СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ Российский патент 1997 года по МПК C12P21/00 C12N1/38 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способам выращивания микроорганизмов в присутствии химических соединений в качестве стимуляторов роста.

В качестве стимуляторов роста клеток микроорганизмов используют как индивидуальные химические соединения, такие как витамины, аминокислоты, микроэлементы, поверхностно-активные вещества, пуриновые или пиримидиновые основания, так и сложные смеси, включающие ряд биологически активных веществ (БАВ) и представленные часто отходами различных биологических производств.

Использование стимуляторов роста клеток в процессе получения биомассы как при периодическом, так и при непрерывном культивировании приводит к более полной утилизации субстрата, однако их применение экономически не всегда целесообразно.

Известен способ выращивания микроорганизмов, в частности дрожжей, с использованием в качестве стимуляторов роста кротонбетаина и бутилбетаина [1] Основным недостатком этого способа является то, что действие кротонбетаина и бутилбетаина проверено только для выращивания дрожжей и лишь в периодических условиях в колбах при встряхивании при низких концентрациях биомассы. Недостатком метода является также значительный расход кротонбетаина и бутилбетаина, который составляет 0,1 мг на 1 л питательной среды.

Известен способ выращивания дрожжей в условиях аэрации на минеральных питательных средах, содержащих источник углерода, азота, фосфора и микроэлементов с использованием в качестве стимулятора роста дрожжей одной или нескольких альфа-аминокарбоновых кислот, входящих в состав натуральных полипептидов, особенно аргинина, лейцина и лизина, а также одного или нескольких витаминов группы B, особенно пантотеновой кислоты и ее солей и пиридоксина [2] Одновременное добавление 0,2 мас. к объему среды комплекса из аминокислот и витаминов (аргинина, пиридоксина и пантотеновой кислоты) или 0,25% аминокислот и 0,10% витаминов к объему среды приводит к интенсификации процесса получения биомассы дрожжей. Однако широкое применение известного способа в крупнотоннажном производстве биомассы микроорганизмов невозможно, поскольку как индивидуальные аминокислоты, так и отдельные витамины достаточно дороги, кроме того, они имеют самостоятельную пищевую ценность, а производство их сравнительно ограничено.

Известен способ выращивания дрожжей родов Pichia, Saccharomyces, Zygosacchar, Candida и Torulopsis на средах с углеводородами, спиртами или органическими кислотами, в котором в качестве источника стимулятора роста используют культуральную жидкость, полученную после выращивания нуждающихся в тиамине дрожжей (представителей родов Candida, Torulopsis, Trichosparon, Rhodotorula, Cryptococcum [3] При добавлении 0,1-10,0% такой культуральной жидкости для стимуляции роста указанных дрожжей отмечается прирост биомассы на 7-30% или увеличение выхода биомассы на 5-15% Однако для выращивания нуждающихся в тиамине дрожжей используется питательная среда, обогащенная такими витаминами, как биотин, пантотенат кальция, фолевая кислота, инозит, α-аминобензойная кислота, пиридоксин, рибофлавин, тиамин и др. После прекращения роста дрожжей клетки отделяют центрифугированием и культуральную жидкость добавляют в среду того же состава, кроме замены глюкозы на парафин (13 г/л), т.е. стимулирующий эффект указанной культуральной жидкости также проявляется в сочетании с перечисленными витаминами, что делает способ достаточно дорогим.

Описан также способ выращивания дрожжей с использованием в качестве стимулятора роста комплекса веществ, выделенных из отработанной культуральной жидкости с помощью полярного растворителя, в качестве которого используют этиловый спирт [4]
По этому способу дрожжи выращивают на питательной среде, содержащей парафин, минеральные соли, стимулятор роста, выделенный на отработанной культуральной жидкости с помощью этилового спирта. Дрожжи выращивают в колбе на качалке в течение 24 ч на водно-минеральной среде с использованием в качестве источника углерода углеводородов и в качестве стимулятора роста - дрожжевого автолизата и кубового остатка, получаемого обработкой культуральной жидкости с равным объемом этилового спирта и последующей отгонкой растворителя. Применение описанного комплекса стимуляторов позволяет повысить выход биомассы. Существенным недостатком известного способа является значительный расход автолизата дрожжей, а также использование значительных количеств спирта, который имеет самостоятельную пищевую ценность, и при этом незначительное увеличение выхода биомассы.

Ближайшим решением к предлагаемому способу получения биомассы по технической сущности и достигаемому эффекту является способ выращивания дрожжей [5] Согласно известному способу предусматривается выращивание микроорганизмов, например дрожжей Saccharomyces cerevisiae, с использованием в качестве питательной среды источника углерода и энергии и компонентов минерального питания пивного сусла. В начале выращивания м/о в культуральную среду в качестве стимулятора роста добавляют препарат гиббереллин (производства Курганского завода) в количестве 1,2•10^-3 М (2,0•10^-2% 200 мг/л). При этом дрожжи наиболее интенсивно размножались в первые трое суток.

Увеличение концентрации биомассы в среднем составило 20-25% Недостатком известного способа является невысокий выход биомассы, значительная длительность выращивания биомассы (до нескольких суток), высокий удельный расход стимулятора, который является индивидуальным гиббереллином, для выделения которого используется дорогостоящая очистка, в связи с чем он является достаточно дорогим препаратом, что снижает эффективность процесса в целом.

Технический результат изобретения заключается в увеличении прироста биомассы и снижении затрат сырья на ее получение.

Указанный технический результат достигается тем, что в ферментационную среду в качестве стимулятора роста клеток вводят N-трис-(2-оксиэтил)-аммониевую соль ортохлорфеноксиуксусной кислоты в количестве 1•10^-11 1•10^-8 мас. и гибберсиб в количестве 1•10^-12 1•10^-8 мас. при этом оба стимулятора вводят в процесс выращивания микроорганизмов либо синхронно, либо чередуя их подачу.

Способ осуществляется следующим образом.

Выращивание микроорганизмов проводят в непрерывных или периодических условиях при перемешивании и аэрации среды кислородсодержащим газом, например воздухом в присутствии источника азота, например фосфорнокислых или сернокислых солей аммония, хлористого аммония, раствора аммиака, источников фосфора, например фосфаты, минеральных солей калия, магния, микроэлементов - солей железа, цинка, марганца и др. В качестве микроорганизмов используют разные виды дрожжей, например рода Кандида, или различные виды бактерий.

В качестве источника углерода могут быть использованы, в частности, очищенные и неочищенные парафины, нефтяные дистилляты, природный газ, спирты, например этиловый, метиловый и др. жирные кислоты или углеводы, например гидролизаты растительного сырья.

При этом в качестве стимуляторов роста микроорганизмов в среду добавляют N-трис-(2-оксиэтил)аммониевую соль ортохлорфеноксиуксусной кислоты в количестве 1•10^-11 1•10^-8 мас. и дополнительно гибберсиб в количестве 1•10^-12 1•10^-8 мас. При этом оба стимулятора в аппарат для выращивания микроорганизмов подают либо вместе с источником углерода, либо с раствором питательных солей, в частности с раствором микроэлементов, либо в растворе технологической воды, в частности в отработанной культуральной жидкости, либо распыляют в подаваемый в аппарат воздух; при этом оба стимулятора вводят в процесс выращивания микроорганизмов одновременно, либо чередуя их подачу.

Выращивание микроорганизмов проводят при температуре 25 40^oC и при pH 3,0 8,0 в зависимости от используемого микроорганизма. Непрерывный процесс выращивания микроорганизмов проводят как в одну, так и в несколько стадий.

Стимулятор N-трис-(2-оксиэтил) аммониевая соль ортохлорфеноксиуксусной кислоты является синтетическим препаратом, представляет собой белый порошок с молекулярной массой 335,8, т.пл. 89 91^oC и имеет формулу

Гибберсиб представляет собой природный комплекс гиббереллинов, вырабатываемый грибами Fusarium moniliforma. Полученный из культуральной жидкости этого гриба препарат представляет собой порошок кремового оттенка, гигроскопичный, легко растворимый в воде, достаточно устойчивый при хранении в сухом состоянии (в сухом темном месте), совершенно безвредный для человека и животных (ТУ-59.05.01-81).

Способ иллюстрируется, но не ограничивается следующими примерами, которые доказывают влияние отличительных существенных признаков на достижение поставленной цели, то есть показывают взаимосвязь между выходом биомассы и количеством добавляемых в процессе выращивания веществ стимуляторов.

Пример 1. Дрожжи Candida maltosa ВСБ-899 (ЦМПМ-У-262) выращивают в колбах на качалке с объемом питательной среды 100 мл на минеральной среде следующего состава, г/л: NH₄H₂PO₄ 10; K₂HPO₄ 10; MgSO₄•7H₂O 0,7; FeSO₄•7H₂O 0,093; ZnSO₄•7H₂O 0,042; MnSO₄•5H₂O 0,0105.

В питательную среду добавляют 1 об. очищенных жидких парафинов и стимуляторы роста: гибберсиб 1•10^-9 мас. и трис-(2-оксиэтил)аммониевую соль ортохлорфенилоксиуксусной кислоты - 1•10^-10 мас. Выращивание дрожжей проводят при температуре 32 - 34^oC, pH 5,5; 24 ч.

В результате получают дрожжи с концентрацией биомассы 4,3 г/л. В контрольном опыте, т.е. без добавок стимуляторов, концентрация биомассы составляет 1,9 г/л. При добавлении лишь 1•10^-10% трис-(2-оксиэтил)аммониевой соли ортохлорфенилоксиуксусной кислоты концентрация биомассы составляет 3,0 г/л. При добавлении лишь 1•10^-9% гибберсиба концентрация биомассы составляет 2,3 г/л. Прирост биомассы при подаче лишь 1•10^-9% гибберсиба составил 26,3% При подаче лишь 1•10^-10% трис-(2-оксиэтил)аммониевой соли ортохлорфенилоксиуксусной кислоты 59,4% При совместной подаче двух стимуляторов прирост биомассы составляет 126,7% т.е. при совместной подаче двух стимуляторов в указанных количествах имеет место сверхсуммарный прирост биомассы.

Пример 2. Дрожжи Candida maltosa ВСБ-899 (ЦМПМ-У-262) выращивают по примеру 1. В питательную среду добавляют 1 об. очищенных жидких парафинов и стимуляторы роста: гибберсиб 1•10^-10% и трис-(2-оксиэтил)аммониевой соли ортохлорфеноксиуксусной кислоты в количестве 1•10^-10% Выращивание дрожжей проводят при температуре 32 34^oC, pH среды 5,5 в течение 24 ч. В результате получают дрожжи с концентрацией биомассы 4,1 г/л. В контрольном опыте, т.е. без добавок стимуляторов концентрация биомассы составляет 1,9 г/л. При добавлении лишь 1•10^-10% трис-(2-оксиэтил)аммониевой соли ортохлорфенилоксиуксусной кислоты, концентрация биомассы составляет 2,4 г/л (прирост биомассы 26,3%). При добавлении лишь 1•10^-10% гибберсиба концентрация биомассы составляет 2,5 г/л (прирост биомассы 31,6%). При совместной подаче двух стимуляторов прирост биомассы по сравнению с контрольным опытом составляет 117,5% т. е. при совместной подаче двух стимуляторов в указанных количествах имеет место сверхсуммарный прирост биомассы.

Пример 3. Дрожжи Candida tropicalis ВСБ-928 (ЦМПМ-У-503) выращивают по примеру 1 в течение 20 ч. В питательную среду добавляют 1 об. очищенных жидких парафинов, в качестве стимулятора роста добавляют композицию веществ - гибберсиб в количестве 1•10^-10 мас. и трис-(2-оксиэтил)аммониевой соли ортохлорфенилоксиуксусной кислоты 1•10^-10% Выращивание дрожжей проводят при температуре 32 34^oC, pH среды 5,5 в течение 24 ч. В результате получают дрожжи с концентрацией биомассы 4,96 г/л. В контрольном опыте, т.е. без добавок стимуляторов, концентрация биомассы составляет 3,83 г/л. При добавлении лишь 1•10^-10% трис-(2-оксиэтил)аммониевой соли ортохлорфенилоксиуксусной кислоты, концентрация биомассы составляет 3,91 г/л (прирост по сравнению с контролем составляет 2,3% ). При добавлении лишь 1•10^-10% гибберсиба концентрация биомассы составляет 4,01 г/л (прирост по сравнению с контролем составляет 4,8% ). При совместном введении двух стимуляторов роста прирост биомассы составляет 29,6% т.е. при совместной подаче двух стимуляторов в указанных количествах имеет место сверхсуммарный прирост биомассы.

Пример 4. Дрожжи Candida multosa ВСБ-777 (ЦМПМ-У-194) выращивают по примеру 1 в течение 20 ч. В питательную среду добавляют 1 об. очищенных жидких парафинов, 1•10^-8% трис-(2-оксиэтил)аммониевой соли ортохлорфенилоксиуксусной кислоты и 1•10^-9% гибберсиба. Дрожжи выращивают при температуре 32 34^oC, pH среды 5,5 в течение 24 ч. В результате получают дрожжи с концентрацией 5,21 г/л. В контрольном опыте, т.е. без добавок стимуляторов, концентрация биомассы составляет 2,76 г/л. При добавлении 1•10^-8% трис-(2-оксиэтил)аммониевой соли ортохлорфенилоксиуксусной кислоты концентрация биомассы составляет 3,41 г/л (прирост биомассы по сравнению с контролем составляет 23%). При добавлении лишь 1•10^-9% гибберсиба концентрация биомассы составляет 3,62 г/л (прирост биомассы составил 31%). При совместной подаче двух стимуляторов в указанных количествах прирост биомассы составляет 89% т.е. при этом имеет место сверхсуммарный прирост биомассы.

Пример 5. Дрожжи Candida maltosa ВСБ-899 (ЦМПМ-У-262) выращивают при периодическом режиме в аппарате, снабженном эжекционной мешалкой, работающей со скоростью 1200 об./мин, с рабочим объемом 5 л, при pH 4,0, температуре 32^oC, на питательной среде следующего состава, г/л: H₃PO₄ (70%) 2,6; (NH₄)₂SO₄ (20%) 8,0; KCl 1,27; MgSO₄•7H₂O 0,91; FeSO₄•7H₂O 0,174; ZnSO₄•7H₂O 0,038; MnSO₄•7H₂O 0,038; парафин 20 г/л. В качестве стимулятора добавляют трис-(2-оксиэтил)аммониевую соль ортохлорфенилоксиуксусной кислоты в количестве 1•10^-7 мас. и гибберсиб в количестве 1•10^-9 мас. Выращивание ведут до прекращения потребления pO₂. В результате получают биомассу с концентрацией 20,85 г/л (выход биомассы составляет 104,2%). В контрольном опыте (без добавок стимуляторов) концентрация биомассы составляет 14,07 г/л (выход биомассы 70,30% ). При добавлении лишь 1•10^-7 мас. трис-(2-оксиэтил)аммониевой соли ортохлорфенилоксиуксусной кислоты (контроль по прототипу) концентрация биомассы составляет 16,95 г/л (выход биомассы 80,5% увеличение на 10,2%), при добавлении лишь 1•10^-9 мас. гибберсиба концентрация биомассы составляет 16,65 г/л (выход биомассы составляет 80,30%), увеличение на 10% по сравнению с контролем. При совместной подаче двух стимуляторов прирост биомассы по сравнению с контрольным опытом составляет 33,9% т.е. при совместной подаче двух стимуляторов в указанных количествах имеет место сверхсуммарный прирост биомассы.

Пример 6. Дрожжи Candida maltosa ВСБ-899 (ЦМПМ-У-262) выращивают при непрерывном режиме в аппарате, снабженном эжекционной мешалкой, работающей со скоростью 1200 об. /мин, рабочим объемом 5 л, при pH 4,0, температуре 32^oC, Д 0,2 ч^-1 на питательной среде по примеру 5. В питательную среду непрерывно добавляют 2,5 об. и в качестве стимулятора добавляют 1•10^-11% гибберсиба и 1•10^-10% трис-(2-оксиэтил)аммониевой соли ортохлорфенилоксиуксусной кислоты. При этом получают биомассу с концентрацией 18,6 г/л (выход в биомассы по парафину составляет 103,3%). В контрольном опыте (без добавок стимуляторов) концентрация биомассы составляет 14,4 г/л, выход биомассы составляет 80,0% При добавлении лишь 1•10^-11% гибберсиба концентрация биомассы составляет 16,1 г/л (выход биомассы 89,9% на 9,9% больше, чем в контрольном опыте). При добавлении лишь 1•10^-10% трис-(2-оксиэтил)аммониевой соли ортохлорфенилоксиуксусной кислоты концентрация биомассы составляет 15,73 г/л (выход биомассы составляет 87,3% т.е. на 7,3% больше, чем в контрольном опыте). При совместной подаче двух стимуляторов выход биомассы на 23,3% больше, чем в контрольном опыте, т.е. имеет место сверхсуммарный прирост биомассы.

Пример 7. Дрожжи Candida utilis ВСБ-651 (ЦМПМ-У-277) выращивают в непрерывном режиме в 10-метровом аппарате с рабочим объемом 15 л на минеральной среде следующего состава, г/л: (NH₄)₂SO₄ 1,5; H₃PO₄(70%) 1,53; KCl 0,96; MgSO₄•7H₂O 0,58; FeSO₄•7H₂O 0,116; ZnSO₄•7H₂O 0,052; MnSO₄•5H₂O 0,013. В качестве источника углерода используют 3 об. к протоку этилового спирта, а в качестве стимулятора роста добавляют смесь из 1•10^-8% трис-(2-оксиэтил)аммониевой соли ортохлорфенилоксиуксусной кислоты и 1•10^-9% гибберсиба. Выращивание дрожжей проводят при температуре 32 34^oC при Д 0,25 ч^-1. В результате получают биомассу с концентрацией биомассы 1,6 г/л (выход 67,5% ). В контрольном опыте, т.е. без добавок стимуляторов концентрация, биомассы составляет 1,2 г/л (выход 50,6%). При добавлении лишь 1•10^-8% трис-(2-оксиэтил)аммониевой соли ортохлорфенилоксиуксусной кислоты концентрация биомассы составляет 1,3 г/л (выход биомассы 54,8 г/л). При добавлении лишь 1•10^-9% гибберсиба концентрация биомассы составляет 1,4 г/л (выход биомассы составляет 59,1%).

Пример 8. Дрожжи Pseudomonas desmolyticum ВСБ-578 (ЦМПМ-В-513) выращивают в колбах при встряхивании на качалке на питательной среде, содержащей фосфорнокислый калий двузамещенный и фосфорнокислый аммоний однозамещенный в концентрации 3 г/л, сернокислый магний и хлористый натрий 0,2 г/л и микроэлементы: сернокислое железо, марганец, цинк в концентрации 0,006 г/л. В качестве источника углерода используют неочищенные жидкие парафины с содержанием н-алканов C₁₃ C₂₆ 94% и ароматических углеводородов 1,5% В 100 мл питательной среды добавляют 0,5 мл парафина, а в качестве стимуляторов роста 1•10^-10% гибберсиба и 1•10^-9% трис-(2-оксиэтил)аммониевой соли ортохлорфенилоксиуксусной кислоты. Бактерии выращивают при температуре 32 36^oC, pH среды 6,6 7,2, в течение 18 ч. Концентрация биомассы достигает 3,65 г/л, т.е. выход биомассы составляет 93,6% При выращивании этих бактерий в контрольных условиях (без добавок стимуляторов) концентрация биомассы составляет 2,18 г/л (выход биомассы 56%). При добавлении лишь 1•10^-10% гибберсиба концентрация биомассы составляет 2,78 г/л (выход биомассы составляет 71,3% т.е. на 15,3% выше контрольного). При добавлении лишь 1•10^-9% трис-(2-оксиэтил)аммониевой соли ортохлорфенилоксиуксусной кислоты концентрация биомассы составляет 2,65 г/л (выход биомассы составляет 67,9% т.е. на 11,9% выше контрольного). При совместной подаче стимуляторов выход биомассы превышает контрольный уровень на 37,6% т.е. при совместной подаче двух стимуляторов в указанных количествах имеет место сверхсуммарный прирост биомассы.

Пример 9. Дрожжи Candida maltosa ВСБ-899 выращивают непрерывно в промышленном ферментере с рабочим объемом 450 м³ при pH 4,0 4,2 при 32 34^oC, расходе воздуха 106 м³/м³ ч на среде с очищенным жидким парафином при расходе на 1 т дрожжей следующих компонентов, кг/т: аммофос 114, калий хлористый 5,4, магний сернокислый (эпсомит) 26, железный купорос 7, цинковый купорос 4,5, марганец сернокислый 2,5. В качестве стимулятора подают одновременно гибберсиб (50 мг/ферментер/сутки - 2,5•10^-9%) и трис-(2-оксиэтил)аммониевой соли ортохлорфенилоксиуксусную кислоту (500 мг/ферментер/сутки). Производительность ферментера составляет 42,8 т/сут, выход биомассы 110% Без подачи стимуляторов производительность ферментера составляет 34,4 т/сут, выход биомассы составляет 88,4% При подаче лишь гибберсиба производительность ферментера составляет 36,2 т/сут (выход биомассы составляет 93,0%). При подаче лишь трис-(2-оксиэтил)аммониевой соли ортохлорфенилоксиуксусной кислоты производительность ферментера составляет 35,3 т/сут, выход биомассы составляет 90,7%
Таким образом, как видно из приведенных выше примеров, введение в среду ферментации микроорганизмов композиционного биостимулятора, включающего гибберсиб и трис-(2-оксиэтил)аммониевую соль ортохлорфенилоксиуксусной кислоты, позволяет увеличивать выход биомассы на 8 25% При этом существенно снижается концентрация каждого из стимуляторов по сравнению с количеством, необходимым для достижения аналогичного эффекта при их раздельной подаче, что очень важно для реализации способа в условиях крупнотоннажного производства, выявлен сверхсуммарный прирост биомассы, т.е. синергический эффект.

Использование: микробиологическая промышленность, в частности выращивание микроорганизмов в присутствии химических соединений в качестве стимулятора роста. Сущность: изобретение представляет собой способ получения биомассы микроорганизмов в условиях перемешивания и аэрации в питательной среде, содержащей источники азота и углерода, необходимые минеральные соли, в качестве стимулятора роста клеток микроорганизмов используют трис-(2-оксиэтил) аммониевую соль ортохлорфеноксиуксусной кислоты, причем в ферментационную среду дополнительно вводят в качестве стимулятора роста клеток гибберсиб в количестве 1•10^-12 - 1•10^-8 мас.%. Введение в среду ферментации микроорганизмов композиционного биостимулятора, включающего гибберсиб и трис-(2-оксиэтил)аммониевую соль ортохлорфенилоксиуксусной кислоты позволяет увеличить выход биомассы на 8-25%. При этом существенно снижается концентрация каждого из стимуляторов по сравнению с количеством, необходимым для достижения аналогичного эффекта при их раздельной подаче, что очень важно для реализации способа в условиях крупнотоннажного производства, выявлен сверхсуммарный прирост биомассы, т.е. синергетический эффект.

Способ получения биомассы, включающий выращивание микроорганизмов в условиях перемешивания и аэрации на питательной среде, содержащей источники азота, углерода, необходимые минеральные соли, а также стимулятор роста клеток микроорганизмов, отличающийся тем, что в ферментационную среду в качестве стимулятора роста клеток вводят N-трис-(2-оксиэтил)аммониевую соль ортохлорфеноксиуксусной кислоты в количестве 1•10^-11 - 1•10^-8 мас. и гибберсиб в количестве 1•10^-12 - 1•10^-8 мас.