СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ МИКРОКАПСУЛ ИЗ БАКТЕРИЙ В ЖИРНОЙ КИСЛОТЕ И МИКРОКАПСУЛА, СОДЕРЖАЩАЯ ЛИОФИЛИЗИРОВАННУЮ БАКТЕРИАЛЬНУЮ КУЛЬТУРУ Российский патент 1997 года по МПК C12N1/20 A23K1/18 B01J13/02 

Изобретение касается способа приготовления микрокапсул из бактерий в жирной кислоте, предусматривающего стадии приготовления дисперсии лиофилизированной биомассы бактерий в расплаве жирной кислоты и осуществления микрокапсуляции биомассы в расплаве. Изобретение также касается микрокапсулы, содержащей лиофилизированную бактериальную культуру, инкапсулированную в жирной кислоте, способом указанного выше типа.

Известно, что некоторые бактерии являются потенциально полезными, если их добавить к кормам животных. Эти бактерии полезны тем, что они восполняют естественную микро-флору кишечника. Некоторые компании предлагают на продажу пробиотики, которые содержат желаемые бактерии. Однако, пробиотики действительно имеют некоторые трудности с сохранением в виде стабильного продукта. В типичном случае, пробиотик используется при довольно низком уровне добавления в корм, возможно, при уровне в 1% Однако, неиспользуемые корма, содержащие пробиотик, или продукты, добавляемые к кормам, часто хранятся фермерами в течение длительного периода времени. Такое хранение часто осуществляется в условиях, где имеется некоторая влажность. Во многих случаях имеющейся влажности достаточно только для того, чтобы бактерии активизировались или начали расти, но этого количества влажности еще недостаточно для поддержания этих начавшихся процессов. В результате бактерии погибают. Таким образом, активность пробиотика теряется. В других случаях, добавление антибиотиков к кормам, содержащим пробиотик, или к кормовым добавкам неблагоприятно воздействует на бактерии, в особенности, если имеется небольшое количество влажности, и, таким образом, бактерии опять погибают. Таким образом, существует серьезная проблема поддержания стабильности пробиотиков в течение длительного хранения.

В других средах, куда добавляется пробиотик, например, в корм для цыплят, распространено гранулирование материала с пробиотиком, который добавляется перед гранулированием. Влажность от пара, который используется во время гранулирования, частично активизирует бактерии, но может и погубить их в результате недостаточного количества (влажности) для поддержания жизни бактерий. Тепловая обработка во время гранулирования также может погубить бактерии. Затем, проблемой также является кислая окружающая среда желудка, которая потенциально инактивирует бактерии до того, как они действительно достигнут кишечника. Таким образом, имеется постоянная потребность в пробиотиках, из которых микроорганизмы высвобождались бы только в нужное время в кишечнике без преждевременного высвобождения вследствие влажных условий или неблагоприятных рН-условий, которые существуют в пищеварительном тракте, предшествующем тонкому кишечнику.

Известен способ приготовления круглых микрокапсул из бактерий кишечной микрофлоры, а также рода Lactobacillus и/или Bifidobacillus и из жира с температурой плавления от 40^oC до 60^oC. Согласно этому известному способу, приготавливают дисперсию лиофилизированной биомассы вышеупомянутых микроорганизмов в расплавленном гидрогенизированном пальмовом масле с температурой 45^oC, в соотношении 0,25 частей биомассы на 5 частей масла, и полученную таким образом дисперсию распыляют под давлением с получением микрокапсул (патент США N 4332790, кл. А 61 K 39/02, 1982). Известный способ однако не обеспечивает достаточной стабильности продукта, так как пальмовое масло имеет сравнительно низкую температуру плавления и недостаточно высокую устойчивость к порче. Полученные микрокапсулы слипаются, что неблагоприятно влияет на текучесть продукта. Все эти недостатки приводят к более строгим условиям хранения продукта, сравнительно небольшому сроку хранения и затрудняют обращение с пробиотиком.

Задачей настоящего изобретения является создание пробиотиков, стабильных в течение 3-6 месяцев без какого-либо значительного снижения количества микроорганизмов.

Другой задачей изобретения является создание препарата, содержащего лиофилизированную бактериальную культуру, заключенную в микрокапсулы при помощи вращающегося диска, которые могут свободно скользить друг относительно друга, и которые легко использовать при составлении кормовых рационов для животных.

Сравнительно более отдаленной задачей настоящего изобретения является создание препарата с культурой Enterococcus faecium заключенной в микрокапсулы.

Фиг. 1, 2 и 3 графически показывают стабильность штаммов, заключенных в микрокапсулы, с использованием стеариновой кислоты в качестве вещества, из которого сделаны капсулы.

Поставленные задачи решаются изобретением посредством того, что в способе указанного во введении типа, стадию микроинкапсуляции осуществляют посредством приготовления дисперсии лиофилизированной биомассы в расплаве C₁₂-C₂₄ жирной кислоты при температуре от 40^oC до 75^oC и при соотношении от 50 до 90 масс. жирной кислоты с последующей подачей полученной смеси на вращающийся диск инкапсулятора, работающего в пределах от 2000 об/мин до 4000 об/мин, при скорости подачи смеси на вращающейся диск от 50 г/мин до 200 г/мин.

Настоящее изобретение относится к лиофилизированным бактериальным культурам, которые заключены в микрокапсулы при помощи вращающегося диска. Предпочтительно, веществом, из которого сделаны микрокапсулы, является свободная жирная кислота. Имеется два существенных и важных аспекта настоящего изобретения, которые отличают его от других предшествующих разработок, связанных с заключением бактерий в капсулы. В первом случае, это природа вещества, из которого сделаны капсулы, являющегося жирной кислотой. Во втором случае, это природа процесса заключения в капсулы, который в настоящем изобретении не использует общепринятую методику высушивания распылением, а использует вместо этого метод заключения в капсулы при помощи вращающегося диска. В настоящем изобретении осуществляется совместное действие этих двух различных аспектов, которое обеспечивает высокую стабильность пробиотиков по изобретению. При использовании только одного из этих аспектов стабильность не достигается.

Предпочтительным веществом, из которого сделаны капсулы, являются C₁₂-C₂₄ свободные жирные кислоты. В то время, как можно использовать смеси жирных кислот, предпочтительнее использовать единичную, чистую, свободную жирную кислоту. Также предпочтительнее использовать в качестве свободной жирной кислоты ненасыщенную жирную кислоту, наиболее предпочтительной является стеариновая кислота.

Вообще говоря, важным является то, чтобы жирная кислота имела точку плавления меньшую, чем 75^oC, предпочтительно, в пределах диапазона от 40^oC до 75^oC. Она должна, разумеется, быть твердой при комнатной температуре для того, чтобы быть эффективным капсулирующим веществом. Все свободные жирные кислоты, попадающие в пределы химического описания, приведенного выше, будут соответствовать этим требованиям.

Виды бактерий, которые заключают в капсулы, не являются строго определенными. Однако, вид выбранной бактерии будет зависеть от конкретного пробиотика, который нужно изготовить. Вообще говоря, наиболее предпочтительной для использования в настоящем изобретении является бактерия Enterococcus faecium. Следует понимать, что и другие бактерии, такие как Lactobacillus, Bacillus и др. также могут быть использованы. Смеси штаммов могут быть использованы наряду с индивидуальными штаммами. Для того, чтобы повысить стабильность продукта, в типичном случае бактерии, помещаемые в продукт, являются лиофилизированной культурой. Таким образом, они могут быть оживлены при добавлении влаги.

Частицы, заключенные в микрокапсулы, изготовленные в соответствии со способом, обсуждаемым ниже, обычно включают от 50% до 90% (по весу) жирно-кислотного компонента, а остальную часть занимает бактериальная культура. Предпочтительным диапазоном является от около 60% до приблизительно 75% жирной кислоты. Если использовать слишком мало жирной кислоты, то покрытие будет недостаточным для защиты. С другой стороны, если использовать слишком много, то покрытие будет слишком толстым и приведет к недостаточному высвобождению (бактерий) в кишке.

Для заключения культуры в капсулы, в настоящем изобретении используют метод заключения в микрокапсулы при помощи вращающегося диска. В общем случае, по методу вращающегося диска жидкую смесь бактериального и жирно-кислотного компонентов тщательно перемешивают и подают с постоянной скоростью на центр вращающегося диска из нержавеющей стали. Там поступающая смесь отбрасывается наружу в результате действия центробежной силы. Затем получаемые частицы собирают в охлаждающей камере, температуру которой поддерживают на уровне температуры окружающей среды или несколько ниже, сортируют по размеру и подготавливают к упаковке.

В то время как заключение в капсулы при помощи вращающегося диска само по себе известно, оно неизвестно применительно к бактериям, то есть к заключению в микрокапсулы лиофилизированных бактериальных культур. Заключение в капсулы при помощи вращающегося диска в общем описано в работе Джонсона и др. из Юго-Западного Исследовательского Института в Сан-Антонио в Journal of Gas Chromotography, october, 1965, страницы 345-347. В добавление, прибор для заключения в капсулы при помощи вращающегося диска, подходящий для использования в настоящем изобретении, подробно описан в United States Letters Patent, Sparks, 4, 675, 140, выпущенном 23 июня 1987 и озаглавленном "Метод получения частиц, покрытых оболочкой, из капелек жидкости", суть которого включена в данное описание посредством ссылки.

Важно отметить, что заключение в микрокапсулы при помощи вращения предоставляет продукт, четко отличающийся от того, который получается в результате традиционной сушки башенным распылением. При традиционной башенной распылительной сушке у частиц имеется тенденция собираться в группы, а у покрытия быть неравномерным, и, таким образом, стабильность продукта существенно снижается, возможно, до нескольких дней или недель. При использовании заключения в микрокапсулы вращением, в особенности, с капсулирующими веществами, предлагаемыми в настоящем изобретении, стабильность получаемых бактерий, даже если они подвергнутся некоторому увлажнению или действию антибиотиков, будет сохраняться от трех до шести месяцев.

При использовании по изобретению в качестве микрокапсулирующего материала свободных жирных кислот в пределах диапазона, описанного выше, прибором для заключения в капсулы, который используется в типичном случае, является 4-х дюймовый вращающийся диск, работающий со скоростью от 2000 об/мин до 4000 об/мин, предпочтительно, от 2500 об/мин до 3200 об/мин, со скоростью подачи от 50 до 200 грамм в минуту. Предпочтительными условиями, известными к настоящему времени, являются использование стеариновой кислоты, использование Enterococcus faecium, четырех-дюймового (10 см) вращающегося диска, 3000 об/мин и скорости подачи жидкой смеси бактерии/стеариновая кислота (35% бактерий и 65% стеариновой кислоты) 100 граммов в минуту. Если все это выполнено, то будет получен продукт, имеющий размер частиц от 75 микрон до 300 микрон, преимущественный размер менее, чем 250 микрон.

Следующие примеры предлагаются для пояснения, но не ограничения способа по изобретению. Эти примеры описаны в связи с фиг. 1, 2 и 3.

Пример 1 относится к фиг. 1. Он показывает стабильность продукта из двух различных штаммов Enterococcus faecium при температурах 4^oC и 27^oC. На фиг. 1 показана стабильность штаммов Enterococcus faecium заключенных в капсулы; процесс заключения в капсулы выполнен на приборе для заключения в капсулы с использованием вращающегося диска и стеариновой кислоты, причем вес бактериальной культуры составлял 35% Условия для заключения в капсулы были те же, что предварительно описаны выше, а именно: жидкая смесь бактерий и стеариновой кислоты (35% и 65% соответственно), температура 60^oC, использование четырех-дюймового вращающегося диска, работающего при 3000 об/мин и скорости подачи 100 граммов в минуту. Культуры заключали в капсулы, помещали в теплоизолирующие, паронепроницаемые пакеты и еженедельно определяли КОЕ с предварительным разрушением образцов. Как можно увидеть, продукт настоящего изобретения сохраняет превосходное количество микроорганизмов, являющихся единицами, образующими колонии (КОЕ), за время хранения до 70 дней.

Пример 2 следует интерпретировать в связи с фиг. 2, которая показывает стабильность отдельных штаммов, заключенных в капсулы, при подмешивании к типичному кормовому рациону в присутствии трех антибиотиков, используемых в птицеводстве. Рацион состоял из следующих компонентов:
54% мелко-дробленая кукуруза,
26% мука крупного помола из соевых бобов,
2% рыбная мука грубого помола влажностью 12%
1,5% дикальцийфосфат,
1% известняк,
5,5% соевого масло.

Три антибиотика были добавлены по следующим нормам включения (по весу): деккокс 6% (454 ppm), салиномицин (50 ppm) и натриевое соединение монензина (120 ppm).

Культура была добавлена к смеси на таком уровне, чтобы обеспечить присутствие приблизительно 1•10⁶ КОЕ/г (100-150 г/тонну). Корм упаковывали в теплоизолирующие пакеты и хранили при комнатной температуре. Образцы для определения КОЕ отбирали еженедельно. График на фиг. 2 иллюстрирует превосходную стабильность.

Пример 3 следует интерпретировать в связи с фиг. 3. Он показывает стабильность Enterococcus faecium заключенной в капсулы и смешанной с кормом в присутствии различных антибиотиков. Рацион состоял из 60% мелко-дробленой кукурузы, 38% муки грубого помола из соевых бобов и 2% известняка при содержании влаги около 14% Культуру добавляли до уровня приблизительно 10⁶ КОЕ/г корма и смешивали с ним. Десяти-футовые (4,5 кг) навески хранились в герметично закрытых пакетах при 20^oC, еженедельно проверялись образцы в течение 16 недель. Антибиотики включались в рацион на следующих уровнях:
бацитрацин-метилен-дисалицилат 50 г/тонну,
карбадокс 50 г/тонну,
хлортетрациклин 200 г/тонну,
лазалоцид 30 г/тонну,
линкомицин 100 г/тонну,
неомицин 140 г/тонну,
окситетрациклин 150 г/тонну,
сульфаметазин 100 г/тонну,
тилозин 100 г/тонну,
вирджиниамицин 20 г/тонну,
ASP 250 100 г/тонну.

Таблица 1 представляет список минимальных промежутков времени, нужных для снижения количества единиц, образующих колонии (КОЕ), на 1 log-единицу.

В примере 4 определялась стабильность продукта после гранулирования для использования в кормовых продуктах для цыплят. Условия заключения в микрокапсулы были такими же, как описано выше. Условия, использованные в этом исследовании, были следующими:
неочищенный белок, не менее 18,0%
неочищенный жир, не менее 5,0%
неочищенное волокно, не менее 6,0%
Гранулы с антибиотиком и без антибиотика (КТЦ 50 г/тонну) были изготовлены со следующими ингредиентами и при следующих условиях:
кукуруза, СЕМ, сыворотка, соевое масло, дикальцийфосфат, известняк, примесь следовых количеств неорганических минеральных солей, примесь витаминов, селен, сульфат меди. Культуру добавляли приблизительно до 5•10⁵ КОЕ/г корма (100-150 г/тонну).

Температурные условия были: 70^oC, температура гранул после сушки была 78^oC.

Гранулы хранили в негерметично закрытых пакетах, еженедельно отбирались образцы для определения КОЕ.

Во всех случаях не наблюдалось неблагоприятного воздействия условий гранулирования на стабильность гранулированного продукта. В частности, гранулированный продукт показал стабильность, равную таковой негранулированного продукта.

Использование: кормопроизводство. Сущность изобретения: способ приготовления микрокапсул из бактерий в жирной кислоте предусматривает стадии приготовления дисперсии лиофилизированной биомассы бактерий в расплаве жирной кислоты и осуществления микрокапсуляции биомассы в расплаве. Согласно изобретению, стадию микроинкапсуляции осуществляют посредством приготовления дисперсии лиофилизированной биомассы в расплаве C₁₂-C₂₄ жирной кислоты при температуре от 40^oC до 75^oC и при соотношении от 50 до 90 масс.% жирной кислоты с последующей подачей полученной смеси на вращающийся диск инкапсулятора, работающего в пределах от 2000 об/мин до 4000 об/мин, при скорости подачи смеси на вращающийся диск от 50 г/мин до 200 г/мин. Жирной кислотой, предпочтительно, является стеариновая кислота, а указанные бактерии, предпочтительно, относятся к виду Enterococcus faecium. Изобретение также касается микрокапсулы, содержащей лиофилизированную бактериальную культуру, инкапсулированную в жирной кислоте, как описано выше. 2 с. и 6 з. п. ф-лы, 3 ил., 1 табл.

1. Способ приготовления микрокапсул из бактерий в жирной кислоте, предусматривающий стадии приготовления дисперсии лиофилизированной биомассы бактерий в расплаве жирной кислоты и осуществления микроинкапсуляции биомассы в расплаве, отличающийся тем, что микроинкапсуляцию осуществляют посредством приготовления дисперсии лиофилизированной биомассы в расплаве С_1 2 С_2 4 жирной кислоты при температуре 40 - 75^oС и при соотношении 50 90 мас. жирной кислоты с последующей подачей полученной смеси на вращающийся диск инкапсулятора, работающего в пределах 2000 4000 об/мин, при скорости подачи смеси на вращающийся диск 50 200 г/мин. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что жирной кислотой является стеариновая кислота. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что вращающийся диск работает со скоростью вращения 2500 3200 об/мин. 4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанные бактерии относятся к виду Enterococcus faecium. 5. Микрокапсула, содержащая лиофилизированную бактериальную культуру, инкапсулированную в жирной кислоте, отличающаяся тем, что она содержит сухие бактерии, микроинкапсулированные в С_1 2 С_2 4 жирной кислоте, и микрокапсула имеет следующий состав: жирная кислота от 50 до более 90 мас. и бактериальная культура остальное. 6. Микрокапсула по п. 5, отличающаяся тем, что микрокапсула имеет размер частиц 75 300 мкм. 7. Микрокапсула по п. 5, отличающаяся тем, что жирная кислота является стеариновой кислотой. 8. Микрокапсула по п. 5, отличающаяся тем, что бактерии относятся к виду Enterococcus faecium.