Настоящее изобретение относится к области подачи материала к клеткам, а точнее, к подаче генетического материала к живой ткани.
За прошедшее десятилетие ускорение частиц - переносчиков материала, особенно генетического материала, на пути к живым клеткам или тканям проявило себя как важный инструмент биотехнологии растений и животных. Интеграция временно существующей экспрессии и линии зарождения введенной ДНК проявляется в микроорганизмах, растениях и животных.
Поскольку фундаментальные основы технологии разработаны, все больше и больше внимания уделяется разработке устройств, которые позволяют оператору выполнить ряд последовательных генных переносов посредством частиц - переносчиков, причем сделать это в быстрой последовательности. Такое устройство было бы особенно выгодно для использования при массовой иммунизации людей или домашних животных генетическими вакцинами.
Одним из ограничений существующих устройств переноса генов посредством частиц-переносчиков является форма, в которой создан образец. Во всех таких устройствах образец осаждается на поверхность небольших, плотных частиц такого материала как золото или платина. Покрытые частицы затем сами по себе наносятся либо на жесткую поверхность, например металлическую пластину, либо на несущий лист, изготовленный из хрупкого материала, например майлара. После этого покрытый лист с ускорением подается к объекту. Такой подход имеет некоторые преимущества и некоторые недостатки. Преимуществом следует считать тот факт, что плоский лист обеспечивает весьма равномерное распределение ускоренных частиц. А один из недостатков заключается в том, что каждая пластина, покрытая частица или каждый несущий лист готовится индивидуально и может быть использован только однажды, делая ускорение частиц неэффективным процессом, требующим затрат времени, особенно в том случае, когда предполагаются многие повторяющиеся переносы генов. Каждый покрытый несущий лист относительно велик и с ним необходимо обращаться с осторожностью, с тем чтобы избежать повреждений или загрязнений. Иногда также трудно отличить полезную покрытую сторону несущего листа от непокрытой стороны. Неправильное расположение несущего листа может уменьшить производительность, а также может привести к бесполезному расходованию образцов.
Распределение или распространение структуры несущих частиц для некоторых случаев применения может оказаться критичным, то есть тогда, когда желательны иные результаты, касающиеся зарождения, чем в других случаях применения, главным образом когда требуется лишь временно существующая экспрессия гена. Когда желателен редкий результат трансформации зарождения, необходимо равномерно ускорять частицы по направлению к большим поверхностям клеток или тканей. Поэтому на сегодняшний день считается желательным распределять покрытые частицы в виде монослоя на относительно большой поверхности перед их ускорением к объекту, с тем чтобы довести до максимума количество клеток, получающих частицы при точно однородных условиях, и чтобы тем самым повысить вероятность того, что одна клетка будет подвергнута трансформации зарождения. Напротив, когда происходит ускорение частиц к клеткам, с тем чтобы вызвать временно существующую генную экспрессию в соматических тканях, таких как кожа, то в этом случае в меньшей степени необходимо обеспечение точно одинакового ускорения частиц, поскольку адекватная экспрессия может иметь место даже при небольшом количестве клеток, фактически проникаемых частицами. Следовательно способы подачи частиц, которые до настоящего времени были нежелательны, теперь становятся желательными.
Для снятия этих и других ограничений желательно иметь обладающее высокой производительностью устройство для подачи генов, которое может принять большое количество образцов для их быстрой и последовательной подачи к ткани, являющейся объектом этой подачи. Что еще желательно, так это платформа для хранения и подачи образцов, которая была бы более надежной, которую было бы легче подготовить и хранить, и с которой было бы проще обращаться, чем в случае существующих платформ.
Краткое изложение существа изобретения
Настоящее изобретение сводится к инструменту для подачи генов, сконструированному таким образом, чтобы он приводился в действие источником сжатого воздуха и включал в себя корпус, сквозь который образован ускорительный канал. Доступ сжатого газа в ускорительный канал осуществляется клапаном. В корпусе располагается гильзовая камера, предназначенная для захождения в нее гильзы с несущими частицами, покрытыми биологическим материалом. Поток газа, допускаемый клапаном, будет ускоряться в ускорительном канале, подхватывая из гильзы несущие частицы. На выходном конце ускорительного канала от корпуса отходит конически расходящееся выпускное сопло, предназначенное для того, чтобы распространить в наружном направлении распределение несущих частиц, когда они покидают инструмент.
Цель настоящего изобретения заключается в создании устройства для подачи генетического материала в клетки или ткани последовательным и повторяемым способом.
Еще одна цель настоящего изобретения заключается в том, чтобы при выбросе хранящегося инертного газа, находящегося под давлением, происходило удаление частиц и того, что они переносят из устройства, причем с силой, достаточной для их проникновения в ткани или клетки.
Преимущество настоящего изобретения заключается в том, что устройство вмещает в себя большое количество образцов, а не один образец, вмещаемый существующими устройствами.
Преимущество настоящего изобретения также заключается и в том, что образцы, подаваемые устройством, могут быть приготовлены перед их использованием, причем их легко хранить и с ними легко обращаться.
Другие цели, отличительные признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из приведенного ниже описания при его прочтении со ссылками на прилагаемые чертежи.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 представлено схематическое изображение настоящего изобретения.
На фиг. 2 представлена схематическая иллюстрация влияния изменения угла выпускного сопла.
На фиг. 3 представлен боковой вид первого варианта осуществления настоящего изобретения.
На фиг. 4 представлен передний вид держателя гильзы с образцами в варианте осуществления согласно фиг. 3.
На фиг. 5 представлен боковой вид в разрезе трубчатой гильзы образцов в варианте осуществления согласно фиг. 3.
На фиг. 6 представлена физическая карта плазмиды PWRG 1602.
На фиг. 7 представлен боковой вид другого варианта осуществления настоящего изобретения.
На фиг. 8 представлен разнесенный вид варианта осуществления согласно фиг. 7.
На фиг. 9 представлен вид в поперечном сечении клапана в варианте согласно фиг. 7.
На фиг. 10 представлен вид в поперечном сечении приводного механизма варианта согласно фиг. 7.
На фиг. 11 представлен вид в плане необязательно имеющихся диффузорных экранов для их использования с вариантами осуществления согласно фиг. 3 и 7.
Изобретение
В настоящем изобретении созданы устройство и способ для быстрой и воспроизводимой последовательной подачи частиц, покрытых генетическим материалом, к живым объектам - тканям и клеткам. На фиг. 1 представлена схематическая иллюстрация для показа основного способа действия устройства для генетической трансформации посредством ускорения частиц, действующего здесь по принципу предпочтительного варианта его осуществления. Детали устройства, представленного на фиг. 1, в некоторых местах для ясности показаны несколько разнесенными. Эта иллюстрация скорее предназначена для показа основного принципа работы инструмента, чем его конструктивных деталей.
Если обратиться к фиг. 1, то согласно ей по центру инструмента расположена гильза 14 с несущими частицами. Гильза 14 с частицами представляет собой удлиненную вогнутую или трубчатую конструкцию, которая имеет вогнутый полый канал, идущий по центру. На внутренней части гильзы расположено большое количество несущих частиц 16. Несущие частицы, как будет подробно обсуждено ниже, представляют собой небольшие плотные частицы, которые предварительно покрыты биологическим материалом, то есть ДНК или РНК, предназначенным для введения в являющийся объектом организм. Частицы также могут быть покрыты и иными видами биологических материалов, например, пептидами, цитокининами, гормонами или протеином. Газовый клапан 18 расположен ближе по ходу от гильзы с несущими частицами и подсоединен посредством надлежащего патрубка 17 для текущей среды к внутренней части гильзы 14. Газовый клапан посредством соответствующей трубки, обозначенной позицией 13, подсоединен к источнику сжатого газа 12. Источник сжатого газа 12 может представлять собой обычный, промышленный резервуар со сжатым газом, предпочтительно инертным сжатым газом, например гелием. Желательно, чтобы резервуар со сжатым газом находился между источником газа 12 и клапаном 18, однако установлено, что трубка 13 может функционировать в качестве такого резервуара.
Справа от гильзы для несущих частиц находится отверстие 20, которое обеспечивает доступ текучей среды к внутренней части ускорительной камеры 22, которая, в свою очередь, оканчивается коническим выпускным соплом 24. Пациент, ткань или клетки, в отношении которых производится обработка и которые на фиг. 1 обозначены позицией 19, расположены с правой стороны иллюстрации.
Для выполнения своей обычной операции клапан 18 кратковременно приводится в действие для выделения импульса сжатого газа, удерживаемого в резервуаре, образованном трубкой 13. Между клапаном 18 и выпускным соплом 24 промежуточные детали образуют канал для ускорения частиц, через который расширяющийся газ, ранее находившийся под давлением, создает поток, проходящий со значительной скоростью. При прохождении через канал для ускорения частиц поток газа ускоряется, и когда он проходит через внутреннюю часть гильзы 14 с частицами, этот ускоряющий поток газа подхватывает несущие частицы 16 и уносит их с собой. Затем ускоряющий газовый поток проходит через камеру 22 к выпускному соплу 24. После этого частицы проходят из инструмента к тканям пациента 19, где несущие частицы застревают в клетках объекта или пациента, не убивая их.
Для надлежащего функционирования инструмента, который представлен на фиг. 1, важна геометрия выпускного сопла 24. Причина важности этого фактора схематически разъяснена на фиг. 2, на которой в виде вариантов А, В и С представлены три различных возможных геометрии выходного сопла 24, а также их влияние на полет частиц 16. В варианте А выпускное сопло 24 фактически не расширяется по направлению к выходному концу устройства. В результате этого выходящий поток газа линейно проходит от конца выходного сопла 24 и идет по пути, непосредственно направленному к объекту 19. В результате этого несущие частицы продолжают движение по относительно линейному пути, при этом все они ударяют по относительно узкой поверхности пациента 19, обозначенной на фиг. 2 позицией 25. Хотя частицы 16 несколько расходятся, их расхождение весьма мало и несущественно.
Что касается варианта В согласно фиг. 2, то выпускное сопло 24 имеет чрезвычайно широкий угол конического расширения по направлению к выходному концу устройства. Кроме того, в этом варианте осуществления конструкции поток газа выходит из инструмента фактически линейно, при этом не происходит широкого расхождения несущих частиц 16. Вновь частицы ударяют по весьма компактному участку 25 пациента 19.
Иное явление происходит в том случае, если, как показано в варианте С согласно фиг 2, угол расхождения у имеющего коническую форму выпускного сопла меньше критичного угла. В этом случае, когда ускоренный поток газа проходит в выпускное сопло, он посредством вихревого движения создает вакуум между направлением прохождения потока газа и боковыми сторонами выпускного сопла 24. Этот вакуум заставляет поток газа вытягиваться наружу во всех направлениях, перпендикулярных направлению перемещения газового потока. Иными словами, расхождение газовых потоков и частиц происходит поперечно направлению перемещения частиц, которое осуществляется от инструмента к пациенту 19. Таким образом, как показано в варианте С согласно фиг. 2, поток газа выходящий из инструмента, расходится в поперечном направлении по более широкой поверхности, тем самым приводя к расхождению несущих частиц 16 по более широкой поверхности и создавая гораздо более расходящуюся структуру несущих частиц, которая представлена в варианте С согласно фиг. 2. В результате этого частицы распределяются по более широкой поверхности 25 предназначенного организма, чем это было бы в том случае, если бы коническое выпускное сопло не имело такой формы. Следовательно, представляется возможным избежать передозировки какой-либо небольшой поверхности пациента несущими частицами, при этом достигается относительно широкое и равномерное распределение несущих частиц без необходимости механического распределения частиц, либо наличия сложной аппаратуры для отклонения и распределения газа.
Точный угол расхождения конического выпускного сопла будет изменяться от варианта к варианту в зависимости от используемого давления газа и размера ускорительной камеры 22. Для инструмента, действующего на удалении от промышленного резервуара с гелием, когда диаметр ускорительной камеры 22 составляет 1/16 дюйма (1,587 мм), выходное сопло, которое расходится от 1/16 дюйма (1,587 мм) до 2/3 дюйма (16,93 мм) на коротком расстоянии порядка 3,3 дюйма (83,82 мм), как установлено, удовлетворительно расширяет структуру распространения частиц от диаметра в 1/16 дюйма (1,587 мм) примерно до диаметра 2/3 дюйма (16,93 мм), увеличивая при этом более чем в 100 раз площадь, по которой распространяются частицы, а в результате этого более чем в 100 раз уменьшая плотность распределения частиц. Для эффективной работы коническое выпускное сопло должно быть значительно больше по длине [(например, 3,3 дюйма (83,82 мм)], чем его начальный или конечный диаметры [(например, от 1/16 до 2/3 дюйма (от 1,587 мм до 16,93 мм)]. Коническое расхождение, которое шире длины, не приведет к надлежащему рассеиванию частиц. Однако нет необходимости в том, чтобы коническое выходное сопло имело плавную коническую форму. Например, выходное сопло может иметь несколько ступенчатых увеличений диаметра, а не непрерывное его увеличение, причем без неблагоприятного воздействия на его общее функционирование.
Посредством изменения давления газа усилие, с которым частицы ударяют по объекту 19 и проникают в него, может изменяться. Давление газа должно быть достаточно высоким, чтобы выбивать покрытые частицы 16 из гильзы 14, но не настолько высоким, чтобы разрушить объект 19. Как установлено, при подаче к неповрежденной коже животного газовый поток не наносит вред коже. При некоторых более высоких значениях давления газа происходит незначительное покраснение кожи, причем на вполне допустимом уровне. Установлено, что давление газа в промышленных резервуарах со сжатым гелием вполне удовлетворительно для отделения частиц 16 и подачи этих частиц 16 в эпидермальные клетки предназначенного животного, например, свиньи или мыши. Более высокое давление или более низкое давление могут быть применены в определенных ситуациях в зависимости от плотности частиц, характера поверхности объекта и желаемой глубины проникновения частиц. Опыт в отношении кожи свиньи подобен тому, что можно ожидать от кожи человека вследствие механического сходства кожи человека и свиной кожи.
Гильза 14 для частиц предпочтительно выполняется согнутой, а более предпочтительно трубчатой, с частицами, располагающимися на ее внутренней стороне, поэтому с такой гильзой можно свободно обращаться без касания несущих частиц. Хотя возможны многие формы и геометрические контуры гильзы 14 для частиц, простой и функциональный вариант основан на использовании короткого отрезка трубки из инертного материала, например TEFZEL®. Трубка образует цилиндр с проходящим по ее центру цилиндрическим каналом. Преимущество этой трубчатой формы заключается в том, что несущие частицы, покрытые биологическим материалом, не могут загрязнять стенки устройства. Преимущество материала TEFZEL® заключается в том, что он прозрачен, так что можно визуально опознавать загружаемые гильзы. Опознание осуществляется по внешнему виду гильзы, которая будет видна по золотистому оттенку, или имеет видимую золотистую полоску. Внутренний диаметр гильзы должен быть достаточно большим лишь до такой степени, чтобы он мог обеспечить осаждение частиц в ней, а также обеспечить прохождение через нее адекватного потока газа под достаточно высоким давлением, с тем чтобы выбивать частицы. Однако гильза 14 не обязательно должна быть трубчатой, она может иметь любую вогнутую форму, в которой находящийся под давлением газ ограничивается, так что выбиваемые частицы 16 скорее не рассеиваются, а направляются к объекту посредством потока газа. Гильза 14 может представлять собой, например, половину трубы, в которой частицы 16 осаждаются и плотно покрываются плоской или неплоской поверхностью устройства для формирования полуцилиндрического пути, по которому может проходить газ. В этом отношении геометрия гильзы с образцами и окружающей камеры, образованной поверхностью устройства, не является решающей из-за совместного прохождения двух прямых потоков газа от резервуара 12 к объекту 19.
Весьма малые несущие частицы 16, изготовленные из какого-либо биологически инертного материала, обладающего высокой плотностью, должны быть приемлемы для использования в качестве несущих частиц, осаждаемых на поверхности гильзы 14 с образцами. Несущие частицы 16 изготовлены из плотного материала, за счет чего они легко смогут сохранять количество движения и имеют достаточно небольшой размер, так что они невелики по отношению к клеткам организма, для трансформации которых они предназначены. Установлено, что несущие частицы с размером в несколько микрон могут войти в живые клетки посредством проникновения стенок клеток без чрезмерного неблагоприятного воздействия на способность большинства живых клеток к выживанию. Иными словами, несущие частицы могут входить в живые клетки, не убивая их, с тем чтобы таким образом доставить биологический материал на частицах к клетке.
Золото представляет собой оптимальный материал для частиц 16 в объеме настоящего изобретения, поскольку оно имеет высокую плотность, относительно инертно как к биологическим материалам, так и к окислению, и легко доступно коммерчески в форме сфер диаметром от 0,2 до 3 микрон. Успешно используются золотые сферические частицы или шарики с размерами в диапазоне 1-3 микрона, так же как и золото, продаваемое в виде микрокристаллического порошка с размерами в диапазоне от 0,2 до 3 микрон.
Также может быть использован и вольфрам, плотность которого составляет 19. Предпочтительным может быть также и иридий, плотность которого равна 22, однако иридий заявителями не используется, поскольку он легко доступен в виде относительно крупного порошка. По сравнению с золотом вольфрам, вероятно, менее желателен, поскольку он имеет тенденцию к окислению на воздухе при наличии даже незначительного количества влаги. Такой окислительный слой на несущих частицах стремится связать частицы друг с другом, вызывая некоторое увеличение среднего размера частиц, поскольку частицы группируются друг с другом. Частицы, которые группируются в скопления неправильной формы, менее желательны для использования в качестве частиц согласно настоящему изобретению, поскольку такие скопления будут широко меняться по массе и размеру, тем самым приводя к затруднениям в получении регулярно воспроизводимых результатов.
На фиг. 3 представлен боковой вид варианта осуществления конструкции устройства 10 для ускорения частиц, сконструированного согласно настоящему изобретению. Устройство представлено портативным и предназначенным для работы с ним вручную, так что экспериментатор, технический специалист или клиницист может легко и быстро обращаться с ним и перемещать его.
Если обратиться к деталям устройства согласно фиг. 3, то это устройство включает в себя рукоятку 28, которая предпочтительно удлинена и может иметь любые форму и размер, удовлетворяющие удобство конкретного пользователя устройства. Как показано на фиг. 3, рукоятка 28 выполнена в форме пистолетной рукоятки, с тем чтобы обеспечить оператору возможность ее жесткого захвата и легкого доступа к механизму 30 пуска в действие клапана.
Через рукоятку 28 проходит впускная трубка 32, открытая с обоих концов и образованная из твердого материала, которая может содержать газ под давлением, используемый в устройстве. Поэтому предпочтительно, чтобы впускная трубка 32 и все другие детали устройства (за исключением гильзы для образцов), которые контактируют с потоком газа под давлением, были бы изготовлены из недеформируемого твердого материала, например металла, предпочтительно латуни, либо из обладающих высокой плотностью термопластика или смолы. Впускная трубка 32 действует в качестве описанного выше резервуара, создающего расходуемый запас достаточного количества газа под рабочим давлением для выполнения одной подачи частиц с их ускорением. Размеры впускной трубки 32 не играют решающей роли и могут быть увеличены или уменьшены для нахождения в ней достаточного количества газа под давлением. Может быть создан отдельный резервуар, если объем внутри впускной трубки 32 недостаточен.
На одном конце впускной трубки 32 имеется соединитель 31, который может быть подсоединен к внешнему источнику 12 газа. Источник газа может представлять собой промышленный резервуар с биологически и химически инертным сжатым газом. Инертным газом предпочтительно является гелий. Давление, под которым газ покидает газовый источник, преимущественно регулируется обычным клапаном регулирования давления и указывается на манометре, который виден оператору. К противоположному концу впускной трубки 32 подсоединен клапан 34, который управляет потоком газа из впускной трубки 32 к удлиненному корпусу 33 устройства 10. В первом варианте осуществления конструкции, приведенном на фиг. 3, клапан 34 представляет собой приводимый в действие электрически соленоидный поршневой клапан, действующий посредством пускового механизма 30 на рукоятке 28. Предпочтительно, чтобы провода между клапаном 34 и пусковым механизмом 30 были запрятаны в рукоятке 28, с тем чтобы повысить безопасность устройства и улучшить управляемость им при его использовании. Изобретение не ограничено конкретным типом показанного клапана, либо каким-то определенным приводным устройством или пусковым механизмом. Известны многие сочетания клапана и пускового механизма, которыми квалифицированный специалист может заменить сочетание, показанное здесь на примере описанного ниже второго варианта осуществления конструкции. Приемлемы многие сочетания клапана и приводного устройства, в которых поршень и корпус клапана могут противостоять давлению потока газа, поступающего из впускной трубки 32.
Отверстие клапана 34 для выхода текущей среды, посредством среды сообщается с держателем 36 гильзы. В предпочтительном варианте осуществления конструкции, который облегчает быструю перезагрузку образцов, создан многогильзовый держатель 36. Для доведения до максимума количества образцов, которые могут быть предварительно загружены за одну стадию перед работой устройства, многогильзовый держатель выполнен цилиндрическим. Вид цилиндрического держателя 36 гильз спереди показан на фиг. 4. Большое количество камер 38 для гильз, каждая из которых выполнена с размерами, обеспечивающими возможность захождения отдельной гильзы 14, располагается по кругу с фиксированным расстоянием по радиусу цилиндрического держателя, так что одна гильзовая камера 38 может располагаться в потоке газа в течение каждой подачи. Держатель 36 поворачивается на 360o вокруг своей радиальной оси. Большое количество стопоров 40 на периферии держателя 36 гильзы входит в зацепление с утолщением для установления каждого положения, в котором камера 38 находится на пути газа. Утолщение может быть создано посредством образования смещаемого пружиной выступа 42 на корпусе 33, предназначенного для зацепления с утолщением на держателе гильзы. Держатель 36 может принимать другие формы, удерживая большее или меньшее количество образцов в зависимости от требований пользователя. Гильзовый держатель 36 необязательно должен иметь цилиндрическую форму как показано и может обеспечивать линейное расположение гильз с образцами, которые могут перемещаться в надлежащее положение для захождения в них газового потока, который проходит через клапан 34.
Полая камера 44 для ускорения частиц, находящаяся в корпусе 33, обеспечивает путь газовому потоку, несущему частицы, к объекту. Камера 44 сконструирована таким образом, что ее диаметр составляет 1/16 дюйма (1,59 мм), а ее длина составляет от 12 до 15 мм. Если камера 44 имеет значительную длину, то ввиду трения происходит замедление потока газа. Как показано на разрезе согласно фиг. 3, диаметр полой камеры 44 у ее дальнего конца увеличивается для формирования выпускного сопла 46, которое обеспечивает адекватное рассеивание покрытых частиц, захваченных потоком газа. К дальнему концу камеры 44 для ускорения частиц за выпускным соплом 46 прикреплена промежуточная деталь 48, которая позволяет оператору устанавливать фиксированное расстояние между устройством 10 и объектом. Надлежащее расстояние может быть определено и при необходимости зафиксировано на основе эмпирических наблюдений за внешним видом клеток, являющихся объектом, а также за степенью экспрессии гена после подачи. Для кожи млекопитающих установлено, что хорошо работает промежуточная деталь с размером от 3/4 до 1 дюйма (19,05-25,4 мм). Установлено, что полировка внутренней части камеры 44 оказывает выгодное влияние на работу устройства 10. Она может быть выполнена посредством покрытия струны или устройства для чистки трубок полирующим составом и его использования для полировки внутренней части камеры 44. Этим уменьшается сопротивление и взаимодействие с боковыми стенками камеры 44, а следовательно, облегчается течение несущих частиц по направлению к предполагаемому объекту. Подобным же образом может быть отполировано выпускное сопло 46. Установлено, что выгодно ограничивать площадь, через которую газ течет после клапана 34 перед достижением начала камеры 44, посредством заполнения пространства соответствующей промежуточной деталью, что более подробно показано ниже применительно к варианту осуществления конструкции согласно фиг. 7.
Большое количество используемых гильз 14 с образцами, показанных на фиг. 5 и несущих покрытые частицы 16, может быть подготовлено посредством одной операции, следуя определенному количеству различных способов. Успешно используются два разных способа.
В случае первого способа взвесь частиц, покрытых биологическими материалами, подготовленная известным в этой отрасли способом, вводится в отрезок пластиковой трубки и обеспечивается возможность осаждения частиц под действием силы тяжести на донную часть внутренней поверхности трубки. Когда частицы осаждены, образуя узкую полоску частиц по всей длине трубки, жидкость дренирует из трубки, при этом трубка вращается для распространения шариков по внутренней поверхности, когда они осушаются под действием азота. Затем трубка режется на отрезки, соответствующие вставке в камеры с образцами в подающем устройстве. Квалифицированному специалисту будет понятно, что количество покрытых частиц, допустимых для переноса, может быть изменено посредством регулировки концентрации конкретной взвеси, либо посредством корректировки длины трубки, используемой для формирования гильзы. Специалисту также будет понятно, что гильзы с образцами, применимые в настоящем изобретении, могут быть подготовлены способами, отличающимися от того, который только что описан. Квалифицированные специалисты хорошо знакомы с другими способами крепления образца - покрытых частиц к поверхности с возможностью их отделения.
При втором способе используется незначительное адгезионное действие для крепления несущих частиц 16 в конкретной гильзе 14. Установлено, что такая незначительная адгезия способствует гарантии того, что частицы хорошо ускоряются при их временном прилипании к внутренней вогнутой поверхности гильзы до тех пор, пока поток газа не достигнет полного давления. Для осуществления такой адгезии используется присадка, когда, частицы взвешены в спирте. Добавками, которые прилипают лишь незначительно и которые успешно используются, являются поливинилпирролидон, холестерин, глицерин и вода. Холестерин, например, используется в пропорции 1 мг на миллилитр спирта во взвеси. Суспензия из частиц/спирта подвергается воздействию звука для содействия образованию взвеси, а после этого суспензию просто помещают внутри гильзы 14, при этом она располагается на одной ее стороне. Несущие частицы быстро выпадают из суспензии вдоль одной стороны внутренней поверхности гильзы. Затем спирт может быть удален и внутренняя часть гильзы осушается потоком азота при вращении трубки.
На фиг. 7 и 8 представлен другой вариант осуществления устройства для ускорения частиц, сконструированного согласно настоящему изобретению. В устройстве 110 согласно фиг. 7 и 8 элементы, которые подобны или соответствуют по выполняемой функции элементам варианта конструкции согласно фиг. 3, имеют те же самые номера позиций, но увеличенные на 100. Например, рукоятка 128 и пусковое устройство 130 варианта осуществления конструкции согласно фиг. 7 выглядят подобно рукоятке 28 и пусковому устройству 30 варианта согласно фиг. 3. В устройстве 110 согласно фиг. 7 клапан 134 для выпуска газового импульса работает посредством системы приведения в движение текучей среды, примененной на основе соленоида, используемого в описанном выше варианте осуществления изобретения. Клапан 134 подсоединен к пусковому устройству 130 посредством патрубка 160 для текучей среды.
На разнесенном виде согласно фиг. 8 видны дополнительные внутренние компоненты устройства согласно фиг. 7. Клапанный элемент 151 ввинчивается в конец корпуса клапана 134. Клапанный элемент включает в себя имеющую резьбовую нарезку соединительную деталь 152, от которой отходит нагружаемый пружиной смещающийся валик 154, на конце которого установлен клапанный элемент 156. Капиллярная трубка 158 или трубка для просачивания гелия, которая имеет отверстие порядка 50 микрон, проходит через клапан 134 для обеспечения непрерывного незначительного просачивания гелия через устройство 110, Трубка 160 соединяет левую сторону клапана 134 с приводным блоком 162. Пусковое устройство/плунжер 164 заходит внутрь приводного блока 162. Промежуточная деталь 166 и соединительная деталь 168 служат для соединения клапана 134 с цилиндрическим корпусом 133. Сквозь промежуточную деталь проходит внутренний канал порядка 1/4 дюйма (6,35 мм) для ограничения объема, в который газ течет после клапана 134. В том месте, в котором канал для газа входит в корпус 133, образовано место входа с размером порядка 0,11 дюйма (2,79), так что расширяющийся газ, когда он проходит через держатель 136 гильзы, будет ускоряться. В ином отношении корпус 133 и держатель 136 гильзы подобны корпусу и держателю варианта согласно фиг. 3, за исключением того, что держатель 136 гильзы расположен на верхней стороне корпуса 133, а не на нижней стороне.
Детали клапана 134 показаны на фиг. 9. Трубка 132 для входа газа, подобная впускной трубке 32 первого варианта осуществления конструкции, подсоединена к основанию клапана и обеспечивает подвод газа под давлением. Клапанный элемент 156 находится в состоянии покоя, когда клапан 134 находится в своем нормально закрытом состоянии, опираясь о конически сужающееся седло, обозначенное позицией 170. Сверление внутренней части клапана 134 представляет собой цилиндр 172, который находится вблизи от клапанного элемента 156, но не имеет тесного контакта с ним посредством текучей среды. Как видно на фиг. 9, камера слева от клапанного элемента 156 находится там, где трубка 160 соединяется с клапаном 134.
На фиг. 10 показаны дополнительные детали приводного устройства 162. В приводном блоке 162 по горизонтали проходит канал 174, который выходит только к передней части приводного блока 162. Образованы три вертикальных рассверленных канала 176, 178 и 180, которые проходят вниз от верхней части приводного блока и посредством текучей среды сообщаются с каналом 174. Верхней части рассверленного канала 176 приданы такие размеры, чтобы в него заходит другой конец трубки 160, в то время как каналы 178 и 180 невелики и просто выходят в окружающую атмосферу. Ограничительный палец 182 проходит в закрытый конец канала 174 для ограничения движения плунжера 164 пускового механизма, при этом ограничительный палец включает в себя пружину для смещения плунжера, с тем чтобы оставить его в положении, показанном на фиг. 10. Плунжер 164 представляет собой удлиненный валик с двумя О-образными кольцами, расположенными на нем для его уплотнения относительно внутренней части канала 174. Удлинение 186 соединяет имеющуюся кнопку пускового механизма на конце плунжера 164 с удлиненным валиком внутри канала 174.
При работе устройства 110 ввод 131 соединяется с источником подачи газа под давлением, предпочтительно гелия. Капиллярная трубка 158 обеспечивает незначительные утечки или просачивание гелия через клапан 134 во внутреннюю часть корпуса 133, чтобы подвести гелий к выпускному соплу 146. Это осуществляется таким образом, что гелий является господствующим газом в выпускном сопле 146, а также между выпускным соплом и объектом даже перед приведением устройства в действие. В этой зоне гелий обеспечивает пониженное сопротивление потоку несущих частиц и более последовательную работу устройства 110.
Клапанный элемент 156 в нормальном состоянии сидит на седле 170, как показано на фиг. 9. Вся внутренняя часть клапана 134 посредством трубки 160 соединена с вертикальным рассверленным каналом 176 в приводном блоке 162. Когда плунжер 164 находится в положении, показанном на фиг. 10, нижний конец канала 176 уплотняется О-образными кольцами 184 и на этом пути потерь газа не будет. Когда происходит нажатие пускового механизма/плунжера 164 пользователем противоположно силе пружины, действующей на ограничительный палец 182, О-образные кольца смещаются влево от основания канала 176. Этим обеспечивается возможность выпуска газа из канала 176 в атмосферу через канал 180. Такой выпуск приводит к понижению давления слева от клапанного элемента 156. Стенки камеры 172 предотвращают неограниченный поток текучей среды к левой стороне клапана 134, а следовательно давление с правой стороны от клапанного элемента 156 больше, чем с левой стороны. Пружина 154 выбирается таким образом, чтобы эта разность давления была достаточной для того, чтобы вызвать принудительное движение клапанного элемента 156 влево, как видно на фиг. 9, при этом клапанный элемент 156 отделяется от седла 170, открывая путь потоку газа под высоким давлением через гильзу в корпус 133. Это состояние сохраняется до тех пор, пока не освобождается пусковой механизм, после чего пусковой механизм/плунжер 164 возвращается в свое положение, показанное на фиг. 10, уплотняя донную часть рассверленного канала 176. Этим обеспечивается возврат высокого давления к левой стороне клапана 134, а клапанный элемент 156 возвращается для посадки на седло 170, с тем чтобы закрыть поток газа через клапан 134.
За клапаном 134 устройство сохраняет относительно постоянную площадь для потока газа до ограничения перед входом в гильзу с носителем. Промежуточная деталь 166 предназначена для заполнения пространства слева между соединительной деталью 168 и седлом 170 клапана, за исключением центрального рассверленного канала через промежуточную деталь 166, диаметр которого приблизительно равен диаметру рассверленного канала через корпус 133. Концепция заключается в ограничении зоны расширения газа каналом в 1/4 дюйма (6,35 мм), пока он не достигнет впускного отверстия в 0,11 дюйма (2,79 мм) для держателя гильзы.
Можно было бы и не говорить о том, поскольку это достаточно очевидно, что диффузор, расположенный на выходном конце устройства 110 у правого конца, если смотреть на фиг. 7, будет способствовать эффективности подачи гена. Два таких диффузора, показанные на фиг. 11, обозначены позициями 190 и 191. Каждый диффузор включает в себя кольцо и расположенный по центру экран, соответственно 192 и 193, подвешенный в надлежащем месте посредством проволоки 194 и 195. Диффузор действует таким образом, чтобы избирательно удалять часть шариков из центра структуры для получения более равномерного распределения несущих частиц на поверхности объекта.
Описанное здесь устройство преимущественно используется для массовой вакцинации людей или домашних животных с использованием генетической вакцины. Генетические вакцины образованы из генетического материала, обычно ДНК, то-есть получаются из патогенного агента, который затем подается в живые клетки организма посредством использования устройства, подобного показанному здесь устройству. Как только генетический материал попадает в клетку, происходит его экспрессия посредством клеточного транскрипционного и трансляционного механизма для создания протеина или пептида, который зазывает иммунную реакцию организма, а такая иммунная реакция обеспечивает сопротивление животного или человека последующему заражению агентом, из которого происходит генетический материал. Это устройство также может быть использовано для генной терапии, при этом подаются гены, которые недостают организму и в которых он нуждается. Как вариант, представляется возможным стабильно интегрировать такой генетический материал внутри генетического материала генетически неполноценного организма, и при этом выполнении этого скорректировать генетический дефицит, по меньшей мере в определенных соматических клетках.
Хотя описанное устройство было сконструировано для его полномасштабного применения с целью повторяемой подачи генетических вакцин, оно также может быть использовано таким же образом, как используются существующие устройства, для ускорения частиц способами одинарной подачи, включающими, но без наложения ограничений, перенос генетического материала в органы, ткани и окультуренные клетки растений и животных. Устройство успешно используется для подачи генов в меристемы живых растений для получения трансгенетических растений. Все преимущества этого устройства, в частности его портативность и возможность легкого обращения с образцами, в равной степени хорошо используются, когда устройство применяется для одноразовой подачи гена посредством ускорения частиц. Однако принцип изобретения также может быть применен к стационарной, непортативной установке, с тем чтобы достичь существенных преимуществ в отношении скорости, воспроизводимости и легкости использования.
Пример
1. Плазмида
В плазмиде PWRG 1602, представленной на плазмидной карте согласно фиг. 5, промотор непосредственного раннего HCMV (вируса огуречной мозаики) направляют экспрессию гена гормона роста человека. Последовательность покрытия гормона роста человека содержится во фрагменте XbaI-EcoRI приблизительно в 2,2 тысячи пар оснований, который сам по себе был получен из плазмидного PGH (который можно получить из Nichols Institute). Промотор непосредственного раннего hCMV (вируса огуречной мозаики), описанный в журнале N 5 ЕМВО (Европейская организация по молекулярной биологии) 1367-1371 (1986), содержится в Асс П фрагменте с 619 комплементарными парами оснований, который заключает в себе зону от 522 пар оснований ближе по ходу до 96 пар оснований далее по ходу от места начала транскрипции непосредственного раннего CMV (вируса огуречной мозаики). Плазмидная ДНК была подготовлена посредством использования стандартной молекулярной биотехнологии.
2. Приготовление частиц, покрытых ДНК
Затем копии плазмиды PWRG 1602 были нанесены на золотые несущие частицы. Это было выполнено посредством перемешивания 26 мг осажденного золотого порошка (со средним диаметром 0,95 микрона) с 200 мл 0,1 г-моля спермидина в 25 мг ДНК. Отношение ДНК к золоту составляло 2,5 мг ДНК на мг золота. Затем к смеси было добавлено 200 мл 2,5 г-моля раствора хлористого кальция при непрерывном перемешивании, после чего образец был инкубирован в течение 10 минут при комнатной температуре для обеспечения осаждения ДНК на несущие частицы. Смесь была подвержена центрифугированию в течение 3 секунд в микроцентрифуге для концентрации частиц с ДНК на них, после чего несущие частицы были осторожно промыты этанолом и повторно взвешены в 3 мл этанола в пузырьке с колпачком. Повторное взвешивание несущих частиц в этаноле было дополнено погружением пузырька на несколько секунд в водяную ванну с воздействием ультразвуком.
3. Подача покрытых частиц в ткань животного
Находившиеся под наркозом мыши были плотно захвачены, с тем чтобы удалить с места, на которое должна осуществляться подача, большую часть меха. Трансформации были выполнены на этом оголенном месте животного.
Подготовленные таким образом гильзы с образцами были загружены в устройство согласно настоящему изобретению для проведения лабораторных испытаний. При проведении первого испытания сжатый газ подавался под разными давлениями, с тем чтобы определить влияние давления газа на подачу гена. Для анализа эффективности методики через двадцать четыре часа после обработки кожа на месте подачи была удалена и гомогенизирована. Уровень гормона роста человека в каждом образце количественно оценивался посредством промышленного ферментного иммуносорбентного анализа гормона роста человека. В таблице представлено приблизительное количество гормона роста человека, образованное трансформированными клетками в эпидермисе мыши на месте подачи.
В эксперименте, предназначенном для измерения протеиновой экспрессии гормона роста человека, другая гильза с образцами из PWRG 1602, приготовленная так, как описано, была загружена в устройство и частицы с нанесенным на них покрытием были поданы в организм в хирургически обнаженную печень мыши под давлением 500 пси (35,15 кГс/см2). Когда печень и сыворотка крови были исследованы через 24 часа после подачи, в печени и сыворотке крови были выявлены низкие уровни гормона роста человека, соответственно в три и два раза выше исходных уровней.
Была подготовлена группа гильз с образцами, в целом содержащих приблизительно 0,5 миллиграмма золота и ДНК на гильзу. Эти гильзы были загружены в устройство и частицы были поданы под разными давлениями в эпидермис находившейся под наркозом свиньи. Перед подачей частиц никакой предварительной обработки не проводилось. Через 24 часа после обработки обработанные участки кожи были удалены и проанализированы в отношении гормона роста человека посредством ферментного иммуносорбентного анализа. При давлении 650 пси (46,7 кГс/см2) в некоторых местах подачи проявилась эритема. В одном месте, в котором эритема проявилась в наименьшей степени, было обнаружено 937 нг гормона роста человека. При давлении 800 пси (56,25 кГс/см2) эритема проявилась в наибольшем количестве мест; в месте с наименьшим проявлением эритемы было обнаружено 412 нг гормона роста человека. При давлении 1100 пси (77,3 кГс/см2) в любом месте подачи гормон роста человека обнаружен не был и при этом давлении на всех местах подачи была выявлена значительная эритема.
Изобретение относится к подаче материала в клетки организма, а именно к подаче генетического материала к живой ткани. Инструмент содержит корпус с каналом для прохождения частиц с коническим выходным соплом. К обратной стороне канала подведено средство для впуска сжатого газа. Канал выполнен с возможностью совмещения с гильзовой камерой. Гильза содержит частицы с нанесенным генетическим материалом. Инструмент располагают вблизи живой ткани и потоком сжатого газа переносят частицы в ткань. Использование изобретения позволяет равномерно вносить генетический материал в клетки. 4 с. и 17 з.п. ф-лы. 11 ил., 1 табл.
| Экономайзер | 0 |
|
SU94A1 |
| US 5179022 A, 12.01.93 | |||
| US 4637816 A, 20.01.87 | |||
| US 3518990 A, 11.11.70. | |||
