СПОСОБ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ БАКТЕРИОТЕРАПИИ ДИСБАКТЕРИОЗА КИШЕЧНИКА Российский патент 2000 года по МПК G01N33/52 G01N33/84 

Изобретение относится к области медицины, а именно к гастроэнтерологии и клинической микробиологии. Оно может быть использовано для оценки эффективности воздействия бактерийных лечебных препаратов на состав и функции кишечной микрофлоры.

Известен способ оценки эффективности эубиотиков по динамике состава кишечной микрофлоры. Состав последней определяют по стандартной методике бактериологического исследования кала на дисбактериоз [1]. Оценивают сдвиги в количестве облигатной (В. bifidum, Lactobacillus, Е. coli, Bacteroides) и условно-патогенной микрофлоры (видоизмененные штаммы Е. coli, Enterococcus, Clostridium, Staphilococcus aureus, энтеробактерии и др.). Критериями положительного эффекта эубиотиков являются увеличение до нормального уровня облигатных микробов, снижение обсемененности условно-патогенной флорой, подавление роста патогенных микробов, высевание штаммов Е. coli М17 (при лечении колибактерином).

К недостаткам данного способа относятся
многоэтапность и, следовательно, большая длительность проведения исследования (до 5-7 сут);
использование дорогостоящих питательных сред.

Также известен другой способ оценки эффективности бактериотерапии дисбактериозов. Он основан на снижении концентрации кишечных иммуноглобулинов SIgA и IgM под воздействием бактерийных препаратов. Уменьшение уровня указанных иммуноглобулинов объяснялось купированием местной воспалительной реакции в слизистой кишки [2]. Иммуноглобулины в копрофильтратах определялись методом радиальной иммунодиффузии в геле [3]. Эффект эубиотиков считают положительным при снижении концентрации SIgA и IgM в кале в 2-5 раз. Недостатком способа является использование дорогостоящих моноспецифических антисывороток и агар-агара, что делает затруднительным широкое применение данного способа.

Наиболее близким и принятым нами за прототип является способ оценки эффективности бактериотерапии у детей грудного возраста. Он основан на повышении активности кишечных ферментов энтерокиназы и щелочной фосфатазы на фоне приема бифидосодержащих эубиотиков [4]. Активность энтерокиназы определяют по степени расщепления казеина реакционной смеси под воздействием активированного энтерокиназой трипсина [5]. В основе определения активности щелочной фосфатазы кишечника лежит расщепление под ее воздействием бесцветного фенолфталеинфосфата и высвобождение фенолфталеина, дающего красное окрашивание реакционной смеси. За единицу активности принимают то разведение, где степень окрашивания совпадает с интенсивностью стандартного щелочного раствора фенолфталеина [6]. Критериями эффекта бактериотерапии являются усиление активности энтерокиназы в 2-3 раза, щелочной фосфатазы в 4-5 раз.

К недостаткам известного способа следует отнести
необходимость длительной и тщательной обработки исходного биологического материала (гомогенизация, центрифугирование, экстрагирование);
многоэтапность исследования с использованием большого количества реактивов.

Техническим результатом предлагаемого способа является сокращение времени определения и повышение его точности за счет обеспечения стабильности получаемых результатов при исследовании нативного образца.

Технический результат достигается путем исследования образцов кала до и в процессе лечения.

Новым в достижении поставленного технического результата является то, что определяют нитратредуктазную активность кишечной микрофлоры методом ЭПР по концентрации нитрозильного комплекса гема (Гем-NO) в кале.

Новым является также то, что при нарастании концентрации Гем-NO на 25% и выше по сравнению с исходным уровнем эффективность бактериотерапии считают положительной.

Гем-NO образуется в кишечном содержимом при наличии гемсодержащих групп (гемоглобин, миоглобин, каталаза, цитохромы), нитратов или нитритов и микроорганизмов, способных восстанавливать NO^- ₂ и NO^- ₃ до монооксида азота (NO). Сигнал Гем-NO парамагнитен и регистрируется в кале при ЭПР-спектроскопии. Способностью к восстановлению нитратов и нитритов обладают многие кишечные микробы: кишечные палочки, энтерококки, бактероиды, синегнойные палочки и др. По интенсивности данного ЭПР-сигнала можно судить об уровне нитратвосстанавливающей активности в биологических субстратах [7]. При наличии дисбактериоза нитратредуктазная способность микрофлоры снижается. Применение бактерийных препаратов приводит к ее восстановлению вследствие улучшения микроэкологии кишечника и заселения штаммами микроорганизмов с выраженной нитратредуктазной активностью. Соответственно, нарастает концентрация Гем-NO в кишечном содержимом, что и предлагается использовать в качестве критерия эффективности бактериотерапии.

Использование ЭПР-спектроскопии позволяет повысить чувствительность определения, так как данный метод обладает высокой разрешающей способностью и специфичностью. Регистрируемый сигнал Гем-NO присущ только монооксиду азота, соединенному с гемсодержащими группами.

Сопоставление амплитуд зарегистрированных сигналов до и после курса бактерийных препаратов позволяет сделать вывод о динамике нитратредуктазной активности микрофлоры и соответственно об эффективности лечения.

При нарастании концентрации Гем-NO в кале на 25% и выше по сравнению с исходным уровнем (контролем) эффект бактериотерапии считают положительным. Незначительный прирост (<25%) или его отсутствие свидетельствует о неэффективности бактерийных препаратов.

Из приведенного выше сопоставительного анализа следует, что заявляемый способ отличается от прототипа тем, что определяют нитратредуктазную активность кишечной микрофлоры методом ЭПР по концентрации нитрозильного комплекса гема (Гем-NO) в кале и при нарастании концентрации Гем-NO на 25% и выше по сравнению с исходным уровнем эффективность бактериотерапии оценивают положительной, что соответствует критерию "новизна".

Предлагаемый способ позволяет сократить время определения и повысить его точность за счет обеспечения стабильности получаемых результатов при исследовании нативного образца, а также прост в использовании, что соответствует критерию "промышленная применимость".

При анализе известных способов оценки эффективности бактериотерапии кишечных дисбактериозов сведений о влиянии отличительных признаков способа на достижение технического результата не выявлено. Это дает возможность сделать вывод о соответствии заявляемого изобретения требованию "изобретательский уровень".

Предложенный способ осуществляют следующим образом.

Используют метод фиксации биологических тканей - замораживание при 77 K. Кал в объеме 3-4 г собирают в стеклянные флаконы. Не позднее чем через 4 часа готовят образцы для исследования. Для этого используют специальную пресс-форму. Пресс-форму взвешивают до и после помещения в нее образца, затем вместе с субстратом замораживают в жидком азоте. После полного охлаждения образец выдавливают в емкость с жидким азотом, затем помещают в кварцевый сосуд Дьюара и термостатируют. Высота полученного образца составляет 45 мм, диаметр - 4 мм. Расчет концентрации Гем-NO ведут на 100 мг материала.

Спектры ЭПР регистрируют при амплитуде высокочастотной модуляции 0,5 мТ, мощности СВЧ-излучения 5 мВт. Спектры фиксируют в диапазоне магнитного поля от 40 до 400 мТ при его развертке 320 мТ от меньшего поля к большему, постоянной времени 0,3 с, усилении от 1 до 5.

Приготовление опытных образцов кишечного содержимого после курса лечения и запись спектров ЭПР происходят в идентичных условиях.

При необходимости проводят количественную оценку содержания Гем-NO по калибровочной кривой.

Сущность предложенного способа поясняется фигурами приложения.

На фиг. 1 показан зарегистрированный сигнал Гем-NO в кале. На оси абсцисс - развертка магнитного поля в мТ, на оси ординат - амплитуда сигнала в мм.

На фиг. 2 показаны сигналы ЭПР Гем-NO до и после 14-суточного курса лечения эубиотиками. Обозначения те же, что и на фиг. 1. Как видно, концентрация Гем-NO увеличилась на фоне бактериотерапии.

Предложенный способ поясняется примерами.

Пример 1.

Пациент Т. , 50 лет. При клиническом обследовании предъявлял жалобы на отрыжку съеденной пищей, явления метеоризма, запоры до 3 суток. Болезненности при пальпации живота не отмечал. Общий и биохимический анализ крови в пределах нормы. На ультразвуковом исследовании (УЗИ) органов брюшной полости выявлен хронический холецистит. Бактериологический анализ кала: дисбактериоз 3 стадии по Г. Г. Кузнецовой (1972).

Больному назначен курс бактериотерапии эубиотиками "Бифивит" и "Ацидолакт" per os в дозе 100 мл утром и вечером. Проводилась ЭПР-спектроскопия кала по описанной выше методике перед началом лечения и по истечении 14 дней.

Содержание Гем-NO в кале составило:
Исходно - 2,0•10^-5 М;
После двухнедельного курса лечения - 3,0•10^-5 М;
Прирост концентрации Гем-NO - 50%.

Заключение: учитывая рост содержания Гем-NO в кале, эффект назначенной бактериотерапии положительный. Это подтверждается повторным исследованием кала на дисбактериоз (увеличение количества облигатных лактобацилл, нормализация уровня кокковых форм).

Пример 2.

Пациент П. , 58 лет. При сборе анамнеза отмечал чувство горечи во рту, явления метеоризма, периодические боли в области правого подреберья, наличие слизи и непереваренной пиши в кале. Объективное обследование выявило обложенность слизистой языка, болезненность при пальпации живота, гепатомегалию. По данным УЗИ имеются камни желчного пузыря, диффузные изменения в поджелудочной железе, неспецифические изменения в печени. При бактериологическом исследовании кала обнаружен дисбактериоз 3 стадии.

Больному назначен курс бактериотерапии по схеме и в дозах, указанных выше. При проведении ЭПР-спектроскопии кала выявлены следующие данные:
Гем-NO кала до начала лечения - 0,4•10^-5 М;
После двухнедельного курса приема эубиотиков - 1,4•10^-5 М;
Прирост концентрации Гем-NO - 250%.

Заключение: рост содержания Гем-NO в кале свидетельствует о положительном эффекте назначенной бактериотерапии. Проведенное контрольное исследование кала на дисбактериоз подтверждает данное заключение (увеличилось количество лактобацилл, снизился уровень обсемененности гемолизирующей кишечной палочкой и энтерококками, отсутствовал избыточный рост клостридий).

Пример 3.

Пациент Ж. , 54 года. Находился на лечении в Областной клинической больнице N 1 г. Иркутска с диагнозом ИБС. Прогрессирующая стенокардия. При обследовании обнаружена язвенная болезнь желудка в стадии обострения. Больному рекомендована бактериотерапия эубиотиками в плане комплексного лечения. В процессе лечения исследовался Гем-NO кала методом ЭПР.

Исходный уровень Гем-NO составил 2,6•10^-5 М;
После двухнедельного курса лечения - 2,2•10^-5 М;
Снижение концентрации Гем-NO - 15%.

Заключение: отсутствие роста содержания Гем-NO в кале свидетельствует о недостаточном эффекте бактериотерапии. Повторное исследование кала на дисбактериоз выявило при этом ухудшение состава микрофлоры (уменьшение количества Lactobacillus и Е. coli).

Всего было проведено 21 исследование по определению динамики содержания Гем-NO в кале на фоне бактериотерапии эубиотиками. У всех пациентов дважды проводилось исследование кала на дисбактериоз.

После курса лечения уровень Гем-NO увеличился в среднем на 27% (P<0,05). При этом бактериологически выявлено улучшение микробного пейзажа. Увеличилось количество бифидобактерий (P<0,001). Реже высевались условно-патогенные штаммы гемолизирующей Е. coli, грибов рода Candida, клостридий, не выявлен рост протея и гемолитического стафилококка, уменьшился уровень Lactobacillus и лактозопозитивной Е. coli. В целом по исследуемой группе снизилась стадия дисбактериоза (P<0,01).

Таким образом, заявляемый способ позволяет быстро, качественно и относительно недорого оценивать эффективность бактериотерапии дисбактериозов. Способ может быть использован в клинике при комплексном лечении ряда патологических состояний.

Список литературы
1. Добрынин В. М., Каргальцева Н.М., Добрынина И.А. Микробиологическая диагностика дисбактериозов кишечника. Рекомендации для врачей.- СПб., 1996.- 17 с.

2. Мартынова В.А., Толкачева Т.В., Абакумов Е.М. Содержание иммуноглобулинов и лизоцима в кишечнике при коррекции дисбактериоза у больных острыми лейкозами//Вопр. онкологии.- 1981.- Т. 27, N 7.- С. 39-43.

3. Андреева Н.Е., Чернохвостова Е.В. Иммуноглобулинопатии.- М., 1985.- 240 с.

4. Савельева Л.А. и др. Применение препаратов, содержащих живые бифидобактерии, при дисбактериозе у детей// Бифидобактерии и их использование в клинике, медицинской промышленности и сельском хозяйстве: Сб. науч. тр.- М., 1986.- С. 127-131.

5. Шлыгин Г.К., Порядков Л.Ф. Методика определения энтерокиназы //Вопр. мед. химии.- 1973.- Т. 19, Вып. 6, С. 662-665.

6. Фомина Л.С., Михлин С.Я., Шлыгин Г.К. Методика определения фосфатазы кишечника//Биохимия.- 1952.- Т. 17, Вып. 2.- С. 134-138.

7. МПК G 01 N 33/48; А.С. N 1529115.

Изобретение относится к области медицины, а именно к гастроэнтерологии и клинической микробиологии, может быть использовано для оценки эффективности воздействия бактерийных лечебных препаратов на состав и функции кишечной микрофлоры. Способ обеспечивает сокращение времени определения и повышение его точности за счет обеспечения стабильности получаемых результатов при исследовании нативного образца. Используют метод фиксации биологических тканей - замораживание при 77 К. Определяют нитратредуктазную активность кишечной микрофлоры методом электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) и по концентрации нитрозильного комплекса гема (Гем-NO) в кале. При нарастании концентрации Гем-NO на 25% и выше по сравнению с исходным уровнем эффективность бактериотерапии считают положительной. 2 ил.

Способ оценки эффективности бактериотерапии дисбактериоза кишечника путем исследования образцов кала до и в процессе лечения, отличающийся тем, что определяют нитратредуктазную активность кишечной микрофлоры методом ЭПР по концентрации нитрозильного комплекса гема (Гем-NO) в кале и при нарастании концентрации Гем-NO на 25% и выше, по сравнению с исходным уровнем, эффективность бактериотерапии считают положительной.