СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ТЯЖЕСТИ ЭНДОГЕННОЙ ИНТОКСИКАЦИИ ПРИ ОСТРЫХ ГНОЙНО-СЕПТИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ У ДЕТЕЙ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к медицине, а именно к способам определения степени эндогенной интоксикации при гнойно-септических заболеваниях, и может быть использовано для оценки тяжести состояния больного, контроля за эффективностью проводимого лечения.

Аналогом изобретения является способ диагностики интоксикации по определению лейкоцитарного индекса интоксикации (ЛИИ), предложенный Я.Я.Кальф-Калифом (1938 г. ). Метод основан на учете различных клеточных группировок лейкоцитарного ряда крови и определяется по следующей формуле:

где мц - миелоциты, ю - юные, п - палочкоядерные, с - сегментоядерные, п.к. - плазматические клетки, м - моноциты, л - лимфоциты, э - эозинофилы.

В норме данный показатель составляет 0,3 - 1,5. Использование индекса возможно для динамического наблюдения за эффективностью дезинтоксикационной терапии, ранней диагностики присоединившихся воспалительных осложнений (см. книгу "Септический шок". М.И. Лыткина, Э.Д. Костина, А.Л. Костюченко, И.М. Терешина. М. Медицина. -1980 год.-С.87). ЛИИ является простым, доступным и достаточно информативным показателем тяжести эндогенной интоксикации, используемым в клинической практике. Но точность метода значительно понижается при прогрессировании эндогенной интоксикации, сопровождающейся угнетением механизмов иммунологической защиты и формированием признаков органной недостаточности.

Также аналогом изобретения является определение концентрации молекул средней массы (СМ) в сыворотке крови с целью диагностики эндогенной интоксикации, а также определения ее тяжести (см. журнал "Вестник хирургии" 1987 год, том 137,С. 126-129. Статья А.С. Владыка, Н.А. Белякова, А.И. Шугаева, А. П. Левицкого, М. Я. Малаховой: "Диагностическое значение уровня молекул средней массы в крови при оценке тяжести эндотоксемии"). Уровень СМ в плазме или сыворотке крови определяли путем осаждения белков раствором трихлоруксусной кислоты и спектрофотометрией супернатанта. Полученные значения выражали в условных единицах, равных величине экстинции. Тест довольно универсален, так как повышение концентрации СМ в крови обнаружено при всех видах патологии, сопровождаемых эндогенной интоксикацией (ОПН, ХПН, политравма, перитонит и др.). Диагностическая значимость данного теста не вызывает сомнения. Метод удобен для экспресс-диагностики. Однако он способен отражать лишь уровень токсемии у пациентов и недостаточно информативен при углублении явлений эндогенной интоксикации и формировании органной недостаточности.

Аналогом изобретения является биолюминесцентный метод определения степени эндогенной интоксикации (см. журнал "Лабораторное дело" 1990 год, N9, С. 23-25. Статья Т. В. Воеводина, О.Е. Нифантьева, А.Н. Ковалевский, В.Р. Шульц, В.А. Картрасюк: "Биолюминесцентный метод определения степени интоксикации при перитоните"). Сущность метода заключается в том, что интенсивность биолюминесценции, катализируемой люциферазой, при насыщающих концентрациях субстратов (сыворотки доноров и больных перитонитом) достоверно различна. Данный метод также позволяет оценить тяжесть состояния больного и степень интоксикации на основании люциферазного индекса, равного отношению максимальной интенсивности свечения в присутствии сыворотки больного к максимальной интенсивности свечения при добавлении сыворотки донора. В норме данный показатель составляет 1-1,32. У больных перитонитом обнаружили достоверное повышение люциферазного индекса и снижение его при своевременном оперативном вмешательстве и проведении дезинтоксикационной терапии.

Высокие цифры данного показателя без тенденции к снижению наблюдались в группе погибших больных в течение всего периода заболевания. Метод высоко чувствителен, позволяет оценить эффективность проводимой терапии, однако требует необходимости в использовании зачастую дорогостоящих приборов и материалов. Нет четких критериев оценки тяжести эндогенной интоксикации.

Прототипом изобретения является выявление белковых компонентов кислоторастворимой фракции плазмы крови (КФПК), их количественные и качественнее изменения у больных (см. журнал "Анастезиология и реаниматология" 1992 год, N 4, с. 36-38. Статься В.Н. Семенова, Ю.М. Азизова, И.М. Макаршева, С.С. Николаевских, Н.Е. Ястребовой "Белковые компоненты кислоторастворимой фракции плазмы крови человека в норме и у больных перитонитом). После предварительного осаждения белков плазмы крови трихлоруксусной кислотой и выделения супернатанта, содержащего КФПК, методом вертикального электрофореза в полиакриламидном геле был проведен анализ КПФК здоровых доноров и больных перитонитом. На денситограммах гелей после электрофоретического разделения КПФК видно, что КПФК здоровых лиц содержат в качестве основных белковые компоненты с молекулярной массы 14, 30, 43 килодальтон (кД), а также небольшое количество компонентов с молекулярной массой 15-20 кД и около 90 кД. При анализе денситограмм больных перитонитом обращает на себя внимание тот факт, что для КФПК данной группы сохраняются присущие донорам полосы, но интенсивность их увеличивается. Кроме того, появляется полоса, соответствующая белковому компоненту с молекулярной массой около 64 кД и существенно расширяется полоса, примыкающая к полосе 14 кД. Таким образом, данный метод позволяет определить у больных перитонитом как увеличение содержания основных фракций, присутствующих в КПФК доноров, так и генерацию новых белоксодержащих кислоторастворимых компонентов. Реализация этого способа требует длительного времени, специального оборудования, необходимости в предварительной обработке плазмы крови для выделения КФПК. Кроме того, затруднено определение степени выраженности эндогенной интоксикации и соответственно составление программы интенсивной терапии.

Целью изобретения является расширение функциональных возможностей и упрощение методики исследования.

Способ осуществляется следующим образом. У больного забирается венозная кровь в количестве 1 мл, затем после выдерживания в течение 3 часов при 4^oC отделяется сыворотка от сгустка. Предварительно готовится 30% раствор акриламида (58,4 г на 200 мл бидистиллированной воды ) и 1,6 г метиленбисакриламида. Далее на основе этого раствора готовят разделяющий и концентрирующий гели. При подготовке разделяющего геля 20 мл 30% раствора полиакриламида помещают в вакуумную колбу, добавляют 0,6 мл 10% водного раствора додецилсульфата натрия, 300 мкл персульфата аммония и 20 мкл тетраэтилендиамида, 15 мл буферного раствора (1,5 М Трис-HCl, pH 8,8) и доводят бидистиллированной водой объем до 60 мл. При подготовке концентрирующего геля к 2,66 мл раствора 30% полиакриламида, находящегося в вакуумной колбе, добавляют 5 мл буферного раствора (0,5 М Трис-HCl, pH 6,8), 0,2 мл 10% додецилсульфата натрия, 12,2 бидистиллированной воды, 100 мкл персульфата аммония и 10 мкл тетраэтилендиамида.

Затем заливают концентрирующий гель в гелевую камеру со спейсером толщиной в 1,5 мм, так чтобы он не полностью заполнил камеру. После этого на основной гель наслаивается разделяющий гель, куда и устанавливается гребень для формирования лунок, в которые впоследствии и будет помещена исследуемая сыворотка крови.

После полимеризации геля в гелевой камере, примерно в течение получаса, удаляем гребень и даем отстояться сформировавшемуся гелю в течение нескольких часов при 4^oC. Ополаскиваем каждую лунку дистиллированной водой. При помощи гамильтоновских шприцов заливаем в лунки геля исследуемые образцы сыворотки крови, предварительно прокипятив их в буфере, включающем 0,125 М трис-HCl, pH 6,8, 4% раствор додецилсульфата натрия, 20% глицерин, 10% меркаптоэтанол. В одну из лунок добавляется капля 0,1% водного раствора фенолового красного.

После этого в верхний и нижний резервуары аппарата для электрофореза заливаем буферный раствор для электрофореза (0,025 М Трис-HCl, pH 8,3, 0,192 М глицин, 0,1% додецил сульфат натрия) до тех пор, пока гелевая камера полностью не погрузиться в буферный раствор. Подключаем аппарат для электрофореза к источнику питания. Причем катод соединяется с буферным раствором в нижнем резервуаре. Проводим электрофорез при напряжении 70-80 вольт. В дальнейшем в зависимости от скорости движения в геле исследуемых образцов сыворотки крови напряжение можно изменить. По достижении уровня миграции фенолового красного на расстояние в 2-3 см от нижнего края геля прекращаем проведение электрофореза. Вынимаем гелевую камеру из аппарата для электрофореза, удаляем гель из гелевой камеры и помещаем в ванночку с окрашивающим раствором (0,125% куммаси синий G-250, 50% метанол, 10% уксусная кислота), осторожно помешивая на встряхивателе в течение 4-8 часов. После этого гель удаляется из окрашивающего раствора и помещается в ванночку с отмывающим раствором (50% метанол, 10% уксусная кислота) в течение нескольких часов при постоянном осторожном помешивании. Затем гель на несколько часов помещают в фиксирующий раствор (7% уксусная кислота, 5% метанол). После этого гель готов к визуализации, и возможна оценка полученных данных. Формирование признаков органной недостаточности на фоне проявлений эндогенной интоксикации характеризовалось появлением на электрофореграмме белковых компонентов с молекулярным весом менее 12 кД.

В процессе выполнения настоящей работы был проведен в динамике электрофоретический анализ сыворотки крови трех здоровых детей и 25 больных гнойно-септическими заболеваниями (аппендикулярным перитонитом, остеомиелитом, деструктивной пневмонией, сепсисом) в возрасте от 7 месяцев до 10 лет, находившихся на лечении в отделении реанимации детской клинической больницы Республики Башкортостан (РДКБ). В качестве иллюстрации приведем несколько клинических примеров.

Пример 1. Больная В. 1 год 11 месяцев (история болезни N 8433) поступила в РДКБ в крайне тяжелом состоянии на 20 стуки с момента заболевания с диагнозом: термический ожог туловища и конечностей 2 степени (15% поверхности тела), ожоговый сепсис. Двусторонняя полисегментарная пневмония, септический энтероколит, миокардит, гепатит, нефрит. Гнойный медиастенит. Остеомиелит 7 ребра справа. Ребенок в сопоре, выраженная одышка и тахикардия: число дыханий (ЧД) 60 в 1 минуту, число сердечных сокращений (ЧСС) 162 в минуту. Показатели общего анализа крови; эритроциты (Er) 3,1•10¹², гемоглобин (Hb) 108 г/л. Имеется плейоцитоз - лейкоцитов (L) 30•10⁹, палочкоядерных нейтрофилов (П) 5%, сегментоядерных нейтрофилов(C) 66%, лимфоцитов (Л) 28%, моноцитов (М) 3%. Отмечается наличие гипопротеинемии (общий белок 41,6 г/л), гипоксемии pO₂ 52 мм рт.ст. На электрофореграмме выявлена полоса, соответствующая белковым компонентам с молекулярным весом менее 12 кД, позволившая диагносцировать тяжелую эндогенную интоксикация с органной недостаточностью. Ребенку начато проведение антибактериальной терапии (цефазолин+гентамицин+метраджил), дезинтоксикационной и иммуномодулирующей терапии. Произведена хирургическая санация гнойных очагов. Больному в программу лечения включены экстракорпоральные методы детоксикации (2 сеанса плазмафереза, 3 сеанса УФО аутокрови). Клинически состояние больного постепенно улучшалось, на 11 сутки с момента поступления в стационар ребенок в сознании, менее выражена одышка и тахикардия, Er 3,7•10¹², Hb 128 г/л, L 19•10⁹, C 92%, Л 8%, СОЭ 57 мм в час. Купировалась гипоксемия pO₂ 72 мм рт. ст. По данным электрофоретического исследования полоса, соответствующая белковым компонентам с молекулярным весом менее 12 кД, исчезла. В дальнейшем по мере проведения интенсивной терапии состояние ребенка постепенно улучшалось, в состоянии средней тяжести девочка выписана из стационара.

Пример 2. Больная С. в возрасте 7 месяцев (история болезни N 8805) поступила в РДКБ в крайне тяжелом состоянии с диагнозом: разлитая флегмона дна полости рта. Сепсис, септикопиемическая форма, двусторонняя полисегментарная пневмония, септический энтероколит, токсический гепатит, нефрит, миокардит. Ребенок в сопоре, гипертермия до 39,2^oC, отмечается наличие выраженной одышки и тахикардии, ЧД 52, ЧСС 176 в минуту, гипоксемия pO₂ 62 мм рт. ст. С момента поступления в связи с декомпенсированной дыхательной недостаточностью по вентиляционному типу (сдавление дыхательных путей флегмоной) осуществлен перевод ребенка на искусственную вентиляцию легких (ИВЛ).

У больного анемия, Er 3,3•10¹², Hb 93 г/л, высокий лейкоцитоз L 19,8•10⁹, П 1%, С 65%, Л 32%, М 2%, СОЭ 30 мм в час. На электрофореграмме отмечено появление белковых компонентов с молекулярным весом менее 12 кД, свидетельствующее о наличии органной недостаточности на фоне тяжелой эндогенной интоксикации. Больному вскрыт и дренирован гнойный очаг, на фоне комплексной интенсивной терапии антибиотики (клафоран+гентамицин), инфузионная терапия в режиме, приближенном к форсированному диурезу, иммуномодулирующая и симптоматическая терапия, через трое суток в связи с улучшением состояния прекращена респираторная поддержка. По мере проводимой терапии состояние ребенка постепенно улучшалось. Через 10 суток с момента поступления отсутствует гипоксемия, pO₂ 78 мм рт.ст., купирована анемия, Er 4,7•10¹², Hb 120 г/л, L 14,3•10⁹, С 58%, Л 38%, М 3%, СОЭ 24 мм в час. При анализе электрофореграммы полос, соответствующих белковым компонентам с молекулярным весом менее 12 кД, не обнаружено. По мере проведения интенсивной терапии отмечалась положительная динамика в удовлетворительном состоянии, больной выписан из стационара.

Пример 3. Больная П. 10 лет (история болезни N 10887) поступила в РДКБ в крайне тяжелом состоянии с диагнозом: деструктивный аппендицит. Разлитой гнойный перитонит. Сепсис, септикопиемическая форма, септическая пневмония, гепатит, нефрит, миокардит. Токсико-инфекционный шок. Токсико-гипоксический отек головного мозга. Аппендэктомия произведена в условиях центральной районной больницы через сутки с момента заболевания. Через трое суток отмечено ухудшение состояния, появление болей в животе и гипертермия. В РДКБ переведена через 7 суток с момента первичной операции. При поступлении ребенок в состоянии токсико-инфекционного шока. Больная в сопоре, значительная одышка и тахикардия, ЧД 38, ЧСС 129 в минуту, гипертермия до 38,7^oC. Имеются признаки гиповолемии, среднее артериальное давление (СД) составило 40 мм рт.ст. У девочки олигоурия. Имеется анемия, Er 2,7•10¹², Hb 86 г/л, L 15,0•10⁹, СОЭ 34 мм в час. В анализе мочи: протеинурия 0,066%, L 2-4-6, Er 25-29-30 в поле зрения. Полученные клинико-лабораторные данные позволили диагностировать наличие шока и ПОН с вовлечением легких, сердца, головного мозга, печени, почек. Начато проведение ИВЛ, интенсивной антибактериальной (мандол+гентамицин+метраджил), инфузионной, иммуномолирующей терапии, поддержание гемодинамики введением кардиотоников. После предоперационной подготовки произведены релапаратомия, санация брюшной полости. В течение всего периода с момента поступления состояние ребенка оценивалась как крайне тяжелое, нестабильное. Производимые лечебные мероприятия положительного эффекта не оказали, через 6 часов после оперативного вмешательства ребенок умер. По данным электрофоретического исследования обнаружена интенсивно окрашенная полоса, соответствующая белковым компонентам с молекулярной массой менее 12 кД.

Пример 4. Больная Х в возрасте 6 лет (история болезни N 9061) поступила в Республиканскую детскую клиническую больницу в крайне тяжелом состоянии на 6 сутки от начала заболевания с диагнозом: uангренозно-перфоративный аппендицит. Разлитой гнойный перитонит. Деструктивная пневмония. Сепсис. При поступлении ребенок в сознании, очень вялый и слабый. ЧСС 156, ЧД 24 в минуту. В анализе крови: Er 3,3•10¹², Hb 100 г/л. L 6,5•10⁹, П 5%, С 53%, лимф. 42%, СОЭ 75 мм/час. Отмечены гипоксемия - pO₂ 58 мм.рт.ст., гипопротеинемия - общий белок 48,1 г/л, на электрофореграмме отмечено появление полос, соответствующих белковым продуктам с молекулярным весом менее 12 кД, на основании чего диагностирована тяжелая эндогенная интоксикация с органной недостаточностью. Произведены лапаротомия, санация брюшной полости. Начато проведение ИВЛ, антибактериальной (мандол+гентамицин), дезинтоксикационной и иммуномодулирующей терапии. Через 5 суток в связи с улучшением состояния респираторная поддержка прекращена. В анализе крови: Er 3,6•10¹², Hb 119 г/л, L 13,8•10⁹, С 79%, Л 18%, M 3%, СОЭ 55 мм/час, общий белок 64,2 г/л, pO₂ 68 ммрт.ст. При электрофоретическом исследовании отмечено, что полоса, соответствующая белковым компонентам с молекулярной массой менее 12 кД, исчезла, а интенсивность последней заметно уменьшилась. В дальнейшем по мере проведения интенсивной терапии отмечалась положительная динамика, в состоянии средней тяжести выписана из стационара.

Таким образом, полученные данные позволяют утверждать, что изучение изменений в распределении белков сыворотки крови по молекулярной массе при острой хирургической патологии способно отражать патогенез заболевания, оценивать тяжесть состояния больного и эффективность проводимой терапии. У пациентов с выраженными проявлениями эндогенной интоксикации и наличием органной недостаточности обнаруживаются белковые компоненты с молекулярным весом менее 12 кД, исчезающие по мере улучшения общего состояния. Приведенные результаты позволяют считать, что исследование сыворотки крови методом денатурирующего электрофореза может являться одним из методов диагностики тяжести эндогенной интоксикации при острых гнойно-септических заболеваниях, позволяющим определить наличие формирования органной недостаточности, оценивать эффективность проводимой терапии.

В клинической медицине метод рекомендовано использовать во многих областях хирургии, реаниматологии, педиатрии в целях оценки тяжести заболевания, определения эффективности проводимой терапии.

Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии, и может быть использовано для оценки тяжести состояния больного и контроля за эффективностью проводимого лечения. Сущность изобретения: проводят электрофорез сыворотки крови больного. Анализируют полученную электрофореграмму. При наличии на электрофореграмме белковых компонентов с мол. м. менее 12 кД диагностируют тяжелую эндогенную интоксикацию с формированием органной недостаточности. Способ прост и имеет больше функциональных возможностей по сравнению с известными способами.

Способ диагностики тяжести эндогенной интоксикации при острых гнойно-септических заболеваниях у детей путем электрофоретического исследования, отличающийся тем, что исследованию подвергается сыворотка крови и при наличии на электрофореграмме белковых компонентов с мол. м. менее 12 кд диагносцируют тяжелую эндогенную интоксикацию с формированием органной недостаточности.