СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКОВОГО ГИДРОЛИЗАТА ДРОЖЖЕВОЙ БИОМАССЫ Российский патент 1998 года по МПК C12N1/06 A23J1/18 A23L1/28 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способам получения белковых гидролизатов дрожжевой биомассы и производства биологически активных продуктов пищевого, кормового и медицинского назначения.

Известны способы получения белковых гидролизатов дрожжевой биомассы путем воздействия на нее дрожжелитических ферментов из Actinomyces griseinus [1], Streptomyces griseus, Bacillus subtilis, Aspergillus awamori [2].

Недостатком данных способов является невысокая степень гидролиза высвободившегося белка из клетки дрожжей и низкий выход свободных аминокислот, а также высокий расход ферментов при сравнительно длительном процессе гидролиза.

Наиболее близким техническим решением по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения белковых гидролизатов дрожжей биомассы, предусматривающий гидролиз биомассы комплексным ферментным препаратом, обладающим амилолитической и протеолитической активностью с последующим выделением продуктов гидролитического расщепления [3]. В известном способе предусматривается гидролиз биомассы внесением стандартного ферментного препарата Оризин с активностью в культуре: по протеазе 2,0 ед. ПС/г, по α-амилазе 4,8 ед. AC/г.

Недостатком данного способа является низкая протеолитическая и амилолитическая активность используемого ферментного препарата, а также отсутствие в нем комплекса других гидролитических ферментов, например ксиланазы, экзо-β-глюканазы, цитазы, обеспечивающие наряду с гидролизатом белков расщепление других высокомолекулярных полимеров дрожжевой клетки, что снижает биологическую ценность и усвояемость получаемых гидролизатов. Кроме того, крайне низкий расход протеаз и α-амилазы при использовании препарата Оризин для гидролиза дрожжевой биомассы не обеспечивает интенсивного и глубокого гидролиза белков и полисахаридов клетки, что влечет за собой необходимость введения дополнительных технологических приемов, например, непрерывное удаление образовавшихся продуктов гидролитического расщепления через полунепроницаемые мембраны с последующим выделением на ионно-обменной смоле.

Техническим результатом настоящего изобретения является повышение глубины гидролиза белков и других высокомолекулярных полимеров дрожжевой клетки с улучшением качества белкового гидролизата биомассы, сокращение расхода ферментов, упрощение и удешевление процесса, а также обеспечение возможности использования в пищевых и кормовых целях нетоксичных гидролизатов без из предварительного выделения и очистки.

Для этого в способе получения белкового гидролизата дрожжевой биомассы, предусматривающем гидролиз биомассы ферментными препаратами, выделение гидролизата и сушку, в качестве ферментных препаратов используют комплексные ферментные препараты из микромицета Aspergillus oryzae шт. 387 (коллекционный номер F-683) - продуцента комплекса протеаз, α-амилазы и других сопутствующих гидролитических ферментов: экзо-β-глюканазы, ксиланазы, цитазы или его культуральную жидкость.

Штамм гриба Aspergillus oryzae 387 депонирован Всесоюзной коллекцией микроорганизмов института "ВНИИгенетика" 29 июня 1993 г., коллекционный номер F-683.

Морфология штамма. Мицелий сильно разветвленный, со вздутиями, септированный; диаметр гиф 10-12 мкм; форма конидий округлая цилиндрическая или неправильная; диаметр конидий 4,4-6,4 мкм; цвет - от оливково-желтого до темно-оливкового.

Культуральные признаки. На среде Чапека колонии круглые с ровными краями, граница ярко выражена; диаметр 6-7 мм; цвет - от оливково-желтого до грязно-зеленого. На среде с морковным агаром колонии с сильной радиальной и сегментной складчатостью; диаметр 100-120 мм; цвет - от грязно-зеленого до темно-песочного.

Микромицет культивируют глубинным способом на обычно применяемых для данного вида грибов средах, содержащих источники углерода, азота и минеральные соли, в аэробных условиях при 28-30^oC в течение 42-48 ч. Инокулятом может служить конидиальный или мицелиальный посевной материал. Продуцент синтезируют высокоактивный протеолитический комплекс, имеющий оптимум действия при pH 4,5-6,0, в состав которого входят: карбоксильная, металлозависимая и сериновая протеиназы, лейцинаминопептидаза. Обращенная протеолитическая активность в культуральной жидкости составляет 9,0-15,0 ед. ПС/мл, амилолитическая активность 10-16 ед. AC/мл, активность ксиланазы 50-75 ед./мл, экзо-β-глюканаз 0,3-0,5 ед./мл, цитазы 4,0-6,0 ед./мл. Штамм непатогенен.

Полученная таким образом культуральная жидкость используется для получения концентрированных ферментных препаратов методом спиртоосаждения при концентрации водно-спиртовой смеси 75%. Культуральная жидкость или ферментный препарат используются для гидролиза дрожжевой биомассы, который ведут при pH 4,5-6,0; кроме того, перед гидролизом проводят инактивацию дрожжей путем нагревания дрожжевой суспензии до температуры 70-85^oC в течение 15-20 мин; целесообразно при использовании в качестве дрожжевой биомассы пекарских, пивных или кормовых дрожжей гидролизат дрожжевой биомассы пастеризовать при 80-90^oC в течение 15-20 мин и сушить.

Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет наиболее полно извлекать все составные части дрожжевой биомассы под воздействием комплекса ферментов из Asp.oryzae 387 (F-683), вести процесс гидролиза при естественных значениях pH дрожжевой суспензии (pH 4,5-6,0 в зависимости от используемого вида дрожжей) и получать гидролизат дрожжей биомассы высокого качества с повышенным содержанием легкоусвояемых продуктов гидролиза белков, полисахаридов, нуклеиновых кислот, что является существенным отличием от известного. Кроме того, предлагаемый в изобретении штамм-продуцент и выделенные из культуральной жидкости ферментные препараты, не токсичны и не патогенны, в то время как в известных изобретениях часто используются актиномицеты, применение которых в пищевой промышленности строго ограничено из-за их способности продуцировать антибиотики. Получаемый по предлагаемому способу гидролизат не токсичен и может быть полностью без его выделения использован в пищевых или кормовых целях, то есть в предлагаемом изобретении возможно исключать стадии фильтрации или сепарирования гидролизата дрожжевой биомассы, а также выделения продуктов гидролиза через мембраны с последующей очисткой на ионно-обменной смоле, что значительно увеличивает выход целевого продукта с высоким качеством, упрощает и удешевляет процесс. Помимо перечисленных особенностей в предлагаемом изобретении значительно сокращается расход ферментных препаратов, так как их ферментативная активность в несколько раз превышает активность препарата в известном изобретении.

Способ осуществляют следующим образом. Используют водную суспензию дрожжей, в которую вносят комплексные ферментные препараты Aspergillus oryzae 387 (F-683) или его культуральная жидкость. При использовании живых клеток дрожжей для устранения процессов вспенивания и брожения перед гидролизом проводят инактивацию дрожжей путем нагревания дрожжевой суспензии до температуры 70-95^oC в течение 15-20 мин. Гидролиз ведут при значении pH дрожжевой суспензии 4,5-6,0, температуре 48-52^oC с постоянным перемешиванием. По окончании гидролиза смесь (белковый гидролизат дрожжевой биомассы) пастеризуют при 80-90^oC в течение 15-20 мин, сушат и используют в качестве продукта "Протамин" пищевого или кормового назначения; при необходимости белковый гидролизат дрожжевой биомассы освобождают от нерастворимых частиц и полученную растворимую фракцию используют для получения аминокислотных смесей медицинского назначения.

Пример 1. Готовится водная суспензия из 100 г сухих кормовых дрожжей, 260 мл воды и 100 мл культуральной жидкости, смесь тщательно перемешивают и нагревают до 50^oC, pH - 6,0. В качестве источника ферментов используют культуральную жидкость микромицета Aspergillus oryzae 387, полученную при культивировании на среде, содержащей, %: ячменную муку 4,0, KH₂PO₄ 1,0, водопроводная вода - остальное, pH - естественный. В аэробных условиях при 28-30^oC в течение 42-48 ч микромицет образует высокоактивный комплекс кислых и слабокислых протеаз с активностью протеолитического комплекса 15 ед. ПС/мл, α-амилазы 14 ед. /мл, сопутствующих ферментов: ксиланазы 58 ед./мл, экзо-β-глюканазы 0,3 ед./мл, цитазы 5,0 ед/мл. Культуральную жидкость дозируют из расчета 15 ед. ПС на 1 г сухих дрожжей. Протеолиз 20%-ной дрожжевой суспензии проводится при естественном pH, в течение 4 ч при 50±2^oC с постоянным перемешиванием. Об окончании протеолиза судят по нарастанию концентрации аминного азота и растворимых сухих веществ в фугате. По окончании гидролиза смесь (гидролизат) нагревают до 85^oC в течение 15 мин, а затем разделяют на две части. I-ую часть сушат на распылительной сушилке. II-ую часть фильтруют (фугуют), полученную растворимую фракцию сушат на распылительной сушилке.

В результате гидролиза высовобождается 63% свободных аминокислот, концентрация аминного азота составляет: 5,8% в I-ой части и 7,6% во II-ой части полученного гидролизата, протеина 47,5 и 62,5%, редуцирующих веществ 18,9 и 21,8% соответственно. Выход гидролизата составил 87% (I часть) и 67% (II часть).

Пример 2. Готовится 20%-ная водная суспензия из прессованных хлебопекарских дрожжей (pH 5,5) и нагревается до 95^oC в течение 15 мин, затем охлаждается до 50^oC и задается ферментный препарат из гриба Asp.oryzae 387 (активность по протеолитическому комплексу 1500 ед. ПС/г; по α-амилазе 1600 ед. AC/г; по экзо-β-глюканазе 180 ед./г; по цитазе - 520 ед./г) из расчета 20 ед. ПС/г сухих дрожжей.

Ферментный препарат получен стандартным методом осаждения спиртом из культуральной жидкости Aspergillus oryzae 387 при концентрации водно-спиртовой смеси 75%. Гидролиз проводится аналогично примеру 1. По окончании гидролиза смесь (гидролизат) нагревают до 80^oC и выдерживают 20 мин, а затем разделяют на две части и обрабатывают как в примере 1.

В результате гидролиза высвобождаются 37% свободных аминокислот, концентрация аминного азота составляет: 3,2% в I-ой части и 4,8% во II-ой части гидролизата, протеина 44,1% и 62,2%, редуцирующих сахаров 13,4% и 21,6% соответственно. Выход гидролизата составил 85% (I часть) и 62% (II часть).

Пример 3. Готовится 10%-ная водная суспензия остаточных пивных дрожжей, pH 4,5 (предварительно остаточные пивные дрожжи обезгоричиваются и тщательно промываются водой), нагревается до 70^oC в течение 20 мин, охлаждается до 50^oC и задается ферментный препарат из гриба Asp.oryzae (ПС-1300 ед./г) или культуральная жидкость (ПС 13 ед./мл) из расчета 15 ед. ПС/г сухих дрожжей. Гидролиз проводит аналогично примеру 1. По окончании гидролиза смесь (гидролизат) нагревают до 90^oC в течение 15 мин, затем разделяют на две части и обрабатывают как в примере 1.

В результате гидролиза высовобождается 47% свободных аминокислот, концентрация аминного азота составляет: 2,9% в I-ой части и 4,5% во II-ой части получаемого гидролиза, протеина 42,7% и 58,1%, редуцирующих сахаров 6,6% и 11,5% соответственно.

Пример 4. Получение белковых гидролизатов из хлебопекарных дрожжей в производственных условиях. В реактор загружают 1500 кг сухих хлебопекарных дрожжей, добавляют 6 м³ воды, перемешивают, pH 5,2. Суспензию нагревают до 85^oC и выдерживают в течение 20 мин, затем охлаждают до 50^oC и задают 3 м³ культуральной жидкости гриба Asp.oryzae (ПС 10 ед./мл). Гидролиз проводится при постоянном перемешивании, температуре 48-50^o в течение 5 ч. По окончании гидролиза полученный ферментолизат прогревали при 90^oC в течение 20 мин, затем разделяли на две части. I-ую часть (5 м³) сушили на распылительной сушилке, а II-ую подвергали сепарации и полученную надосадочную жидкость (фугат) также сушили на распылительной сушилке.

В результате получены сухой гидролизат биомассы дрожжей и сухой фугат гидролизата биомассы дрожжей с содержанием аминного азота 3,1% и 4,6%, редуцирующих углеводов 12,0% и 19,4%, протеина 42,0% и 61,8% соответственно.

Пример 5. Получение белковых гидролизатов из остаточных пивных дрожжей в производственных условиях пивоваренного завода.

В реактор подавали предварительно отмытые и обезгоричные остаточные пивные дрожжи в количестве 2 м³, pH суспензии естественный 4,9. Концентрация дрожжей составила 10%. Водную суспензию дрожжей прогревали при 70^oC в течение 20 мин, затем охлаждали до 50^o и задавали 3 кг ферментного препарата Амилопротооризин, полученного из культуральной жидкости гриба A.oryzae 387, активность препарата составляла 1000 ед. ПС/г. Гидролиз проводили в течение 4 ч при постоянном перемешивании при 48-52^oC. По окончании процесса полученный ферментолизат пастеризовали при 80^o в течение 15 мин, затем сушили на распылительной сушилке. В результате получен сухой гидролизат дрожжей с содержанием аминного азота 3,1%, протеина 45,8%, регулирующих углеводов 6,0%.

Сравнительная характеристика качественного состава гидролизатов хлебопекарных дрожжей по предлагаемому и известному способам представлена в таблице.

Литература
1. Коновалов С. А. , Воротило С.П., Соколова Л.Б. Ферментативный метод разрушения клеточных стенок дрожжей //Прикл. биохимия и микробиол. 1975, 11, N4, с. 620-622.

2. Максимова Г.Н., Воробьева Г.И., Мосин В.А., Максимов В.И. Роль протеаз и β-глюканаз в лизисе клеточных стенок дрожжей //Прикл. биохимия и микробиол. 1976, 12, N3, с. 327-333.

3. Авторское свидетельство N 340689, кл. С 12 N 1/20, 1972.

Использование: микробиологическая промышленность, получение белковых гидролизатов дрожжей биомассы. Сущность способа: готовят водную суспензию дрожжей, затем вносят ферменты, полученные из штамма микромицета ВКПМF-683, или его культуральную жидкость и выдерживают для гидролиза биомассы при pH 4,5-6,0. При использовании живых клеток дрожжей их инактивируют путем нагревания до температуры 70-95^oC в течение 15-20 мин. После гидролиза гидролизат пастеризуют при 80-90^oC в течение 15-20 мин и сушат. При необходимости из гидролизата удаляют нерастворимые вещества. 3 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ получения белкового гидролизата дрожжевой биомассы, предусматривающий гидролиз биомассы ферментами и сушку, отличающийся тем, что в качестве ферментов используют ферменты, полученные на основе штамма микромицета Aspergillus oryzae ВКПМ F-683-продуцента комплекса протеаз, α- амилазы и других сопутствующих гидролитических ферментов экзо- β- глюконазы, ксиланазы, цитазы, или его культуральную жидкость, а гидролиз биомассы ведут при рН 4,5 6,0. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что перед гидролизом биомассу инактивируют путем ее нагревания до 70 95^oС в течение 15 20 мин. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что полученный гидролизат дрожжевой биомассы пастеризуют при 80 90^oС в течение 15 20 мин и сушат. 4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что после гидролиза биомассы из гидролизата удаляют нерастворимые вещества, а сушке подвергают растворимую фракцию гидролизата.