СПОСОБ УЛЬТРАСТРУКТУРНОЙ ОЦЕНКИ ПЕРФУЗИОННОЙ СПОСОБНОСТИ КАПИЛЛЯРОВ МИОКАРДА Российский патент 1998 года по МПК A61B5/02 

Изобретение относится к медицине, в частности к патофизиологии и патологической анатомии, а именно к ультраструктурным оценкам капиллярного русла миокарда, и может быть использовано для оценки антистрессовой и антигипоксической гипотермической защиты миокарда при длительных остановках кровообращения.

Известно, что в нормальном миокарде часть капилляров активно функционирует и перфузируется кровью, тогда как определения доля капилляров находится в резервуаре и не функционирует. Количество открытых и закрытых капилляров регулируется, в основном, резистивными микрососудами и прекапиллярными сфинкерами. Капиллярный резервно значительно варьирует при различных патофизиологических воздействиях. Степень реализации данного резерва при воздействиях можно оценить, учитывая только изменения числа открытых и закрытых капилляров. Такая оценка будет объективной, например, при повышенной физической нагрузке, когда достоверно показано, что адекватный кровоток в интенсивно работающем органе поддерживается главным образом раскрытием дополнительных (ранее закрытых) капилляров. При других воздействиях, например, в случае продолжительной ишемии органа информация, касающаяся реализации капиллярного резерва, весьма противоречива. По данным одних авторов в этих условиях количество открытых капилляров увеличивается, по данным других уменьшается или вообще не меняется [1].

Следовательно, существуют патофизиологические состояния, в которых невозможно определить степень реализации капиллярного резерва, основываясь лишь на подсчете числа открытых и закрытых капилляров. Особенно это касается состояний, включающих многофакторные воздействия. Например, когда возникает необходимость изучить протекторные эффекты или иных препаратов или физических факторов (гипотермии) на ишемизированный миокард, а также определить резервы адаптации сосудистого русла в экспериментальной модели, включающие в себя несколько этапов, сравниваемых между собой и контролем, подсчет числа открытых капилляров не всегда может дать объективную характеристику изменений, происходящих в микроциркуляторном русле. Этот показатель может оказаться одинаковым на разных этапах эксперимента при защите миокарда и без нее, так как он не учитывает возможности регуляции кровотока на уровне самих капилляров. Вместе с тем, попытки учесть влияние некоторых механизмов регуляции регионарного кровтока, действующих в условиях патологии, на уровне собственно капилляров, например, влияние сладжа форменных элементов крови и отека эндотелиальной выстилки сосудов, несистематизированы и наносят описательный характер [2].

Цель изобретения - более точное определение и уточнение функционального резерва капиллярного русла миокарда после длительных остановок кровообращения в условиях бесперфузионной гипотермической защиты.

Поставленная цель достигается тем, что после длительных остановок кровообращения в условиях бесперфузионной гипотермической защиты, в совокупности закрытых капилляров, представляющих собой функциональный резерв обменного звена микроциркуляторного русла миокарда, вычисляют долю закрытия капилляров физиологическими и патологическими механизмами. При получении для последних значения 30% и более на глубине окклюзии защита считается неадекватной, а возможности реперфузии ограниченными.

Для осуществления способа используют контроль (собаки, забитые под наркозом); модели тотальной ишемии миокарда путем пережатия магистральных сосудов сердца наркотизированных собак, находящихся в условиях искусственной вентиляции легких : а) без гипотермической защиты длительностью 30 мин, б) в условиях общей умеренной (28-30^oC) бесперфузионной гипотермии длительностью 30 мин, в) в условиях глубокой (22-24^oC) бесперфузионной гипотермии длительностью 60 мин.

Способ осуществляется следующим образом.

На основных этапах операции иссекают небольшие кусочки миокарда (биоптаты). В нормотермическом эксперименте биоптаты получают в конце окклюзии, на этапе реперфузии при попытках восстановить сердечную деятельность, а в сериях с гипотермическими остановками сердца на этапе охлаждения перед окклюзией сосудов, в конце окклюзионного периода, на этапе реперфузии - согревания на третьи сутки после операции. Также биоптаты получают и в группе сравнения или контроля, то есть у собак, забитых при нормальной температуре тела.

Сразу после забора биоптаты помещают в охлажденную смесь, содержащую 2% р-р параформа и 2,5% р/р глутарового альдегида на 0,1 М фосфатном буфере pH 7,3. Материал дофиксируют в 1%-ном р-ре четырехокиси осмия на том же фосфатном буфере, обезвоживают в охлажденных растворах спиртов и ацетонов возрастающей концентрации и заливают в смесь Эпона и Аралдита. Затем на ультрамикротоме получают ультратонкие срезы толщиной 700-800 A, которые контрастируют уранилацетатом и цитратом свинца и просматривают в электронном микроскопе.

Непосредственно в электронном микроскопе определяют степень перфузируемости капилляров и дополнительно механизм выключения капилляров из кровотока. Для этого подсчитывают общее количество капилляров на срезе и вычисляют процентное соотношение капилляров с открытым и закрытым просветом. Среди закрытых капилляров определяют количество тех, которые закрыты физиологическими механизмами, - за счет разворота ядра эндотелиальной клетки в просвет сосуда и за счет пассивного спадения просвета до щелевидного, а также закрытых патологическими механизмами - за счет отека эндотелиальных клеток и за счет сладжа форменных элементов крови.

После этого адекватность защиты перфузионной способности капиллярного русла миокарда оценивают по процентному соотношению капилляров, закрытых за счет патологических механизмов к общему числу нефункционирующих капилляров на этапах нормотермических и гипотермических остановок сердца. При нормотермии уже на этапе окклюзии число капилляров, закрытых патологическими механизмами, превышает 30% (см. табл.) от числа всех закрытых капилляров. При этом на этапе реперфузии это число продолжает увеличиваться как за счет роста числа капилляров, закрытых сладжем, так и за счет вовлечения все большего количества отечных эндотелиальных клеток в выключение капилляров из кровотока. В отличие от этого на глубине гипотермических окклюзий число закрытых капилляров патологическими механизмами не превышает 26%, а на этапе реперфузии уменьшается. На третьи сутки после гипотермических окклюзий число закрытых капилляров приближается к контролю.

Пример 1 (контроль). У двух беспородных собак, самок массой 4 кг 550 г и 8 кг 550 г при эвтаназии (забое) под нембуталовым наркозом (25 мг/кг) с предварительной премедикацией промедолом (1 мл/кг 2% р-ра) были получены биоптаты миокарда левого желудочка. Согласно предлагаемому способу в процессе электронно-микроскопического анализа биоптатов у каждой собаки определялись следующие показатели
Собака 1:
а) число открытых капилляров - 101
б) число закрытых капилляров - 12
в) число капилляров, закрытых физиологическими механизмами - 10
г) число капилляров, закрытых патологическими механизмами - 2
Собака 2:
а) число открытых капилляров - 126
б) число закрытых капилляров - 9
в) число капилляров, закрытых физиологическими механизмами - 8
г) число капилляров, закрытых патологическими механизмами - 1
Общее число закрытых капилляров принималось за 100% и рассчитывались следующие пропорции:
12 капилляров - 100%
2 капилляра - X
9 капилляров - 100%
1 капилляр - X
Таким образом X или процент капилляров, закрытых патологическими механизмами, у собаки 1 был равен 17%, а у собаки 2 - 11%.

Пример 2 (ишемия миокарда без защиты). Беспородной собаке, самцу массой 5 кг 200 г за 1 ч до операции делали премедикацию подкожным ведением промедола из расчета 1 мг/кг 2% р-ра и атропина сульфата 0,1% р-р 0,05 мг/кг. После этого проводили вводный наркоз внутривенным введением 10 мг/кг нембутала, интубировали трахею и переводили собаку в режим ИВЛ. Далее следовали торакотомия и пережатие магистральных сосудов длительностью 30 мин в условиях нормотермии. После окончания окклюзии собаке делались попытки восстановить сердечную деятельность путем многократных дефибрилляций м введения больших доз кардиотоников. Восстановить стабильную гемодинамику не удалось и через 4 ч после операции собака погибла. Биоптаты для электронной микроскопии получали из стенки левого желудочка на 30-й минуте окклюзии и через 20-25 мин реанимационных мероприятий. Согласно предлагаемому способу в биоптатах определялись следующие показатели.

В конце окклюзии
а) число открытых капилляров - 87
б) число закрытых капилляров - 13
в) число капилляров; закрытых физиологическими механизмами - 7
г) число капилляров, закрытых патологическими механизмами - 6
На реперфузии в зоне восстановленного кровотока
а) число открытых капилляров - 39
б) число закрытых капилляров - 37
в) число капилляров, закрытых физиологическими механизмами - 15
г) число капилляров, закрытых патологическими механизмами - 22
Составлялась пропорция:
13 капилляров - 100%
6 капилляров - X X = 46%
37 капилляров - 100%
22 капилляра - X X = 59%
В зоне невосстановленого кровотока все 100% капилляров, выключенных из кровотока, были закрыты патологическими механизмами.

Пример 3 (адекватная защита ишемизированного миокарда). Беспородной собаке, самке массой 11 кг 500 г проводили премедикацию и вводный наркоз по схеме, изложенной в примере 2. После интубации трахеи и перевода собаки на ИВЛ осуществляли наружное охлаждение животного в ванне в водой (4^oC), дополнительно обложив поверхность тела собаки мелкоколотым льдом. По достижении температуры в прямой кишке 24^oC производили пережатие магистральных сосудов и сердца длительностью 60 мин. Для быстрой остановки сердца применяли кардиоплегический раствор Бунатяна, который вводили в корень аорты и полость левого желудочка. По окончании окклюзии удалялись зажимы с магистральных сосудов и производились реанимационные мероприятия, включающие прямой массаж сердца, согревание его теплым (35-40^oC) физ. раствором и стимуляцию кардиотониками. После восстановления работы сердца собаку согревали снаружи теплой водой (45^oC). По ходу согревания наркоз углубляли нембуталом из расчета 4-5 мг/кг. Грудную клетку ушивали по достижении температуры в прямой кишке 35-36^oC. Послеоперационный период протекал без осложнений. Биоптаты для электронной микроскопии получали из стенки левого желудочка на 59-50 мин окклюзии и на этапе согревания перед ушиванием грудной клетки. По предлагаемому способу на срезах, полученных от указанных биоптатов определяли следующие показатели.

В конце 60 мин гипотермической окклюзии :
а) число открытых капилляров - 78
б) число закрытых капилляров - 43
в) число капилляров, закрытых физиологическими механизмами - 34
г) число капилляров, закрытых патологическими механизмами - 9
На этапе реперфузии-согревания
а) число открытых капилляров - 50
б) число закрытых капилляров - 40
в) число капилляров, закрытых физиологическими механизмами - 37
г) число капилляров, закрытых патологическими механизмами - 3
43 капилляра - 100%
9 капилляров - X X = 21%
40 капилляров - 100%
3 капилляра - X X = 8%
Пример 4 (неадекватная защита ишемизированного миокарда). Беспородной собаке, самцу массой 9 кг 900 г проводили премедикацию, вводный наркоз, интубацию трахеи и наружное охлаждение по схеме, изложенной в примерах 2 и 3. Собаку охлаждали до температуры в прямой кишке 24^oC. По ходу охлаждения при достижении температуры 29^oC возникла желудочковая фибрилляция, которую устранили одним разрядом дефибриллятора, затем при 26^oC возникла повторная фибрилляция, которую удалось устранить уже с пятью разрядами дефибриллятора. После устранения гемодинамических нарушений охлаждение продолжали и при 24^oC была выполнена окклюзия магистральных сосудов сердца длительностью 60 мин. По окончании окклюзии были проведены реанимационные мероприятия по схеме, изложенной в примере 3. У собаки в раннем послеоперационном периоде отмечались признаки неврологических расстройств, а на третьи сутки при забое были обнаружены очаговые повреждения миокарда на фоне дилятации полостей сердца. Биоптаты для электронной микроскопии были взяты в конце 60 мин. гипотермической окклюзии и в конце согревания при 35-36^oC. Предлагаемым способом на срезах, полученных от указанных биоптатов, определялись следующие показатели.

В конце окклюзии
а) число открытых капилляров - 45
б) число закрытых капилляров - 35
в) число капилляров, закрытых физиологическими механическими - 21
г) число капилляров, закрытых патологическими механизмами - 14
На этапе реперфузии-согревания
а) число открытых капилляров - 100
б) число закрытых капилляров - 17
в) число капилляров, закрытых физиологическими механизмами - 8
г) число капилляров, закрытых патологическими механизмами - 9
35 капилляров - 100%
14 капилляров - X X = 40%
17 капилляров - 100%
9 капилляров - X X = 53%
Вывод. Предлагаемый способ обеспечивает объективную оценку перфузионной способности капилляров миокарда при различных патофизиологических состояниях: ишемии, охлаждении, реперфузии. Показатели, полученные этим способом, более точно характеризуют уровень и степень того или иного способа защиты миокарда при длительных остановках кровообращения, чем оценка изменений перфузионной способности микроциркуляторного русла миокарда только по числу открытых и закрытых капилляров, поскольку последний показатель малоинформативен и может быть приблизительно одинаковым как на этапах нормотермических, так и гипотермических остановок сердца, не позволяя тем самым прогнозировать течение послеоперационного периода. Предлагаемый способ позволяет определить патогенетические звенья для медикоментозной коррекции изменений, возникающих в капиллярном русле и тем самым усилить уровень защиты миокарда от ишемических и реперфузионных повреждения путем дальнейшего совершенствования метода бесперфузионной гипотермии. Применение данного способа в патологоанатомической практике и судебной медицине позволит ввести объективные критерии развития острой коронарной недостаточности на уровне микроциркуляторного русла в случаях отсутствия макроскопических признаков выключения крупных сосудов из кровообращения (обтурация их просвета тромбами, атеросклеротическими бляшками или эмболами).

Способ может быть использован в медицине, в частности, в патофизиологии и патологической анатомии, а именно для ультраструктурной оценки капиллярного русла миокарда и для оценки антистрессовой и антигипоксической гипотермической защиты миокарда при длительных остановках кровообращения. Иссекают кусочки миокарда (биоптаты), из них готовят ультратонкие срезы, которые контрастируют и просматривают в электронном микроскопе, определяют степень перфузируемости капиллярного русла миокарда по числу открытых и закрытых капилляров и дифференцировано определяют механизмы выключения капилляров из кровотока в группе закрытых капилляров. Соотношение капилляров, закрытых за счет патологических механизмов к общему числу нефункционирующих капилляров, позволяет более точно оценивать способность капилляров миокарда при различных патофизиологических состояниях, позволяя прогнозировать течение послеоперационного периода у кардиохирургических больных, а также определять патогенетические звенья для медикаментозной коррекции изменений и тем самым усиливать уровень защиты миокарда от ишемических и реперфузионных повреждений. 1 табл.

Способ ультраструктурной оценки перфузионной способности капилляров миокарда, включающий определение степени перфузируемости капиллярного русла по числу открытых и закрытых капилляров, отличающийся тем, что дополнительно в группе закрытых капилляров дифференцированно определяют число капилляров, закрытых по физиологическому механизму выключения капилляров - развороту ядра эндотелиальной клетки в просвет сосуда и пассивного спадения просвета капилляра и по патологическому механизму - отеку эндотелиальной клетки и сладжа форменных элементов крови, затем определяют соотношение числа капилляров, закрытых по патологическому механизму, к общему числу закрытых капилляров и при значении 30% и менее определяют достаточность резерва капиллярного русла миокарда, а при значении более 30% возможности реперфузии ограничены, а резерв капиллярного русла недостаточен.