СПОСОБ ДЕЗИНТЕГРАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ КЛЕТОК Российский патент 1998 года по МПК C12M1/33 

Предлагаемое изобретение относится к технике дезинтеграции биологических клеток и может найти применение в биотехнологии, микробиологии, медицине, пищевой промышленности, экологии и т.д.

Известны способы дезинтеграции микробных клеток посредством воздействия на клетки микроорганизмов ультразвуковыми волнами большой интенсивности [1].

К основным достоинствам этих способов относятся возможность задания и регулирования в широких пределах необходимых параметров дезинтеграции и относительно простая аппаратурная реализация этих способов. Однако в ряде приложений стремление достичь полной дезинтеграции микроорганизмов приводит к потере ряда ценных компонентов дезинтеграта из-за нагрева среды в поле интенсивного ультразвука.

Известен также способ дезинтеграции посредством воздействия на микроорганизмы электрическим полем, реализованный в устройстве, описанном в работе [2].

Недостатком этого способа является невысокая эффективность разрушения клеток микроорганизмов в полях с напряженностью, не превышающей значений, при которых в жидкости возникает электрический пробой, приводящий к разрушению ценных компонентов дезинтеграта.

Наиболее близким к заявляемому является способ дезинтеграции биологических клеток, заключающийся в том, что на жидкую среду с биологическими клетками воздействуют ударно-волновыми акустическими импульсами [3].

В этом способе разрушение биологических клеток обеспечивается мощными импульсами давления короткой длительности, характерной особенностью которых являются полуволна положительного давления большой амплитуды с резким фронтом и следующая за ней полуволна отрицательного давления. Этот способ реализуется с использованием генераторов ударных волн различного типа. Однако наиболее чистые условия дезинтеграции обеспечиваются при использовании безискровых генераторов, например индуктивных.

Недостатком известного способа является сравнительно невысокая эффективность разрушения микробных клеток, обусловленная довольно низким коэффициентом преобразования энергии ударно-волнового импульса в энергию механических напряжений в плазматической мембране с интенсивностью, превышающей порог прочности.

Целью предлагаемого изобретения является повышение эффективности разрушения мембран клеток, вплоть до тотального разрушения всех клеток.

Поставленная цель достигается тем, что в способе дезинтеграции биологических клеток, заключающемся в том, что на жидкую среду с биологическими клетками воздействуют ударно-волновыми акустическими импульсами, предлагается одновременно с прохождением в среде ударно-волнового акустического импульса, состоящего по крайней мере из одной фазы сжатия и одной фазы растяжения, возбуждать в среде импульсное электрическое поле, амплитуда которого превышает критическое (пороговое) значение напряженности поля электрического пробоя цитоплазматической мембраны с образованием поры при амплитудном значении давления в фазе сжатия ударно-волнового акустического импульса, но меньше критической напряженности поля электрического пробоя жидкой среды, при этом амплитуда давления в фазе растяжения превышает критическую величину отрицательного давления, при котором обеспечивается рост диаметра поры, а длительность фазы растяжения превышает временной интервал достижения величины диаметра поры необратимого значения.

Предлагаются также признаки, конкретизирующие временные режимы возбуждения электрического поля в жидкой среде.

Предлагается длительность импульсов электрического поля выбирать в микросекундном диапазоне.

Предлагается длительность импульсов электрического поля выбирать в наносекундном диапазоне.

Предлагается импульсы электрического поля генерировать в виде пачек импульсов, в которых интервал времени между импульсами находится в диапазоне длительности фазы положительного давления ударно-волнового акустического импульса, а длительность пачки - в диапазоне интервала времени существования в среде ударно-волнового акустического импульса.

Предлагается также возбуждать в среде ударно-волновой импульс в виде плоской волны.

Предлагается также возбуждать в среде ударно-волновой импульс в виде цилиндрической сходящейся волны, дополнительно создавать в среде неоднородное переменное электрическое поле для осуществления диэлектрофореза со сбором мокроорганизмов вблизи оси схождения волны, а импульсное электрическое поле возбуждать в радиальном направлении перпендикулярно оси схождения волны.

Предлагается также возбуждать ударно-волновой импульс посредством сжатия среды квазипостоянным давлением с последующей быстрой разгрузкой.

Предлагается также создавать ударно-волновой импульс в виде последовательности цугов ультразвуковых волн.

Способ реализуется с помощью устройства, варианты которого показаны на фиг. 1 и 2. На фиг. 3 а, б показаны типичные формы ударно-волновых импульсов.

Устройство для реализации способа состоит из кюветы 1 с электродами 2, 3 либо плоской формы (фиг. 1), либо цилиндрической формы (фиг. 2). Электроды могут иметь или непосредственный контакт со средой, или отделены от среды слоем изоляции с малой диэлектрической проницаемостью. Кюветы сопряжены с устройством формирования в среде ударно-волнового акустического импульса 4, в качестве которого может быть использован любой известный генератор ударно-волновых акустических импульсов, например пьезоэлектрический, электромагнитный, электрогидравлический, лазерный и т.д.

На фигурах показаны варианты с использованием электромагнитного генератора, состоящего из спиральной катушки 5 либо плоской формы (фиг. 1), либо цилиндрической (фиг. 2), металлической мембраны 6, которая одновременно может выполнять функцию электрода, и разрядного контура, состоящего из последовательно включенных конденсатора 7, управляемого разрядника 8 и катушки 5. К электродам 2, 3 подключен генератор импульсного электрического напряжения 9. В цилиндрическом случае (фиг. 2) к электродам подключен также источник переменного напряжения 10 для осуществления диэлектрофореза. Синхронное включение с требуемой временной задержкой генератора ударно-волновых акустических импульсов и генератора импульсного электрического поля осуществляется блоком синхронизации 11.

Сущность предлагаемого технического решения заключается в следующем.

При возбуждении в среде ударно-волнового акустического импульса, временную зависимость которого можно описать, например, выражением вида
P(t) = 2P₀e^-αtcos(ωt+π/3)
или выражением вида
P(t) = P₀e^-αtsin(ωt),
где
P₀ - амплитуда давления положительной фазы ударно-волнового импульса,
α - постоянная затухания,
ω - характерная угловая частота,
биологические клетки, находящиеся в среде, подвергаются сжатию, сменяющемуся растяжением.

Если в фазе сжатия в среде создать импульсное электрическое поле достаточной амплитуды, то происходит электрический пробой цитоплазматической мембраны с образованием поры, соединяющей внутреннюю область клетки с внешней средой. Формирование поры происходит за время порядка 10 нс, а радиус поры составляет несколько нанометров. При обычных условиях восстановление непроницаемости мембраны, т.е. закрытие поры происходит за времена от нескольких микросекунд до десятков минут. Однако при действии ударно-волнового акустического импульса, в котором фаза сжатия сменяется фазой растяжения под действием отрицательного давления, образовавшаяся в положительную фазу давления пора будет в отрицательной фазе расширяться под действием растягивающих усилий, если амплитуда отрицательного давления превышает некоторую критическую величину, определяемую силами поверхностного натяжения и начальным радиусом поры. При достаточной продолжительности фазы растяжения пора расширится до размеров порядка диаметра клетки, процесс станет необратимым, т.е. восстановление целостности мембраны будет невозможным, а содержимое клетки поступит в окружающую среду.

В обычных условиях атмосферного давления трансмембранная разность потенциалов, при которой возникает электрический пробой цитоплазматической мембраны, у большинства клеток составляет величину 0,8 - 0,9 В. При действии на клетку сжимающего давления критическая трансмембранная разность потенциалов возникновения электрического пробоя мембраны снижается в соответствии с выражением

где
Y_m - модуль упругости цитоплазматической мембраны.

Для большинства биологических клеток модуль упругости цитоплазматической мембраны лежит в диапазоне от 10 до 100 атмосфер. При давлениях сжатия в ударно-волновом импульсе 100 - 1000 атмосфер критическая трансмембранная разность потенциалов будет находиться в диапазоне от 40 мкВ до 0,3 В, т.е. существенно ниже чем при атмосферном давлении.

Из решения уравнения Лапласа для распределения электрического поля в проводящей среде со сферическими клетками, окруженными диэлектрической оболочкой и заполненными также проводящей средой, следует выражение для трансмембранной разности потенциалов у клетки в среде, находящейся в однородном электрическом поле напряженностью E. Это выражение имеет следующий вид:
V_c= 1,5Ea•cosθ,
где
a - диаметр клетки,
θ - полярный угол.

Для размеров клеток в диапазоне 1 - 10 мкм критическое поле, требуемое для пробоя цитоплазматической мембраны, лежит в диапазоне 0,6 - 6 кВ/см при атмосферном давлении, в диапазоне 0,2 - 2 кВ/см при 100 атмосфер и в диапазоне 30 - 300 В/см при 300 атмосферах. Таким образом, включение электрического поля в фазе сжатия ударно-волнового импульса существенным образом снижает требуемую для пробоя цитоплазматической мембраны амплитуду напряженности электрического поля. Обычно для осуществления пробоя плазматической мембраны используют электрическое поле микросекундного диапазона длительностей. Это приводит к существенному снижению тепловой нагрузки на среду. Еще большего снижения тепловой нагрузки на среду можно достичь при переходе в наносекундный диапазон длительностей импульсного электрического поля.

В обычных условиях при амплитуде электрических полей, указанных выше, электрический пробой цитоплазматической мембраны носит обратимый характер. Через временной интервал от нескольких микросекунд до нескольких десятков минут пора закрывается, клетка восстанавливает свойства непроницаемости, и дезинтеграция клетки не происходит. В поле давления акустического ударно-волнового импульса в фазе растяжения размер поры растет, поскольку пора является концентратором механических напряжений. При достаточной амплитуде и длительности отрицательной фазы ударно-волнового импульса пора вырастает до размеров, соизмеримых с размером клетки, и процесс становится необратимым, после окончания действия ударно-волнового импульса целостность мембраны не восстанавливается, и содержимое клетки поступает в окружающую среду.

В процессе образования поры в цитоплазматической мембране в начальный момент гидрофобные концы молекул липидного бислоя мембраны оказываются обнаженными для окружающей водной среды. В месте контакта гидрофобных концов молекул с водой прочность связи понижена, поэтому в период действия отрицательного давления в этой зоне возможно образование разрыва сплошности среды и формирование паровой полости, динамическое развитие которой может привести к дополнительным разрушающим факторам, связанным с формированием локальных ударных волн и высокоскоростных микроструй.

Если электрическое поле повысить до напряженностей, при которых возникает электрический пробой в жидкости, то это может привести к распаду ряда биологических веществ и снижению или потере полезных свойств дезинтеграта. Поэтому напряженность электрического поля не должна превышать значений, при которых в жидкой среде возникает электрический пробой с образованием газоразрядной плазмы.

Таким образом, совместное действие на биологическую клетку ударно-волнового акустического импульса и импульсного электрического поля позволяет существенным образом повысить эффективность процесса дезинтеграции клеток, вплоть до полного разрушения всех клеток, увеличить выход клеток, вплоть до полного разрушения всех клеток, увеличить выход полезного продукта, обеспечить достижение положительного эффекта, который не может быть получен при использовании каждого их указанных факторов в отдельности.

Дальнейшего повышения эффективности дезинтеграции можно достичь, оптимизируя процесс одновременного воздействия на среду с биологическими клетками ударно-волнового акустического импульса и импульсного электрического поля.

При движении ударно-волнового акустического импульса в среде в каждый момент времени в сжатом состоянии находится лишь область среды с характерной толщиной порядка длины импульса в пространстве

где
c - скорость звука в среде.

Эффективность процесса будет существенно выше, если в процессе движения ударно-волнового акустического импульса к среде через интервал времени, равный длительности положительной фазы ударно-волнового импульса, в среде возбуждать импульсное электрическое поле. Такое периодическое возбуждение электрического поля в среде продолжается до тех пор, пока не затухнет или заметно не упадет амплитуда ударно-волнового импульса в среде. В этом случае процесс воздействия электрическим полем осуществляют при каждом воздействии на среду ударно-волнового импульса в виде пачки импульсов.

В зависимости от формы кюветы целесообразно использовать либо плоские волны, либо сходящиеся цилиндрические волны. В последнем случае для концентрирования клеток вблизи оси кюветы, где амплитуда давления имеет максимальное значение, можно использовать эффект диэлектрофореза в неоднородном переменном электрическом поле.

Поскольку процесс закрытия поры в мембране протекает достаточно медленно, то можно предварительно среду сжать, затем создать в ней импульсное электрическое поле, обеспечивающее пробой мембран клеток во всем объеме, а затем осуществить быструю разгрузку объема, сопровождающуюся образованием в объеме отрицательного давления. Это позволяет упростить устройства для реализации способа и повысить производительность.

Можно также повысить производительность, используя в качестве ударно-волнового импульса цуг ультразвуковых волн, заполняющий весь объем жидкости с биологическими клетками.

Устройства для реализации способа работают следующим образом (фиг. 1, 2).

Жидкая среда с биологическими клетками заполняет кювету 1. При подаче запускающего импульса от блока синхронизации 11 на разрядник 8 происходит и разряд конденсатора 7 через катушку 5 индуктора. Вихревые токи, возбуждаемые в металлической мембране 6, взаимодействуя с полем катушки 5, ускоряют мембрану 6 в жидкой среде, при этом в ней формируется ударно-волновой акустический импульс, который распространяется между электродами 2, 3. В случае цилиндрической кюветы (фиг. 2) возбуждается цилиндрическая сходящаяся волна, амплитуда которой нарастает к центру кюветы. В процессе движения волны в кювете на электроды 2, 3 подаются импульсы напряжения от высоковольтного генератора импульсов 9. В результате мембраны клеток, находящихся в данный момент под действием давления сжатия, пробиваются электрическим полем, а затем разрушаются под действием растягивающих усилий в отрицательной фазе ударно-волнового импульса. Многократное повторение воздействия приводит к тому, что все или большая часть клеток в жидкости будет разрушена. В цилиндрическом варианте для концентрирования клеток вблизи оси кюветы используется эффект диэлектрофореза в неоднородном переменном электрическом поле, создаваемом источником переменного напряжения 10. Режимы воздействия регулируются изменением амплитуды ударно-волнового импульса, амплитуды высоковольтного импульсного напряжения и блоком синхронизации запуска генератора импульсного напряжения.

Характерные осциллограммы давления в ударно-волновом импульсе при различных параметрах затухания для генератора ударных волн приведены на фиг. 3а, а для генератора цугов ультразвуковых волн - на фиг. 3б.

После обработки среда сливается из кюветы и используется в дальнейшем технологическом цикле. Возможна также циклическая прокачка среды через кювету.

Предлагаемый способ может использоваться для деструкции микробных клеток, растительных и животных клеток в различных технологических процессах, для стерилизации жидких сред и т.д.

Источники информации
1. Авт. св. СССР N 745946, кл. C 12 N 9/00, 1975.

2. Авт. св. СССР N 305184, кл. C 12 N 13/00, 1969.

3. Фихте Б.А., Гуревич Г.А. Дезинтеграторы клеток. М.: Наука, с. 111 - 112, 1988.

Способ включает воздействие ударно-волновыми акустическими импульсами на клетки. Одновременно на клетки воздействуют импульсным электрическим полем. Амплитуда напряженности электрического поля превышает значение напряженности пробоя цитоплазменной мембраны. Использование способа позволяет повысить эффективность дезинтеграции биологических клеток. 7 з.п. ф-лы, 3 ил.

1. Способ дезинтеграфии биологических клеток, заключающийся в том, что на жидкую среду с биологическими клетками воздействуют ударно-волновыми акустическими импульсами, отличающийся тем, что одновременно с прохождением в среде ударноволнового акустического импульса, состоящего по крайней мере из одной фазы сжатия и одной фазы растяжения в среде возбуждают импульсное электрическое поле, амплитуда напряженности которого превышает критическое значение напряженности поля, при котором происходит пробой цитоплазменной мембраны с образованием поры в акустическом поле давления в фазе сжатия ударно-волнового импульса, при этом абсолютное значение амплитуды давления в фазе растяжения превышает критическую величину отрицательного давления, при котором обеспечивается рост диаметра поры, а длительность фазы растяжения превышает временной интервал достижения величиной диаметра поры необратимого значения. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что длительность импульсов электрического поля устанавливается в микросекундном диапазоне. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что длительность импульсов электрического поля устанавливается в наносекундном диапазоне. 4. Способ по любому из пп.1 - 3, отличающийся тем, что импульсы электрического поля генерируются в виде пачек импульсов, в которых интервал времени между импульсами находится в диапазоне длительности фазы положительного давления ударно-волнового импульса, а длительность пачки - в диапазоне интервала времени существования в среде ударно-волнового акустического импульса. 5. Способ по любому из пп.1 - 4, отличающийся тем, что в среде возбуждается ударно-волновой импульс в виде плоской волны. 6. Способ по любому из пп.1 - 4, отличающийся тем, что ударно-волновой импульс возбуждается в виде цилиндрической сходящейся волны, при этом среда подвергается воздействию неоднородного переменного электрического поля для осуществления диэлектрофореза со сбором клеток вблизи оси схождения волны, а импульсное электрическое поле возбуждается в радиальном направлении перпендикулярно оси схождения волны. 7. Способ по любому из пп.1, 5 и 6, отличающийся тем, что ударно-волновой импульс возбуждается посредством сжатия среды квазипостоянным давлением с последующей быстрой разгрузкой. 8. Способ по любому из пп.1 - 6, отличающийся тем, что ударно-волновой импульс возбуждается в виде последовательности цугов ультразвуковых волн.