СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НАСЛЕДСТВЕННО ИЗМЕНЕННЫХ ФОРМ ПШЕНИЦЫ Российский патент 1997 года по МПК A01H4/00 A01H1/04 

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии и может быть использовано в генетике и селекции растений.

Известен способ изменения наследственных признаков у пшеницы (Топорнина Н. А. Изменчивость яровой пшеницы, индуцированная химическими мутагенами. В кн. Химический мутагенез и гибридизация. М. Наука, 1978, с. 108 114), включающий обработку семян растворами химических супермутагенов - нитрозометилмочевины, нитрозоэтилмочевины и этиленимина, проращивание обработанных семян, выращивание растений, получение семенного потомства и выявление в последующих поколениях наследственно измененных форм.

Недостатками известного аналога являются его экологическая опасность и вредоносность для окружающей среды и человека.

Известен также способ получения исходного материала для селекции зерновых культур пшеницы и ячменя (а.с. СССР N 1673000, кл. A 01 H 1/04; C 12 N 15/01, опубл. 1991), включающий замачивание семян в растворе никотинамидадениндинуклеотида и последовательное облучение лазерным светом в синей, красной и инфракрасной областях спектра, проращивание обработанных семян, выращивание растений, получение семенного потомства и выявление в последующих поколениях наследственно измененных форм.

Однако при использовании известного аналога спектр полезных мутаций и их частота ограничены.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения наследственно измененных форм пшеницы (Larkin R.J. Ryan S.A. Brettell R.I.S. Scowcroft W. R. Heritable somaclonal variation in wheat Theor. and Appl. Genet. 1984, v. 67, N 5, p. 443 455), включающий культивирование эксплантантов тканей на искусственных каллусогенных питательных средах с фитогормональными добавками ауксинового ряда, получение эмбриональных каллусов, пересадку на среду для регенерации, последующую регенерацию из них растений, доращивание их до семенного потомства и отбор среди этого потомства сомаклональных измененных форм.

Основными недостатками прототипа являются относительно невысокая частота возникновения и узкий спектр полезных наследственных изменений признаков, поскольку используется только естественная сомаклональная изменчивость без какой-либо дополнительной стимуляции, например, как в предлагаемом способе, за счет снижения химического потенциала воды (ХПВ) в каллусогенной среде по сравнению с дистиллированной водой, для которой ХПВ принимают равным 0 Дж/моль.

Цель изобретения увеличение частоты возникновения и спектра наследственных изменений пшеницы.

Поставленная цель достигается тем, что в способе получения наследственно измененных форм пшеницы, включающем культивирование эксплантантов исходных растений на каллусогенной среде в первом пассаже в присутствии фитогормонов ауксинового ряда, получение эмбриогенного каллуса, культивирование эмбриогенного каллуса во втором и последующих пассажах на каллусогенной среде, пересадку на среду для регенерации растений, получение регенерантов, доращивание растений-регенерантов до семенного потомства, отбор среди этого потомства сомаклональных измененных форм, при этом в каллусогенной среде второго и последующих пассажей используют снижение величины химического потенциала воды (ХПВ) до таких величин, при которых последующее культивирование каллусов вызывает появление первых признаков некроза в виде начальной стадии высыхания и побурения при сохранении избирательной способности каллусов регенерировать растения.

Способ осуществляют следующим образом. Изолированные эксплантаты растений пшеницы, например 14-дневные зародыши, в стерильных условиях в первом пассаже помещают на каллусогенную питательную среду, например Линсмайера-Скуга (ЛС), содержащую фитогормональные добавки ауксинового ряда (например, 2,4- дихлорфеноксиуксусную кислоту), и с величиной снижения ХПВ по сравнению с дистиллированной водой до -9 Дж/моль (по прототипу) и культивируют до образования эмбрионального каллуса, например, в темноте при 27^oC в течение 1 месяца. Затем полученные каллусные культуры пересаживают во втором пассаже на каллусогенную питательную среду, что и в первом пассаже, но с величиной ХПВ ниже, чем по прототипу, например (-25) (-36) Дж/моль, и культивируют до появления первых признаков некроза в виде начальной стадии высыхания и побурения, но при сохранении избирательной способности каллусов регенерировать растения, например, в течение 3 4 недель. После каллусные культуры пересаживают на регенерационную среду со сниженной концентрацией гормонов ауксинового ряда, например Блейдза, и культивируют их на свету, например, при освещенности 3000 лк, с фотопериодом день/ночь 16/8 ч, до регенерации растений. Растения-регенеранты с хорошо развитыми побегами и корнями высаживают в сосуды с почвой и выращивают их до получения семенного потомства. Семенное потомство выращивают в естественных условиях и анализируют для выявления и отбора наследственно измененных сомаклональных форм по сравнению с исходными растениями (генотипами).

Примеры конкретного осуществления способа.

Пример 1. От исходных растений яровой мягкой пшеницы сортов Ершовская 32 (Е 32) и Саратовской 55 (С 55) изолировали 14-дневные зародыши, которые, предварительно простерилизовав 3% раствором хлорамина, в первом пассаже высаживали на каллусогенную питательную среду ЛС, содержащую 2,0 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты, с величиной снижения ХПВ до -9 Дж/моль по сравнению с дистиллированной водой, и культивировали в темноте при 27^oC в течение 1 месяца. Далее полученный эмбриогенный каллус культивировали во втором пассаже на средах ЛС с величиной снижения ХПВ до -9 Дж/моль (по прототипу), до -18 Дж/моль и до -36 Дж/моль (по предлагаемому способу) в течение 4 недель, подвергая их воздействию более низкого ХПВ по сравнению с прототипом и вызывая появление первых признаков некроза в виде начальной стадии высыхания и побурения при сохранении избирательной способности каллусов регенерировать растения. После эмбриогенные каллусные культуры пересаживали на регенерационную среду Блейдза, содержащую 2,0 мг/л индолил-3-уксусной кислоты и 0,2 мг/л кинетина, и культивировали их на свету при освещенности 3000 лк с фотопериодом день/ночь 16/8 ч при 27^oC до регенерации растений. Растения с хорошо развитыми побегами и корнями переносили в сосуды с почвой и выращивали до получения семенного потомства. Семенное потомство несколько раз пересевали, а затем изучали электрофоретические спектры глиадинов каждой семьи на предмет выявления сомаклональных биохимических мутантов по сравнению с исходными растениями (генотипами) (табл. 1).

Изменения в глиадиновых спектрах сомаклонов, полученных по прототипу, носили незначительный и традиционный по частоте и спектру характер и затрагивали в сумме 45 60% семей. Снижение ХПВ до -18 Дж/моль и особенно до -36 Дж/моль вызывало количественно и качественно более сильные изменения в электрофоретических спектрах глиадинов. В последнем случае (-36 Дж/моль) изменения возникали суммарно у 90% семей, преимущественно в геноме D, одновременно затрагивая и другие два генома: A и B.

Приведенный пример показывает, что цель изобретения увеличение частоты возникновения и спектра наследственных изменений пшеницы достигается предлагаемым способом по сравнению с прототипом.

Пример 2. Измененные формы растений яровой мягкой пшеницы получали также, как и в примере 1.

В табл. 2 приведены данные по частоте возникновения сомаклональных измененных форм яровой мягкой пшеницы сорта Е 32 во втором пятом поколении по цвету растений в зависимости от величины снижения ХПВ в каллусогенной среде второго пассажа.

Выращивание эмбриогенных каллусных культур во втором пассаже на среде с величиной снижения ХПВ до -9 Дж/моль (по прототипу) дает до 48% семей сомаклонов с измененным (изумрудным) цветом растений, тогда как снижение ХПВ до -36 Дж/моль индуцирует появление изумрудного цвета растений почти у 100% семей сомаклонов.

Пример 2 показывает, что частота возникновения измененных по цвету растений сомаклональных форм значительно выше при использовании предлагаемого способа, чем прототипа. Кроме того, эти изменения являются наследственными, поскольку на протяжении пяти половых поколений у сомаклонов сохранялся измененный (изумрудный) цвет растений (см. также пример 4).

Пример 3. Измененные формы растений пшеницы получали так же, как и в примере 1.

В табл. 3 приведены данные по интенсивности поражения бурой ржавчиной растений исходного сорта яровой мягкой пшеницы Е 32 и измененных форм второго пятого поколения, полученных после культивирования во втором пассаже на каллусогенных средах с различной величиной снижения ХПВ.

Сомаклоны второго пятого поколения, полученные из каллусных культур, выращенных на среде по прототипу (снижение ХПВ до -9 Дж/моль), достоверно не отличались по интенсивности поражения бурой ржавчиной от растений исходного сорта яровой мягкой пшеницы Е 32, тогда как снижение ХПВ во втором пассаже до -36 Дж/моль приводило у сомаклонов к достоверному снижению интенсивности поражения или соответственно к достоверному увеличению устойчивости растений сомаклонов к этому патогену.

Пример 3 подтверждает тот факт, что спектр наследственных изменений пшеницы при использовании предлагаемого способа шире, чем по прототипу.

Пример 4. Измененные формы растений получали так же, как в примере 1.

В табл. 4 приведены данные по наследованию в ряду половых (семенных) поколений морфологических и биохимических изменений, возникших у сомаклонов яровой мягкой пшеницы Е 32 под влиянием снижения величины ХПВ в каллусогенной среде культивирования каллусных культур во втором пассаже. Первым поколением считали семена, сформированные на растениях-регенерантах, и растения, выросшие из них. Наследование определяли по стабильности и единообразию потомства у самоопыленных поколений: со второго по седьмое включительно.

Как видно из табл. 4, возникшие изменения прослеживаются в течение 6 половых (семенных) поколений, что однозначно свидетельствует о наследственном характере преобразований в геноме пшеницы, произошедших в сомаклонах под влиянием низких величин ХПВ в среде культивирования во втором пассаже.

Использование предлагаемого способа, направленного на увеличение частоты и спектра мутаций у пшеницы, обеспечивает по сравнению с прототипом и другими известными способами следующие технико-экономические и иные преимущества:
снижение величины ХПВ культивирования каллусных культур пшеницы во втором пассаже позволяет резко увеличить частоту наследственных изменений и расширить спектр полезных мутаций у сомаклонов пшеницы, что значительно сокращает время генетико- селекционных работ по созданию аналогов сортов с новыми признаками за счет использования экологически безопасного фактора для окружающей среды и оператора воздействия снижения величины химического потенциала воды в искусственной питательной среде культивирования эксплантантов исходных растений селектируемых образцов.

Использование: сельское хозяйство, в частности селекция пшеницы. Сущность изобретения: осуществляют культивирование эксплантантов исходных растений на каллусогенной среде в первом пассаже в присутствии фитогормонов ауксинового ряда, получение эмбриогенного каллуса, культивирование его во втором и последующих пассажах на каллусогенной среде, пересадку на среду для регенерации растений, получение регенерантов, доращивание регенерантов до семенного потомства, отбор среди него сомаклональных измененных форм, при этом в каллусогенной среде второго и последующих пассажей используют снижение величины химического потенциала воды до таких величин, при которых последующее культивирование каллусов вызывает появление первых признаков некроза в виде начальной стадии высыхания и побурения при сохранении избирательной способности каллусов регенерировать растения. 4 табл.

Способ получения наследственно измененных форм пшеницы, включающий культивирование эксплантатов исходных растений на каллусогенной среде в первом пассаже в присутствии фитогормонов ауксинового ряда, получение эмбриогенного каллуса, культивирование его во втором и последующих пассажах на каллусогенной среде, затем его пересадку на среду для регенерации растений, получение регенерантов, доращивание растений-регенерантов до семенного потомства, отбор среди этого потомства сомаклональных измененных форм, отличающийся тем, что в каллусогенной среде второго и последующих пассажей используют снижение химического потенциала воды до таких величин, при которых последующее культивирование каллусов вызывает появление первых признаков некроза в виде начальной стадии высыхания и побурения при сохранении избирательной способности каллусов регенерировать растения.