ШТАММ HOMINIS IMMUNODEFICITI VIRUS (HIV-I) ВИЧ-1 /РОССИЯ/ГМ-12-95 (RU 1295) СУБТИПА В ДЛЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ВАКЦИННЫХ ПРЕПАРАТОВ Российский патент 1998 года по МПК C12N7/00 A61K35/76 A61K39/21 G01N33/569 

Изобретение относится к области вирусологии и биотехнологии.

Создание лечебной и (или) профилактической вакцины против вируса иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ-1) является актуальной проблемой современной вирусологии. В настоящее время в ряде стран мира проводятся испытания вакцинных препаратов, созданных на основе вирусных частиц ВИЧ-1 или их отдельных компонентов (J. Infect. Dis. 1992, 166, 244-252; Science 1992, 256, 1687-1690). Они создаются на базе штаммов ВИЧ-1/IIIB (США), ВИЧ-1/RF (США), ВИЧ-1/SF2 (США), которые широко используются при научных исследованиях во всем мире. Однако в связи с общепринятыми правовыми нормами их коммерческое использование в других странах, в частности в Российской Федерации, невозможно. Кроме того, учитывая высокую региональную изменчивость ВИЧ-1, перспективным представляется использование для таких работ в нашей стране штаммов ВИЧ-1, наиболее характерных для отдельных регионов или групп риска (мужчин гомосексуальной ориентации, инфицированных в нозокомиальном очаге, наркоманов и т.д.). Наибольшее распространение в Российской Федерации приобретают вирусы, принадлежащие к субтипу B, которые обнаруживаются у 90% инфицированных мужчин и у более 50% женщин. Однако отечественные штаммы субтипа B в литературе не описаны.

В связи с этим задачей настоящего изобретения явилось получение нового оригинального штамма вируса иммунодефицита человека ВИЧ-1/Россия, ГМ-12-95 (RU1295), который циркулирует на территории России в популяции инфицированных мужчин гомосексуальной ориентации и может быть использован для приготовления диагностических и экспериментальных вакцинных препаратов.

Полученный новый оригинальный штамм обладает рядом вирусологических свойств, позволяющих рассматривать его как удобную биотехнологическую природную модель получения диагностических и вакцинных препаратов. Штамм может быть использован для испытания профилактических препаратов. Штамм обладает высокой репродуктивной активностью и легко размножается в неопластических Т-лимфоидных клетках МТ-4 и Sup T1, о продукции вируса можно легко судить по ярко выраженному цитопатическому действию, продуктивная активность штамма составляет 4,0 lg ТЦД50. Штамм хорошо хранится при - 70^oC.

Идентификация штамма ВИЧ-1/Россия/ГМ-12-95 (RU1295) осуществлена рядом независимых методов.

Культуральные свойства
Штамм вируса выделен из лимфоцитов периферической крови пациента с диагнозом ВИЧ-инфекция. При получении штамма использованы методы сокультивации лимфоцитов инфицированного пациента с лимфоцитами крови здорового донора, стимулированных митогеном, а также с человеческими перевиваемыми клеточными линиями.

Репродукция. Штамм вируса реплицируется в лимфоцитах периферической крови, лимфобластоидных клеточных культурах МТ-4 и SupT1. Репродукция вируса сопровождается характерным цитопатическим действием смешанного типа - гибелью отдельных клеток и образованием синцитиев из 5-20 клеток.

Штамм ВИЧ-1/Россия/ГМ-12-95 может поддерживаться длительное время при пассировании в МТ-4 или Sup T1 клетках. Через 7-10 дней после инфицирования клеток вируссодержащей культуральной жидкостью инфицированная клеточная взвесь замораживается и после размораживания и осветления при 1500 об/мин вносится в свежую клеточную суспензию в соотношении 1:10.

Инфекционный титр вируса определяли по 50% тканевой цитопатической дозе вируса на модели вышеуказанных клеточных культур (табл. 1).

Антигенные свойства
ВИЧ-1 относится к семейству retroviridae подгрупе lentiviridae. Вирусы этой подгруппы являются оболочечными РНК-содержащими вирусами с размером частиц около 100-150 нм. В составе частиц обнаруживают не менее 6 основных структурных антигенов, обладающих иммуногенными свойствами, которые могут быть выявлены в инфицированных клетках с помощью различных иммунологических и вирусологических методов.

Иммунофлюоресценция. Исследование методом непрямой иммунофлюоресценции с использованием сыворотки больного СПИД, содержащей антитела к ВИЧ-1, показало наличие антигенов ВИЧ-1 в 40-50% инфицированных клеток.

Иммуноблот. Исследования в иммуноблоте позволили заключить, что вирус обладает основными структурными антигенами, характерными для ВИЧ-1: 120-160, 53/55, 41, 31, 24, 17 кДа (табл. 2)
Анализ нуклеотидной последовательности генома. Цепная полимеразная реакция (PCR). Специфические фрагменты генома ВИЧ-1 образуются при постановке PCR с ВИЧ-1-специфическими праймерами 459М/460М, 461М/462М, ED3/ED14, ED5/ED12, ES7/ES8.

Анализ электрофоретической подвижности гетеродуплексов (НМА). Анализ фрагментов генома, получаемых с помощью праймеров ED5/ED12, методом HMA позволяет установить, что штамм относится к субтипу B.

Анализ аминокислотной последовательности области V3. Штамм имеет следующую аминокислотную последовательность области V3:
CTRPNNNTRKRIHIGPGRAYFTGRIIGDIRQAYC.

Иммуногенные свойства.

Трехкратная иммунизация кроликов очищенным препаратом вирусных частиц приводит к возникновению у лабораторных животных специфического иммунного ответа. С помощью иммуноблота можно выявить антитела к основным структурным белкам ВИЧ-1: gp120/gp160, gp41, p24, p17, p55 (таблица 3).

Сыворотка крови лабораторных животных способна нейтрализовать другие штаммы ВИЧ-1 субтипа B (таблица 4).

Пример 1. Диагностика антител к ВИЧ-1 методом иммуноблота.

Материал для исследования антител к ВИЧ-1 представлен 10 сыворотками, содержащими анти-ВИЧ антитела и предварительно охарактеризованными в коммерческой тест-системе фирмы "Био-рад" (Австрия). В качестве антигена использован штамм ВИЧ-1/ГМ12-95 и эталонный штамм ВИЧ-1/IIIB, концентрированные и очищенные по стандартной методике.

Результаты исследования представлены в таблице 2.

В результате проведенных исследований установлено, что антиген штамма ВИЧ-1/ГМ12-95 позволил выявить антитела ко всем основным структурным белкам ВИЧ-1 и может быть, следовательно, использован для изучения сероконверсии лиц, инфицированных ВИЧ-1.

Пример 2. Демонстрация использования штамма ВИЧ-1/Россия/ГМ-12-95 (RU1295) для получения ВИЧ-1-специфических антител, способных нейтрализовать ВИЧ-1.

Трехкратную иммунизацию кроликов очищенными препаратами вирусных частиц проводили внутримышечно или в подколенные лимфатические узлы, как описано ранее. Первую иммунизацию проводили с использованием полного адъюванта Фрейнда, последующие - без адъюванта с интервалом 6 недель. Титр антител определяли с помощью коммерческих иммуноферментных тест-систем фирмы "Organon" и в иммуноблоте. Для сравнения использовали эталонный штамм IIIB. Результаты анализа сывороток после иммунизации приведены в табл. 3.

Полученные результаты показывают, что препарат антигена, приготовленный из предлагаемого штамма ВИЧ-1/Россия/ГМ-12-95 (RU1295), обладает иммуногенной активностью, сравнимой с иммуногенной активностью эталонного штамма IIIB.

Анализ нейтрализующей активности вирус-специфических антител данного штамма свидетельствует об их способности нейтрализовать эталонные штаммы ВИЧ-1 субтипа B на клетках линии МТ-4 (таблица 4).

Биотехнологическая характеристика
Предлагаемый оригинальный штамм вируса ВИЧ-1/Россия/ГМ-12-95 (RU1295) и приготовленные на его основе препараты должны найти применение в вирусологической практике при разработке стратегии создания противовирусных вакцин и диагностике ВИЧ-инфекции. Штамм может быть применен и для испытания противовирусных препаратов.

Изобретение относится к области вирусологии и биотехнологии, к штаммам вируса иммунодефицита человека, принадлежащим к субтипу В, которые обнаруживаются у 90% инфицированных мужчин и у более 50% женщин. Новый штамм вируса иммунодефицита человека ВИЧ-1/Россия, ГМ-12-95( RU 1295) циркулирует на территории России в популяции инфицированных мужчин гомосексуальной ориентации. Штамм обладает высокой репродуктивной активностью, легко размножается в неопластических Т-лимфоидных клетках МТ-4 и SupTI и хорошо хранится при -70^oС. Идентификация штамма ВИЧ-1/Россия/ГМ-12-95 (RU 1295) осуществлена рядом независимых методов, с помощью цепной полимеразной реакции проведен анализ нуклеотидной последовательности его генома. Штамм имеет следующую аминокислотную последовательность области: CTRPNNNTRKRIHIGPGRAYFTGRIGDIRQAYC. Полученный штамм является удобной биотехнологической природной моделью и может быть использован для получения диагностических и экспериментальных вакцинных препаратов. 4 табл.

Штамм hominis immunodeficit virus ВИЧ-1/Россия ГМ-12-95 (Ru-1295) подгруппы lentiviridae семейства Retroviridae для приготовления диагностических и вакцинных препаратов, содержащий следующую аминокислотную последовательность области V3: CTRPNNNTRKRIHIGPGRAYFTGRIIGDIRQAYC.