СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР Российский патент 1997 года по МПК A01H1/04 A01G7/00 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к селекции растений, и может быть использовано на основе определения выхода полиаденилированных м РНК в лабораторных условиях для оперативного контроля физиологического состояния сельскохозяйственных растений.

Известны способы для оценки физиологического состояния растений, предусматривающие цитофотометрические исследования количества ДНК. Например, способ диагностики физиологического состояния сельскохозяйственных растений в ответ на различные приемы агротехники: ручная прополка, механизированный уход за посевами, применение гербицидов [1] При этом о нарушении физиологического состояния судят по изменению относительного содержания ДНК на одно интерфазное ядро. Но подобные методы не отражают влияния ряда важнейших параметров внешней среды, в частности, света, температуры, обезвоживания, засоления.

Наиболее близким по технической сущности является способ, основанный на изменении синтеза ДНК в меристиматической ткани корней после воздействия пониженной температурой на семена при их проращивании [2] Однако известный способ имеет следующие недостатки. Он ограничен оценкой физиологического состояния растений только в ответ на холод. Он не учитывает такие важнейшие факторы, определяющие физиологическое состояние растений, как свет, засоление, обезвоживание. Изменение синтеза ДНК отражает лишь процессы редупликации, не давая никакой информации об изменении экспрессии генов растений, что является более лабильным регулируемым звеном в метаболизме растений.

Цель изобретения получение комплексной количественной оценки стрессоустойчивости, фотопериода и реакции на биологически активные вещества у сельскохозяйственных растений.

Цель достигается тем, что повариантно воздействуют на проростки семян светом, засолением, обезвоживанием и биологически активными веществами (фитогормонами). Из четырех-пятидневных проростков злаков выделяют сначала суммарный препарат РНК, а затем полиаденилированную матричную РНК (поли-А⁺⁺ м РНК) двумя циклами аффинной хроматографии. Определяют процентный выход полиаденилированной матричной РНК второго цикла от первого.

Для выделения суммарного препарата РНК 5 г срезанных четырех-пятидневных проростков замораживают жидким азотом, растирают в фарфоровой ступке до пылевидного состояния. Нуклеиновые кислоты экстрагируют 25 мл буферного раствора (0,2 М трис-HCl pH 8,5, 0,05 M MgCl₂) и депротеинизируют 50 мл водонасыщенной смеси фенол: хлороформ (1:1), центрифугируют при 3000 g 20 минут. Отбирают верхнюю водную фазу, содержащую нуклеиновые кислоты, и подвергают повторной депротеинизации равным объемом смеси фенол:хлороформ. Нуклеиновые кислоты осаждают из водного раствора добавлением 2,2 объемов этилового спирта при перемешивании. Смесь выдерживают 1,5-2,0 часа при 20±2^oC и центрифигируют при 3000 g 15 минут. Осадок нуклеиновых кислоты растворяют в 1 мл стерильной бидистиллированной воды и добавляют равный объем раствора, содержащего 4 М хлористого лития. Раствор выдерживают 16-18 часов при +4^oC, а затем центрифугируют при 3000 g 20-25 минут. Осадок препарата PHK растворяют в стерильной бидистиллированной воде до концентрации 1,0-1,2 мг/мл и прогревают 5 минут при 65^oC. Добавляют равный объем двукратного буфера для нанесения (0,04 М трис-HCl, pH 7,6, 1 M хлористого лития, 2 мМ ЭДТА Na₂ и 0,2% додецилсульфата натрия ДДС) охлаждают до комнатной температуры.

Колонку, объемом 1 мл, заполняют поли-у-сефарозой, промывают ее тремя объемами стерильного буфера, используемого для нанесения препарата РНК. Раствор РНК наносят на колонку с поли-у-сефарозой при температуре 23-25^oC со скоростью 0,5-0,6 мл/мин. Несвязавшийся материал повторно наносят на колонку. Промывают колонку 5-7 объемами буфера, в котором наносился препарат РНК. В последующем колонку промывают 3-5 объемами буфера для нанесения, разбавленного в 5 раз стерильной бидистиллированной водой. Элюируют сорбированную поли-А⁺⁺ м РНК (1 цикл хроматографии) 2-3 объемами буфера для элюции (0,01 М трис-HCl, pH 7,5, 1 мM ЭДTA•Na₂, 0,05% ДДС). Измеряют объем раствора, величину поглощения на спектрофотометре при 260 нм и определяют количество поли-А⁺ м РНК из расчета 1 OE₂₆₀=40 мкг/мл.

Затем доводят концентрацию хлорида лития в растворе элюированной поли-А⁺ м РНК до 0,5 М и проводят 2-ой цикл хроматографии на поли-у-сефарозе аналогично 1-му циклу. Замеряют количество поли-А⁺⁺ м РНК, полученной во втором цикле хроматографии, и рассчитывают процент поли-А⁺⁺ м РНК от поли-А⁺- м РНК, принимая количество поли-А⁺ м РНК за 100% По процентному выходу поли-А⁺⁺ м РНК в контроле и опыте судят о физиологическом состоянии растения.

Пример 1. Скорость реакции растений на свет зависит как от культуры, так и от сортов, взятых для исследования (табл. 1). Принципиально важно подчеркнуть два факта: 1) озимая и яровая пшеницы имели противоположные реакции на свет у озимой пшеницы освещение приводило к снижению, а у яровой к увеличению выхода поли-А⁺⁺ м РНК, что подтверждает многолетние эмпирические наблюдения фитофизиологов, отмечающих противоположную реакцию на свет у озимой и яровой пшениц [3] 2) существенно важным условием для корректного определения стрессоустойчивости сортов по изменению доли поли-А⁺⁺ м РНК является непрерывное освещение более 3-х часов.

Пример 2. В таблицах 2 и 3 представлены результаты диагностики холодоустойчивости сортов озимой пшеницы и озимого ячменя. В графе "ранг устойчивости" показана относительная холодоустойчивость сорта по данным многолетних полевых испытаний селекционеров. Диагностику проводили по изменению разницы выхода поли-А⁺⁺ м РНК из растений, выращиваемых в течение 8 часов при 4^oC, и растений, выращиваемых при 20^oC ("O" - "K"). Перед закладкой опытов все растения выращивали на свету не менее 12 часов и опыт проводили при освещении.

Как видно из таблиц 2 и 3 изменения выхода поли-А⁺⁺ м РНК корректируют с ранжированностью по холодоустойчивости сортов как озимой пшеницы, так и озимого ячменя. Однако реакция на холод у этих культур противоположна. Наиболее холодоустойчивый сорт озимой пшеницы Краснодарская 39 отличается значительным увеличением доли поли-А⁺⁺ м РНК. В то же время наиболее холодоустойчивый сорт озимого ячменя Радикал имел отрицательную разницу между опытом и контролем. Однако эта отрицательная величина убывает по мере снижения холодостойкости сортов, становится нейтральной для сорта двуручки и только затем сорта ячменя имеют положительное изменение доли прироста поли-А⁺⁺ м РНК под действием холода. Наиболее высокое значение по нашим данным имеет сорт ярового ячменя, обладающий наименьшей холодоустойчивостью.

Эти данные подтверждают многочисленные эмпирические наблюдения фитофизиологов и селекционеров, отмечающих противоположную реакцию на холод у озимой пшеницы и озимого ячменя.

Пример 3. В таблице 4 приведены результаты оценки устойчивости сортов озимой пшеницы к обезвоживанию. С этой целью опытные растения выращивали на 12%-ном растворе полиэтиленгликоля 6000 (ПЭГ) в течение 3 часов.

Наблюдалась прямая зависимость между реакцией устойчивости сорта к обезвоживанию и приростом доли поли-А⁺⁺ м РНК. Относительно устойчивый к обезвоживанию сорт озимой пшеницы Краснодарская 39 имел наибольший показатель прироста, в то же время у относительно неустойчивого к обезвоживанию сорта Безостая 1 этот показатель изменялся незначительно.

Пример 4. При выращивании сортов озимой пшеницы Краснодарская 39 и Безостая 1 на 2%-ном растворе хлористого натрия (засоление) за 3 часа величина поли-А⁺⁺ м РНК возрастала по сравнению с контролем на 30% для Краснодарской 39 и на 19% для Безостой 1.

Факты увеличения выхода поли-А⁺⁺ м РНК из проростков озимой пшеницы подтверждают ранее полученные нами результаты, показывающие неспецифическое увеличение в бесклеточной системе синтеза белка трансляционной активности полисом в ответ на разные виды стресса: засоление, обезвоживание, холод [4]
Пример 5. Под влиянием гиббереловой кислоты (10 мг/литр) по визуальным наблюдениям резко усиливался рост проростков озимой пшеницы сорта Краснодарская 39 (за 24 часа приблизительно в два раза по сравнению с контролем), но не изменялся у проростков озимой пшеницы Безостая 1. При этом у сорта Краснодарская 39 наблюдали прирост процента выхода поли-А⁺⁺ м РНК за 24 часа на 10% в то время, как у сорта Безостая 1 не было достоверного изменения выхода поли-А⁺⁺ м РНК по сравнению с контролем.

Использование предлагаемого способа оценки физиологического состояния сельскохозяйственных растений дает возможность количественной характеристики стрессоустойчивости растений, реакции на свет и действие фитогормонов на начальных стадиях селекции.

Источники информации.

1. Авт. свид. СССР N 1464967, кл. A 01 C 7/00, 1989.

2. Авт. свид. С ССР N 967392, кл. A 01 G 7/00, 1982.

3. Шайн С.С. и др. Свет и развитие растений, М. 1963, с. 126.

4. В. И. Киль, В. А. Бибишев, В.К. Плотников. Неспецифический прирост трансляционной активности in vitro полисом из проростков ячменя и пшеницы под действием стрессов, физиология растений, 1991, Т. 38, в. 4. с. 730-735.

Использование: изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к селекции растений, и может быть использовано на основе определения выхода полиаденилированных м РНК в лабораторных условиях для оперативного контроля физиологического состояния сельскохозяйственных растений. Сущность: при диагностике проводят повариантное воздействие на проростки стрессовым факторам, светом, фитогормонами. Выделяют сначала препарат суммарной РНК, затем выделяют в два цикла аффинной хроматографии препарат поли - А⁺⁺ матричной РНК (м РНК) и рассчитывают процент выхода поли - А₊₊ м РНК второго цикла от поли - А⁺ м РНК первого цикла и по разнице значений опытного и контрольного вариантов судят о физиологическом состоянии растений. 4 табл.

Способ диагностики физиологического состояния зерновых культур, включающий воздействие на проростки семян стрессовым фактором, анализ на содержание нуклеиновой кислоты в тканях органов растений и последующее сравнение содержания нуклеиновой кислоты в растениях, подвергнутых и не подвергнутых воздействию стрессового фактора, по результатам которого диагностируют физиологическое состояние растений, отличающийся тем, что проводят повариантное воздействие на проростки стрессовым фактором, светом, фитогормонами, выделяют сначала препарат суммарной РНК, затем выделяют в два цикла аффинной хромотографии препарат поли-А^+ + матричной РНК (м РНК) и рассчитывают процент выхода поли-А^+ +-м РНК второго цикла от поли-А⁺-м РНК первого цикла и по разнице значений опытного и контрольного вариантов судят о физиологическом состоянии растений.