СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ НАЧАЛЬНОЙ АГРЕГАЦИИ ТРОМБОЦИТОВ (ВАРИАНТЫ) И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ (ВАРИАНТЫ) Российский патент 1996 года по МПК G01N33/48 A61B5/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к способам исследования крови и устройствам для их осуществления.

В медицине существует большая потребность в способах оценки функциональной активности тромбоцитов. Активация тромбоцитов, приводящая к их агрегации, вступает в качестве одной из важнейших причин тромбозов. Агрегацию тромбоцитов необходимо исследовать при разработке противотромбоцитарных лекарств для профилактики и лечения опосредованных тромбоцитами тромбозов, при разработке способов диагностики тромботических состояний. Способность тромбоцитов к агрегации необходимо также контролировать при консервировании и хранении тромбоцитарной массы, предназначенной для борьбы с кровотечениями.

Известны турбидиметрический способ и турбидиметрические устройства (турбидиметры агрегометры) для исследования агрегации тромбоцитов (Born, G. V.P. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal. "Nature", 1962. o. 194, o 4832, pp. 927 929).

Способ заключается в том, что для суспензии тромбоцитов определяют коэффициент пропускания света и при этом анализируют суммарный пучок света, прошедшего через образец тромбоцитов и без отклонения и с значительным отклонением от первоначального направления распространения. Способность тромбоцитов к агрегации оценивают по величине увеличения коэффициента пропускания света, образование агрегатов обнаруживается только через значительное время после начала действия индуктора агрегации. Способ позволяет исследовать формирование крупных агрегатов, т.е. вторичную агрегацию. В качестве прототипа выбраны Способ анализа агрегации тромбоцитов и устройство для его осуществления, описанные в заявке РСТ 89/10562. Cпособпрототип заключается в том, что через суспензию тромбоцитов пропускают пучок света, измеряют параметры флуктуаций интенсивности прошедшего света, возникающих при перемешивании образца тромбоцитов, на основании этих параметров определяют средний размер агрегатов.

Устройство-прототип содержит осветительную систему, кювету для образца тромбоцитов, систему для перемешивания образца тромбоцитов, систему для регистрации прошедшего света, которая состоит из детектора света и электронного блока анализа характеристик сигнала детектора.

Способ и устройство имеет тот недостаток, что для измерения параметров флуктуации интенсивности прошедшего света требуется сложное и дорогостоящее оптико-электронное устройство, включающее дополнительные блоки учета шумовых компонентов, схему подавления флюктуаций анализируемого сигнала. Кроме того, необходим контроль концентрации тромбоцитов в каждом образце.

Задача изобретения состояла в создании простого оптического способа и устройства для реализации этого способа, предназначенных для исследования начальной агрегации тромбоцитов.

Эта задача, в одном случае, решается тем, что в способе исследования агрегации через суспензию тромбоцитов пропускают параллельный пучок света, измеряют параметры прошедшего через эту суспензию света, но в отличие от прототипа выделяют пучок света, прошедшего через суспензию тромбоцитов с отклонением от первоначального направления распространения в интервале углов, входящих в диапазон от 0,5 до 7 градусов. Агрегационную способность тромбоцитов устанавливают по величине интенсивности выделенного пучка света.

Это достигается за счет того оптического эффекта, что образование мелких тромбоцитарных агрегатов вызывает увеличение интенсивности света, изменившего направление распространения в результате рассеяния и распространяющегося под малыми углами.

Задача изобретения решается в другом случае тем, что в способе исследования агрегации через суспензию тромбоцитов пропускают параллельный пучок света, измеряют параметры прошедшего света, но в отличие от прототипа выделяют пучок света, прошедшего через суспензию тромбоцитов без отклонения от первоначального направления распространения, измерения проводят два раза без перемешивания и при перемешивании суспензии тромбоцитов. Агрегационную способность тромбоцитов определяют по разности коэффициентов пропускания, полученных при первом и втором измерениях.

Последнее достигается за счет того, что образование мелких тромбоцитарных агрегатов влечет за собой увеличение коэффициента мутности, и поэтому коэффициент пропускания суспензии тромбоцитов, измеряемый с использованием только пучка света, прошедшего через эту суспензию без изменения направления распространения, уменьшается в период начальной агрегации. Агрегации тромбоцитов предшествуют процессы округления клеток и образования псевдоподий. Эти изменения формы клеток приводят к небольшому уменьшению коэффициента пропускания суспензии тромбоцитов. В способе исследования предусматривается измерения проводить дважды: в отсутствие перемешивания суспензии тромбоцитов, когда имеет место уменьшение коэффициента пропускания только вследствие изменения формы клеток, и второй раз при перемешивании, когда коэффициент пропускания еще снижается за счет агрегации клеток.

Задача изобретения решается и тем, что устройство для исследования агрегации тромбоцитов, имеющее, как и в прототипе, осветительную систему, образующую параллельный пучок света, кювету, систему перемешивания образца тромбоцитов, детектор света, блок измерения сигнала детектора света, содержит в одном случае дополнительную диафрагму, расположенную за кюветой, и круглый экран, расположенный за диафрагмой перед детектором света. Диафрагма имеет круглое отверстие переменного размера, экран подвижен вдоль оптической оси. Между краем круглого отверстия диафрагмы и краем экрана проходит световой пучок, который распространяется с отклонением от первоначального направления распространения в определенном интервале углов, входящих в диапазон от 0,5 до 7 градусов.

В другом случае задача изобретения решается за счет использования дополнительной длиннофокусной линзы, расположенной за кюветой и перед диафрагмой с узким отверстием, через которое выделяемый пучок света попадает на детектор света. Расстояние между линзой и диафрагмой равно фокусному расстоянию линзы. Линза фокусирует на отверстие диафрагмы пучок света, прошедший через кювету без отклонения от первоначального направления.

На фиг.1 дана иллюстрация временной зависимости интенсивности прошедшего через образец обогащенной тромбоцитами плазмы крови света, распространяющегося с отклонением от первоначального направления распространения в пределах 1,0 2,0 градусов; на фиг.2 временная зависимость интенсивности прошедшего через образец изолированных тромбоцитов света, распространяющегося с отклонением от первоначального направления распространения в пределах 1,0 2,0 градусов; на фиг. 3 временная зависимость коэффициента пропускания образца обогащенной тромбоцитами плазмы крови при регистрации прошедшего света, распространяющегося без отклонения от первоначального направления распространения; на фиг.4 схема устройства для исследования начальной агрегации тромбоцитов с приспособлением для выделения пучка света, прошедшего через кювету с отклонением от первоначального направления распространения в диапазоне углов от 0,5 до 7 градусов; на фиг.5 схема устройства для исследования начальной агрегации тромбоцитов с приспособлением для выделения пучка света, прошедшего через кювету без отклонения от первоначального направления распространения.

Осуществление способа исследования начальной агрегации тромбоцитов, основанного на выделении пучка света, прошедшего через суспензию тромбоцитов с отклонением от первоначального направления распространения, подтверждается следующими примерами.

Пример 1. Кровь крысы, стабилизированную цитратом натрия (9 1 по объему), центрифугировали при 210 g в течение 20 мин. Супернатант, представляющий собой обогащенную тромбоцитами плазму крови, использовали для проведения исследования агрегации тромбоцитов. Это осуществлялось с помощью устройства для исследования начальной агрегации. На образец обогащенной тромбоцитами плазмы направляли параллельный пучок света, выделяли пучок света, распространяющийся после прохождения образца тромбоцитов в пределах углов от 1,0 до 2,0 градусов по отношению к первоначальному направлению распространения, измеряли зависимость интенсивности (1 усл. ед.) выделенного пучка света от времени (t) при непрерывном перемешивании образца тромбоцитов магнитной мешалкой. После введения в обогащенную тромбоцитами плазму индуктора агрегации аденозиндифосфата в конечной концентрации 0,2 мкМ, момент введения отмечен стрелкой, величина интенсивности света быстро увеличивалась и затем через 15 20 с достигала максимума (фиг.1, кривая 1). Увеличение интенсивности света обусловлено агрегацией тромбоцитов, так как в случае исключения процесса агрегации клеток путем введения этилендиаминтетрауксусной кислоты в конечной концентрации 2,5 мМ перед индуктором агрегации интенсивность света не увеличивалась (фиг.1, кривая 2). Таким образом, для определения агрегационной способности тромбоцитов в составе обогащенной тромбоцитами плазмы удобно использовать величину интенсивности пучка света, прошедшего через образец тромбоцитов с отклонением от первоначального направления распространения.

Пример 2. Получали изолированные тромбоциты крысы из обогащенной тромбоцитами плазмы путем центрифугирования. Для анализа агрегации использовали суспензию тромбоцитов в среде, содержащей NaCl 137 мМ, KCl 2,7 мМ, MgSO₄ 1 мМ, Na₂HPO₄ 5 мМ, KH₂PO₄ 1,5 мМ, глюкоза 5 мМ СрН=7,40. Анализ проводили с помощью устройства для исследования начальной агрегации тромбоцитов. На образец тромбоцитов направляли параллельный пучок света, выделяли пучок света, распространяющийся после прохождения образца тромбоцитов в пределах углов от 1,0 до 2,0 градуса по отношению к первоначальному направлению распространения, измеряли зависимость интенсивности (1 усл. ед.) выделенного пучка света от времени (t) при непрерывном перемешивании образца тромбоцитов магнитной мешалкой. После введения в суспензию тромбоцитов индуктора агрегации тромбина в конечной концентрации 1,0 мкг/мл: момент введения индуктора агрегации отмечен стрелкой, величина интенсивности света быстро увеличивалась (фиг.2, кривая 1). При исключении агрегации путем введения в образец тромбоцитов этилендиаминтетрауксусной кислоты в концентрации 2,5 мМ увеличения интенсивности света не происходило (фиг.2, кривая 2). Таким образом, для определения агрегационной способности изолированных тромбоцитов также удобно использовать величину интенсивности пучка света, прошедшего через образец тромбоцитов с отклонением от первоначального направления распространения.

Осуществление способа исследования начальной агрегации тромбоцитов, основанного на выделении пучка света, прошедшего через суспензию тромбоцитов без отклонения от первоначального направления распространения, подтверждается следующим примером.

Из крови крысы получали обогащенную тромбоцитами плазму, которую использовали для анализа агрегации тромбоцитов. Анализ проводили с помощью устройства для исследования начальной агрегации тромбоцитов. На исследуемый образец направляли параллельный пучок света, прошедшего через образец тромбоцитов без отклонения от первоначального направления распространения, измеряли зависимость от времени (t) коэффициента пропускания (Т), выраженного в виде отношения интенсивности выделенного пучка света к интенсивности падающего на образец тромбоцитов пучка света. После введения индуктора агрегации аденозиндифосфата в конечной концентрации 0,2 мкМ и при непрерывном перемешивании магнитной мешалкой величина коэффициента пропускания быстро уменьшалась (фиг. 3, кривая 1). При исключении агрегации тромбоцитов путем остановки перемешивания сразу после введения индуктора агрегации величина коэффициента пропускания снижалась меньше (фиг.3, кривая 2). Таким образом, для определения агрегационной способности тромбоцитов удобно использовать разность величин коэффициентов пропускания, измеренных без перемешивания и при перемешивании образца тромбоцитов.

Схема предлагаемого устройства с приспособлением для выделения пучка света, распространяющегося после прохождения суспензии тромбоцитов с отклонением от первоначального направления распространения в диапазоне углов от 0,5 до 7 градусов, изображена на фиг.4. Устройство содержит осветительную систему 1, кювету для образца тромбоцитов 2, систему для перемешивания образца тромбоцитов, в которую входят магнитная мешалка 3, магнит 4, закрепленный на оси электродвигателя 5, диафрагму 6 и экран 7, составляющие приспособление для выделения пучка прошедшего через тромбоциты света, диафрагму 8, детектор света 9, блок измерения 10 сигнала детектора света.

Осветительная система 1 служит для формирования параллельного пучка света 11 и направляет этот пучок на образец тромбоцитов. Диафрагма 6 расположена за кюветой 2, имеет круглое отверстие переменного размера. Экран 7 расположен за диафрагмой 6, выполнен в виде плоского кольца, плотно соединенного со световой ловушкой. Экран 7 подвижен вдоль оптической оси.

Устройство действует следующим образом.

В кювету 2 помещают образец тромбоцитов и магнитную мешалку 3, включают электродвигатель. Осветительной системой 1 на кювету 2 направляют параллельный пучок света 11. Изменяя диаметр отверстия диафрагмы 6 и перемещая экран 7, выделяют пучок света 12, имеющий направление распространения в необходимом интервале углов. Например, пучок света, распространяющийся во всем диапазоне углов от 0,5 до 7 градусов, выделяют при установке диафрагмы 6 на расстоянии 41 мм от кюветы, диаметр отверстия диафрагмы 6 устанавливают равным 10 мм, экран 7 диаметром 4 мм помещают на расстоянии 229 мм от кюветы. Другой пример: пучок света, распространяющийся в интервале углов от 0,5 до 1,5 градусов, выделяют при установке диафрагмы 6 на расстоянии 95 мм от кюветы, диаметр отверстия диафрагмы 6 устанавливают равным 5 мм, экран 7 помещают на расстоянии 229 мм от кюветы. Выделенный пучок света 12 попадает на детектор света, в котором генерируется сигнал, пропорциональный интенсивности света. Сигнал с детектора света 9 измеряется измерительным блоком 10. При протекании агрегации тромбоцитов измерительный блок 10 показывает увеличение сигнала детектора света.

Одно из испытаний устройства проведено с использованием двух образцов водных суспензий латексных микрочастиц. Один образец представлял собой 0,0025 суспензию латекса со средним диаметром частиц 0,2 мкм. Другой образец содержал такую же суммарную массу латекса, но средний диаметр частиц составлял 0,6 мкм. Второй образец эквивалентен тому, что в первом образце примерно каждые 9 частиц сливаются в 1 агрегат. Образцы по очереди помещали в кювету устройства, выделяли пучок света, имеющий направление распространение в интервале углов от 2,0 до 4,0 градусов. Полученные показания устройства представлены в таблице. Видно, что в случае второго образца с более высоким диаметром латексных частиц устройство показывало более высокую величину интенсивности выделенного пучка света, чем в случае первого образца.

Схема устройства с приспособлением для выделения пучка света, прошедшего через суспензию тромбоцитов без отклонения от первоначального направления распространения, изображена на фиг. 5.

Устройство содержит осветительную систему 1, кювету для образца тромбоцитов 2, систему для перемешивания образца тромбоцитов, в которую входят магнитная мешалка 3, магнит 4, закрепленный на оси электродвигателя 5, диафрагму 6 с круглым отверстием, длиннофокусную линзу 13, представляющую собой дополнительное приспособление для выделения пучка прошедшего через образец тромбоцитов света, диафрагму 8 с небольшим круглым отверстием, детектор света 9, блок измерения 10 сигнала детектора света. Осветительная система 1 формирует параллельный пучок света 11 и направляет этот пучок на кювету с суспензией тромбоцитов. Диафрагма 8 имеет отверстием, диаметр которого равен диаметру пучка света 11, падающего на кювету 2. Диафрагма 8 с небольшим отверстием расположена за линзой 13 на расстоянии, равном фокусному расстоянию этой линзы. Отношение диаметра отверстия диафрагмы 8 к фокусному расстоянию линзы 13 составляет не более 0,005. Линза 13 и диафрагма 8 обеспечивают попадание на детектор света 9 только пучка света, распространяющегося после прохождения образца тромбоцитов в пределах углов, близких к нулю. Детектор света 9 установлен за диафрагмой 8 и служит для преобразования выделенного пучка света в электрический сигнал. Сигнал детектора света подается на измерительный блок 10.

Устройство действует следующим образом.

В кювету 2 помещают образец тромбоцитов и магнитную мешалку 3, включают электродвигатель. Осветительной системой 1 на кювету 2 направляют параллельный пучок света 11. Линза 13 и диафрагма 8 формируют пучок света 12, прошедший через образец тромбоцитов без отклонения от первоначального направления распространения, и направляют этот пучок на детектор света 9. Детектор света 9 генерирует электрический сигнал, пропорциональный интенсивности света. Сигнал с детектора света 8 подается на измерительный блок 10, показания которого выражаются в виде коэффициента пропускания, т.е. в виде отношения интенсивности пучка света, прошедшего через образец тромбоцитов, к интенсивности пучка света, падающего на образец тромбоцитов. При протекании агрегации тромбоцитов измерительный блок показывает уменьшение коэффициента пропускания.

Испытание устройства проведено с использование двух образцов латексных частиц с разным средним размером 0,2 и 0,6 мкм, но при одинаковой суммарной массе латекса. Образец латекса помещали в кювету устройства, выделяли пучок света, прошедшего через кювету без отклонения от первоначального направления распространения, измерительный блок регистрировал коэффициент пропускания. Из таблицы видно, что в случае образца с более высоким диаметром латексных частиц 0,6 мкм устройство показывало величину коэффициента пропускания меньше, чем в случае образца с диаметром частиц 0,2 мкм.

Таким образом, оба способа и их реализующие устройства позволяют без дополнительных затрат и оборудования осуществлять качественный анализ агрегационной способности тромбоцитов.

Изобретение относится к медицине, а именно к способам исследования крови и устройствам для их осуществления. Сущность изобретения состоит в способах исследования начальной агрегации тромбоцитов, заключающихся в измерении интенсивности света, прошедшего через суспензию тромбоцитов и распространяющегося в пределах небольшого интервала углов, и устройствах для их осуществления, содержащих в одном случае приспособление в виде диафрагмы с переменным размером отверстия и подвижного экрана для выделения пучка света, распространяющегося после прохождения суспензии тромбоцитов с отклонением от первоначального направления в диапазоне углов от 0,5 до 7 градусов, в другом случае приспособление в виде длиннофокусной линзы и диафрагмы с узким отверстием, расположенных перед детектором света, для выделения пучка света, прошедшего через образец тромбоцитов без отклонения от первоначального направления распространения. 5 ил, 1 табл.

1. Способ исследования начальной агрегации тромбоцитов, заключающийся в том, что на суспензию тромбоцитов направляют параллельный пучок света, измеряют параметры прошедшего через нее пучка света и определяют агрегационную способность тромбоцитов, отличающийся тем, что выделяют пучок света, прошедший через суспензию тромбоцитов с отклонением от первоначального направления распространения в диапазоне углов отклонения от 0,5 до 7 градусов, измеряют интенсивность этого пучка света и по ее величине определяют агрегационную способность тромбоцитов. 2. Устройство для исследования начальной агрегации тромбоцитов, содержащее кювету для образца тромбоцитов, формирователь параллельного пучка света на кювету, детектор пучка света на кювету, детектор пучка света, размещенный за кюветой, диафрагму, размещенную непосредственно перед детектором пучка света, выход которого соединен с входом блока измерения, отличающееся тем, что оно снабжено дополнительной диафрагмой с круглым отверстием и круглым экраном, расположенным за ней, причем дополнительная диафрагма установлена непосредственно за кюветой и выполнена с возможностью изменения диаметра отверстия, а экран выполнен с возможностью перемещения вдоль оптической оси. 3. Способ исследования начальной агрегации тромбоцитов, заключающийся в том, что на суспензию тромбоцитов направляют параллельный пучок света, измеряют параметры прошедшего через нее пучка света и определяют агрегационную способность тромбоцитов, отличающийся тем, что выделяют пучок света, прошедший через суспензию тромбоцитов без отклонения от первоначального направления распространения, измеряют коэффициенты пропускания без перемешивания и при перемешивании суспензии тромбоцитов и по их разности определяют агрегационную способность тромбоцитов. 4. Устройство для исследования начальной агрегации тромбоцитов, содержащее кювету для образца тромбоцитов, формирователь параллельного пучка света на кювету, детектор пучка света, размещенный за кюветой, диафрагму, размещенную непосредственно перед детектором пучка света, выход которого соединен с входом блока измерения, отличающееся тем, что оно снабжено длиннофокусной линзой, расположенной непосредственно за кюветой, причем диафрагма размещена на расстоянии от длиннофокусной линзы, равном ее фокусному расстоянию, а диаметр отверстия диафрагмы выбран равным 0,005 от фокусного расстояния длиннофокусной линзы.