ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРОМИЦЕТОВ ASPERGILLUS ORYZAL - ПРОДУЦЕНТОВ ГИДРОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ Российский патент 1996 года по МПК C12N1/14 C12N1/14 C12R1/69 

Изобретение относится к микробиологическому синтезу и предназначено для использования в производстве гидролитических ферментов.

Известны питательные среды для культивирования микромицетов Aspergillus oryzae, содержащие крахмал, пептон, ржаную муку, сернокислый магний [1]
Недостатками этих питательных сред являются их дороговизна и отсутствие необходимых для стимуляции синтеза гидролитических ферментов белковых субстратов, при этом уровень активности гидролаз на данных средах низкий и варьирует по протеазе в пределах 2,5-3,0 ед ПС/мл, по α-aмилазе 43,0-4,9 ед АС/мл.

Из известных питательных сред, используемых для глубинного культивирования микромицетов Asp. oryzae, наиболее близкой по технической сущности является питательная среда для биосинтеза гриба Asp.oryzae ВКПМ-369, содержащая, ячменную муку 14-20; соевую муку 0,5-3,0; однозамещенный фосфорнокислый калий 0,5-1,0; ферментный препарат α-амилазы 0,5-1,0 ед/г крахмала [2]
Основным недостатком этой питательной среды является низкий синтез гидролитических ферментов из-за использования высоких концентраций крахмалсодержащего сырья, что приводит к замедлению биосинтеза ферментов, вследствие чего к 42-48 ч роста продуцента не достигается конечный показатель уровня активности гидролаз, который имеет место только на 4-5 сут культивирования. Кроме того, применение высоких концентраций ингредиентов среды, особенно соевой муки, вызывает обильное пенообразование, что затрудняет внедрение этой среды в производство; использование большого количества ячменной и соевой муки, в 4-5 превышающее концентрацию крахмалсодержащего сырья в предлагаемом изобретении, ведет к значительному увеличению себестоимости среды и повышению более чем в 2 раза длительности процесса культивирования.

Задачей изобретения является увеличение синтеза всех гидролитических ферментов, продуцируемых микромицетами Asp. oryzae (например, протеаз, α-амилазы), а также усиление направленного синтеза отдельных гидролаз комплекса с повышением их секреции из клетки и сокращение длительности культивирования продуцентов.

Введение в питательную среду для культивирования микромицетов Asp.oryzae источника белка, в качестве которого можно использовать дрожжи кормовые, пекарские, остаточные пивные, БВК и/или пшеничные отруби, в совокупности с крахмалсодержащим сырьем и фосфорнокислым калием в указанных соотношениях увеличивает синтез комплекса гидролитических ферментов, так как в результате синергического эффекта используемых компонентов повышается биосинтетическая способность гриба, усиливается секреция ферментов из клетки. Содержащиеся в натуральных источниках белка биологически активные вещества аминокислоты, витамины, макро- и микроэлементы, поверхностно-активные вещества оказывают стимулирующее воздействие на рост продуцента, усиливают прорастание новых гиф мицелия. Присутствующие в среде крахмал и белок, являющиеся не только источниками питания, но и индукторами синтеза протеаз и амилаз, при этом способствуют более интенсивному обмену веществ, стимулируя биосинтез гидролаз, что вызывает увеличение количества везикул с повышенным содержанием ферментов, а внесенные в среду культивирования с минеральными солями катионы, способные нейтрализовать отрицательный заряд цитоплазматических мембран клеток, по-видимому, воздействуют на секрецию экзогидролаз, тем самым увеличивая выход ферментов. Изменение соотношения вводимых компонентов в пределах, указанных в изобретении, вызывают направленный синтез тех или иных ферментов, например, протеолитического и амилолитического действия в зависимости от поставленных задач, так как происходит перераспределение продуктов питания и соотношения углерода и азота. Изменяется также и pH среды, при этом регулируется секреция ферментов из клетки, а в зависимости от наличия в среде белка меняется профиль активности кислых, нейтральных и щелочных протеаз. И хотя введение пшеничных отрубей, кормовых, пекарских, остаточных пивных дрожжей и БВК известное техническое решение в микробиологии. (Грачева И.М. Технология ферментных препаратов, М. Пищ.пром-ть, 1975), использование их в совокупности с крахмалсодержащим сырьем, в качестве которого обычно используется кукурузная, пшеничная или ячменная мука, и фосфорнокислым калием, а также в оптимальных количествах и сбалансированных соотношениях при глубинном выращивании именно Asp.oryzae позволяет повысить выход ферментов в результате взаимного действия указанных ингредиентов, регулировать соотношение синтезируемых гидролаз, а также сократить длительность культивирования, т.е. обеспечивается неожиданный новый технический результат, при этом придаются новые свойства ферментативному комплексу. Для усиления этого эффекта можно также добавлять детергенты, такие как проксанол и фталат ЦС-21, позволяющие повысить секрецию гидролитических ферментов из клеток микроорганизма.

Питательная среда, содержащая в качестве источника углеводов крахмалсодержащее сырье, необходимые минеральные соли фосфорнокислого калия и воду, для достижения технического результата, заключающегося в увеличении синтеза всех гидролитических ферментов, продуцируемых микромицетами Asp.oryzae, усилении направленного синтеза отдельных гидролаз комплекса с повышением их секреции из клетки и сокращении длительности культивирования, согласно изобретению в качестве источника белка содержит дрожжи кормовые, или пекарские, или остаточные пивные, или белково-витаминный концентрат, или пшеничные отруби при следующем соотношении ингредиентов, мас. Источник углеводов 2,0-4,0 Источник белка 0,5-4,0 Калий фосфорнокислый однозамещенный 1,5 Вода Остальное
При этом дрожжи кормовые, или пекарские, или остаточные пивные, или БВК вводятся в количестве 0,5-1,5 мас. а пшеничные отруби в количестве 1,0-4,0 мас. Рекомендуется также дополнительно в питательную среду вводить детергенты проксанол в количестве 0,01-0,03 мас. или фталат в количестве 0,05-0,15 мас.

Питательную среду готовят следующим образом. В воду добавляют крахмалсодержащее сырье, источники белка, минеральные соли; среда перемешивается в колбах Эрленмейера и стерилизуется при 0,1 МПа в течение 1 ч. Посевной материал задается в виде суспензии конидий или мицелия гриба. Культивирование проводят при постоянном перемешивании в течение 42-48 ч при 30^оС.

П р и м е р 1. Микромицет Aspergillus oryzae культивируют в 750 мл колбах Эрленмейера с 50 мл среды следующего состава, мас. крахмалсодержащее сырье 4,0 (пшеничная мука 2,0 и кукурузная мука 2,0); пшеничные отруби 1,5; БВК 0,5; КН₂РО₄ 1,5. На 42 ч роста активность ферментов в культуральной жидкости составила, ед/мл: ПС=10,2; АС=12,8 (активность определяли по ГОСТ 20264.2-89 и 20264.4-89 при pH 4,7-5,3).

П р и м е р ы 2-23, позволяющие определить оптимальную концентрацию белковых субстратов, приведены в табл.1.

В табл. 2 приведены примеры 24-33, показывающие эффективность использования в составе питательных сред для культивирования микромицетов Asp.oryzae белковых субстратов и крахмалсодержащее сырье в различных соотношениях.

Влияние детергентов приведено в табл.3. В качестве фона использовали среды из примеров 1 и 32. Аналогичная закономерность увеличения выхода протеолитических ферментов при введении в состав среды детергентов отмечалась и на других средах. В примерах 1-37 приведены результаты исследований, полученные при культивировании микромицета Asp.oryzae шт. 387 (ВКПМF-683).

В табл.4 приведена сравнительная оценка по результатам биологической активности грибов Asp.oryzae продуцентов гидролитических ферментов, культивируемых на средах из примеров 1 и 21.

Как видно из таблиц только данный состав среды, количество и соотношение ингредиентов, указанные в формуле, обеспечивают получение технического результата, т.е. указанная совокупность существенных признаков обеспечивает получение нового технического результата: увеличение выхода гидролитических ферментов, получение ферментативного комплекса с заданным соотношением гидролитических ферментов.

Использование: в биотехнологии, в производстве гидролитических ферментов. Сущность изобретения: направленное увеличение синтеза отдельных гидролаз комплекса и повышение их секреции из клетки. Питательная среда для культивирования Aspergillus oryzal содержит в качестве источника углеводов крахмалсодержащее сырье, необходимые минеральные соли фосфорнокислого калия и дополнительно источники белка и детергенты в следующих количествах мас.%: крахмалосодержащее сырье 3-4; пшеничные отруби 1-4; дрожжи кормовые, или пекарские, или остаточные пивные, или белково-витаминный концентрат 0,5-1,5; проксанол 0,01-0,03 или фталат (ЦС-21) 0,05-0,15. 2 з. п. ф-лы, 4 табл.

1. Питательная среда для культивирования микромицетов Aspergillus oryzae продуцентов гидролитических ферментов, содержащая в качестве источника углеводов крахмалсодержащее сырье, источник белка, источник минеральных солей фосфорнокислый калий однозамещенный и воду, отличающаяся тем, что она в качестве источника белка содержит дрожжи кормовые, или пекарские, или остаточные пивные, или белково-витаминный концентрат при следующем соотношении ингредиентов, мас.

Источник углеводов 2,4 4,0
Источник белка 0,5 4,0
Калий фосфорнокислый однозамещенный 1,5
Вода Остальное
2. Среда по п. 1, отличающаяся тем, что она содержит дрожжи кормовые, или пекарские, или остаточные пивные, или белково-витаминный концентрат в количестве 0,5 1,5 мас. или пшеничные отруби в количестве 1,0 4,0 мас.