесса измерений, в него введены смесительная ячейка, блок автоматического набора образца в измерительную трубку и узел для промывки и продувки трубки, при этом измерительная трубка жестко закреплена в датчике в вертикальном положении и соединена одним концом со смесительной ячейкой, а другим с блоком автоматического набора образца и узлом для промывки и продувки трубки. 2. Устройство по п.1, отличающееся тем, что смесительная ячейка выполнена в виде полиэтиленовой цилиндрической кюветы, в нижней части которой расположена магнитная мешалка. 3. Устройство по п.1, отличающееся тем, что блок автоматического набора образца содержит шприц, поршень которого выполнен с возможностью возвратно-поступательного перемещения с помощью двух электромагнитов, узел управления электромагнитами и регулируемые фиксаторы хода поршня. 4. Устройство по п.1, отличающееся тем, что узел для промывки и продувки содержит комплект взаимозаменяемых баллонов для подачи жидкости или воздуха, с помощью гибкого шланга подсоединяемых через вентиль и делитель к измерительной трубке.