АГЕНТ, СТИМУЛИРУЮЩИЙ РЕГЕНЕРАЦИЮ ТВЕРДОЙ ТКАНИ Российский патент 2000 года по МПК A61K31/722 A61K31/737 A61K31/727 A61L27/34 A61P19/00 

Настоящее изобретение относится к новой методике стимуляции или ускорения регенерации твердой ткани в связи с так называемой оссеоинтеграцией, например, эффектом, к которому стремятся при имплантации чужеродных имплантатов в твердую ткань, в частности в костную ткань. Это изобретение относится также к способу выполнения такой оссеоинтеграции, применяющему эту новую методику по настоящему изобретению. Помимо этого, это изобретение относится к образованию новой кости в связи с дефектами костной ткани или какой-либо иной потребностью в костной ткани.

Предпосылки к созданию изобретения
Имплантаты, предназначенные для фиксации твердых тканей, в частности костной ткани, все более широко применяются в одонтологии, ортопедии, нейрохирургии, хирургии кисти, а также в пластической и реконструктивной хирургии. Долгосрочная фиксация имплантатов в кости осуществляется титаном, и следует принимать во внимание, что материалы на основе титана и в будущем будут широко применяться как материалы выбора для имплантатов и протезов.

Клиническая проблема, касающаяся так называемой оссеоинтеграции, заключается в том, что имплантат нельзя подвергать нагрузке до тех пор, пока не будет достигнута достаточная костная фиксация, для чего может потребоваться от 6 до 9 месяцев. Поэтому для клиники исключительно важно ускорить процесс заживления посредством обеспечения ассоциации стимулированного костного образования и имплантата. Существует также необходимость регенерации кости для соединения между собой дефектов или участков там, где имела место резорбция кости, например в беззубых частях челюстей, или там, где костная ткань была утеряна вследствие, например травмы, опухоли или оперативного вмешательства.

Сущность изобретения
Главной целью настоящего изобретения является стимуляция роста клеток твердой ткани, например костных клеток, таким образом, чтобы объем твердой ткани возрастал.

Другой целью настоящего изобретения является создание способа, обеспечивающего образование регенерированной костной ткани преимущественно пластинчатого, компактного типа, в то время как обширное образование рубцевой ткани сводится к минимуму.

Еще одной целью настоящего изобретения является создание нового агента, способного обеспечить, вместе с имплантатами в твердую ткань, стимулированную регенерацию этой твердой ткани, например костной ткани.

Еще одной целью настоящего изобретения является создание способа улучшенной оссеоинтеграции в связи с имплантацией чужеродных имплантатов в твердую ткань с одновременной стимуляцией регенерации ткани.

Еще одной целью настоящего изобретения является создание имплантатов, обработанных агентом, стимулирующим регенерацию твердой ткани.

Для этих и других целей, которые будут видны из дальнейшего описания, в настоящем изобретении обеспечено новое применение хитозана и фиксированного на нем полисахарида, выбранного из гепарина, гепарансульфата, хондроитинсульфатов и декстрансульфата. Это новое применение относится к изготовлению агента, способного обеспечить стимулированную регенерацию твердой ткани. Такая стимулированная регенерация может, например, обеспечиваться в связи с имплантатами в твердую ткань, такую как костная ткань.

Полисахарид может фиксироваться на хитозановом матриксе несколькими способами, например, посредством ионных связей, ковалентной связью с множеством участков или с концевым участком или посредством механической фиксации на хитозановом матриксе в связи с выпадением в осадок из раствора. Ионные связи и ковалентные связи являются предпочтительными способами фиксации.

Агент, стимулирующий твердые ткани, по настоящему изобретению может находиться в различных физических формах, например, в форме мембраны, порошка, геля, гранул или раствора. В случае использования имплантата, та часть его, которая должна быть интегрирована в твердую ткань, может быть погружена в агент для нанесения его на имплантат. Этот агент, разумеется, может быть помещен в твердую ткань pez se, например, в полость, созданную в костной ткани.

Предпочтительным для имплантации материалом является титан, но также могут применяться и другие материалы для имплантации.

Хитозан является линейным 1,4-полисахаридом, построенным из единиц β-D-глюкозамина. Хитозан получают посредством N-дезецетилирования хитина, полимера, образующего панцирь inter alia насекомых и водных животных. В промышленных условиях хитин получают из панцирей крабов и креветок, представляющих из себя отходы рыбообрабатывающего производства. Путем регулирования обработки хитина щелочью можно получать хитозаны различной степени N-ацетилирования. При обработке хитина концентрированной щелочью, обычно гидроксидом натрия, происходит N-дезацетилирование, т. е. ацетамидные группы пре вращают в аминогруппы, в результате чего образуется хитозан.

Физические свойства хитозана, определяющие его пригодность, зависят от степени его N-ацетилирования, молекулярного веса и гомогенности. Хитозан является биоразлагаемым веществом как за счет хитина пищеварительной системы, так и за счет лизоцима и других ферментов организма.

В связи с применением по настоящему изобретению предпочтительно, чтобы хитозан имел степень N-ацетилирования не более приблизительно 90% и, предпочтительнее, не более приблизительно 50%. Особенно предпочтительно, чтобы степень N-ацетилирования составляла менее приблизительно 25%.

Предпочтительным полисахаридом для фиксации к хитозановому матриксу является гепарин или гепарансульфат. Специальная методика присоединения гепарина ковалентной связью к матриксам, содержащим аминогруппы, описана в патерте США N 4613665.

Настоящее изобретение предусматривает также способ стимуляции и/или ускорения регенерации твердой ткани, например, в связи с так называемой оссеоинтеграцией. Этот способ характеризуется тем, что перед имплантацией на имплантат и/или в твердую ткань наносят указанный агент, полученный на основе хитозана, и фиксированного на нем полисахарида, который выбирают из гепарина, гепарансульфата, хондроитинсульфатов и декстрансульфата, в количестве, достаточном для стимуляции. Оссеоинтеграция является оптимальной формой долгосрочной фиксации в твердой ткани, в частности в костной ткани, имплантата из неаутологичных и различных чужеродных материалов.

При осуществлении этого способа агент может наноситься в форме порошка, раствора, геля, гранул, пленки или мембраны. Альтернативно, агент может наноситься путем погружения части имплантата, предназначенной для интегрирования в твердую ткань, в раствор соответствующих составляющих - хитозана и фиксированного на нем полисахарида.

Настоящее изобретение включает также имплантаты, предназначенные для интегрирования в твердую ткань, в частности в костную ткань. В этих имплантатах ту часть, которая предназначена для интегрирования, покрывают агентом, стимулирующим регенерацию твердой ткани, который включает хитозан и полисахарид, фиксированный к хитозану, который выбирают из гепарина, гепарансульфата, хондроситинсульфатов и декстрансульфата. Особенно предпочтительно, чтобы имплантат включал титан.

Примеры предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения
Настоящее изобретение далее иллюстрируется неограничительными примерами. В этих примерах проценты и части относятся к весу, если не указывается иное.

Пример 1
Нанесение хитозанового покрытия на титановый винт
Титановые винты погружали в раствор хитозана в 2% уксусной кислоте (1 вес. %/объем) и оставляли в указанном растворе на 15 минут. Хитозан представлял собой препарат Sea Cure 313, Pronova Biopolymer, 15% N-ацетилирование. Обработанные титановые винты затем высушивали в сухожаровом шкафу при 70^oC в течение 16 часов, а затем нейтрализовали 1 М NaOH и многократно ополаскивали в дистиллированной воде, а затем вновь высушивали в сухожаровом шкафу. Винты помещали в упаковку типа "peel open" и стерилизовали этиленоксидом.

Пример 2
Титановые винты с гепарином, присоединенным ионной связью
Винты, покрытые хитозаном, как описано в примере 1, переносили в раствор, состоящий из 125 мг гепарина (Pig Mucosa Kabivitrum) в 500 мл дистиллированной воды, и оставляли приблизительно на 16 часов, после чего ополаскивали их в дистиллированной воде и высушивали при комнатной температуре. Винты помещали в упаковку типа "peel open" и стерилизовали этиленоксидом. Количество фиксированного гепарина составляло приблизительно 2 мкг/см².

Пример 3
Титановые винты с гепарином, присоединенным ковалентной связью (присоединение концевым участком)
Гепарин растворяли в воде (300 мл). Этот раствор охлаждали до 0^oC в ледяной воде и поддерживали в холодном состоянии. Сначала к раствору при перемешивании добавляли нитрит натрия (NaNO₃, 10 мг), а затем - уксусную кислоту (2 мл). Реакционную смесь поддерживали при 0^oC в течение 2 часов, подвергали диализу и лиофильной сушке. Выход составлял 0,7 г.

Титановые винты, покрытые хитозаном, как описано в примере 1, переносили в раствор, состоящий из 125 мг описанного выше разложенного нитритом гепарина, 15 мг NaCNBH₃ в 500 мл дистиллированной воды, и доводили pH до 3,9 с помощью 0,1 М HCl. Реакционную смесь поддерживали при комнатной температуре в течение 16 часов. Винты затем споласкивали в дистиллированной воде и высушивали при комнатной температуре. Обработанные титановые винты помещали в упаковку типа "peel open" и стерилизовали этиленоксидом. Количество фиксированного гепарина составляло приблизительно 1,5 мкг/см².

Пример 4
Титановые винты с гепарином, присоединенным ковалентной связью (присоединение множеством участков)
Раствор гепарин-натрия, окисленного периодатом натрия, получали следующим образом: один грамм периодата натрия NaIO₄, растворяли в 200 мл дистиллированной воды. К раствору добавляли десять граммов гепарин-натрия и перемешивали в течение ночи в темноте. Полученный раствор, после добавления 10 мл глицерина и перемешивания в течение двух часов подвергали диализу против воды. Воду меняли через каждый час. В результате получали раствор, содержавший гепарин, окисленный периодатом, в концентрации приблизительно 19 мг/мл.

Титановые винты, покрытые хитозаном, как описано в примере 1, переносили в раствор, состоящий из 125 мг описанного выше окисленного периодатом гепарина, 15 мг NaCNBH₃ в 500 мл дистиллированной воды. Реакцию далее проводили, как описано в примере 3.

Пример 5
Изготовление хитозановой пленки
5 г гидрохлорида (50% степень ацетилирования, Pronoya) растворяли в дистиллированной воде (0,5 л, 1 об.%/вес). 10 мл полученного раствора переносили в чашку Петри и получали хитозановую пленку путем выпаривания и высушивания в сухожаровом шкафу при 70^oC в течение 24 часов. Полученную пленку затем нейтрализовали добавлением фосфатного буфера, 0,2 М, pH 9,0. Пленку оставляли в чашке Петри в этом буфере при комнатной температуре на 2-4 часа, затем 3-4 раза промывали водой и оставляли высыхать.

Пример 6
Пленки с ковалентно присоединенным гепарином (присоединение концевым участком)
К нейтрализованной хитозановой пленке, приготовленной, как описано в примере 1, добавляли 20 мл раствора, содержавшего 125 мг разложенного нитритом гепарина, приготовленного, как описано в примере 3, растворенного в 0,5 л воды и содержащего 4,4 г NaCI. К раствору добавляли 15 мг цианборгидрида натрия. pH раствора доводили до 3,9 с помощью 0,5 М хлористо-водородной кислоты или другой кислоты. Раствор, содержавший хитозановую пленку, оставляли стоять при комнатной температуре в течение 14 часов и обработанную пленку затем 3-4 раза промывали водой и оставляли высыхать.

Пример 7
Пленки с гепарином, присоединенным ионной связью
К нейтрализованной хитозановой пленке, приготовленной, как описано в примере 1, добавляли 20 мл раствора, содержавшего 125 мг гепарина, растворенного в 0,5 л воды, и 4,4 г NaCI. Раствор, содержавший хитозановую пленку, оставляли стоять при комнатной температуре в течение 14 часов и обработанную пленку затем 3-4 раза промывали водой и оставляли высыхать. Полученную пленку можно перемалывать в порошок с целью применения для оссеоинтеграции по настоящему изобретению.

Пример 8
Биологические испытания
В качестве экспериментальных животных использовали взрослых кроликов, которым производили анестезию и подготовку к операции в стерильных условиях, в области коленных суставов кроликам удаляли шерсть.

Производили дистальный разрез кожи длиной 35-40 мм в области коленного сустава против большеберцовой проксимальной части области эпифазарного хряща. Рассекали надкостницу и при охлаждении непрерывно подаваемым стерильным физиологическим раствором с фосфатным буфером высверливали 3,5 мм сверлом на малой скорости вращения отверстие через компактное вещество кости до костномозговой полости. Затем в проксимальную часть на расстоянии 4 мм продевали титановый винт с гексагональной головкой и дистальнее на расстоянии 6 мм помещали другой титановый винт, оба диаметром 3,5 мм. Фесциальную и кожную раны зашивали единичными швами. В этих экспериментах, помимо обработанных, как описано в примерах 1-3, титановых винтов, использовали также необработанные титановые винты.

Спустя 4 и 12 недель, соответственно, кроликам вновь производили анестезию. В области коленного сустава выстригали шерсть и производили разрез кожи дистальнее коленного сустава в направлении большеберцовой кости. Винты обнажали и индетифицировали, а также определяли момент извлечения из кости проксимальных винтов. Дистальные винты подготавливали для световой микроскопии, причем имплантат оставался в кости jn situ.

Пример 9
Титановый порошок с гепариновым покрытием или без него
Нанесение покрытия из хитозана на титановый порошок выполняли, в главных чертах, как описано в примере 1, а фиксацию выполняли, как описано в примере 3.

Малоберцовую кость на каждой задней лапе обнажали и ее мышечную ткань отслаивали продольно на расстоянии приблизительно 10 мм по средней линии тела кости. Сегмент обнаженной малоберцовой кости длиной б мм удаляли вместе с надкостницей и дефект между концами кости заполняли титановым порошком. Для соединения краев дефекта и предупреждения инвазии грануляционной ткани вокруг обертывали мембранный фильтр из PTFE. С одной стороны титановый порошок был с гепариновым покрытием, а с другой - титановый порошок без гепаринового покрытия. После этого раны закрывали. Крысам предоставляли возможности двигаться без ограничений в течение 3 недель перед вторым исследованием и умервщлением животных. Исследование дефектов малоберцовой кости на каждой стороне показало, что кость, губчатая и пластинчатая, соединила края в обоих дефектах. Однако вдоль гепаринизированного титанового порошка наблюдалось более обширное образование кости. Помимо этого, вдоль гепаринизированного титанового порошка наблюдалось больше пластинчатой, т. е. хорошо организованной кости.

Таким образом, титановый порошок, покрытый гепарином, как описано выше, стимулирует новообразование кости даже при отсутствии надкостницы.

Пример 10
Остеогенная активность мембраны из хитозана с гепарином, присоединенным ионной связью, по результатам методики замещения дефекта малоберцовой кости
У крыс под наркозом на каждой задней лапе обнажали малоберцовую кость и ее мышечную ткань отслаивали продольно на расстоянии приблизительно 10 мм по средней линии тела кости. Сегмент обнаженной малоберцовой кости длиной 6 мм удаляли вместе с надкостницей и дефект между концами кости обертывали хитозановой пленкой.

Слева помещали хитозановую мембрану, приготовленную, как описано в примере 5 (хитозан с 15% ацетилирования), а на дефект правой малоберцовой кости помещали гепаринизированную хитозановую мембрану, приготовленную, как описано в примере 7 (хитозан с 15% ацетилирования).

Для того, чтобы избежать спадения трубки, образованной мембранами и соединяющей края 6 мм дефекта кости, вдоль дефекта помещали маленькие фрагменты кости.

Исследование спустя три недели показало, что у обоих животных сперва наблюдалось более выраженное образование матрикса кости и кости, т.е. там, где применяли гепаринизированную хитозановую пленку.

Пример 11
Остеогенная активность гепаринизированной хитозановой мембраны, по результатам методики образования кости в отверстии свода черепа
Давно установлено, что если дефекты кости превышают определенные размеры, то их заживление происходит с образованием мембраны из фиброзной рубцовой ткани, соединяющей края дефектов кости. Критическим размером для дефектов в своде черепа взрослых крыс является 8 мм, т. е. отверстия 8 мм или большего диаметра не закрываются костной тканью.

Крысам производили парамедиальный разрез кожи от назофронтальной области до наружного выступа затылочной кости. Кожу и нижележащие ткани, включая большую часть височной мышцы каждой стороны, отслаивали. Для создания 8 мм отверстия в черепе с обеих сторон использовали специально изготовленный трепан. Были приняты чрезвычайные меры предосторожности, чтобы не повредить мозговые оболочки и мозг.

Сперва на твердую мозговую оболочку помещали мембрану из хитозана с гепарином, присоединенным ионной связью, приготовленную, как описано в примере 9, на ней размещали множественные костные фрагменты и на череп помещали идентичную дополнительную мембрану. После этого точно таким же образом слева помещали негепаринизированную хитозановую мембрану, приготовленную, как описано в примере 5, с промежуточными костными фрагментами. После этого сухожильный шлем и кожу закрывали.

Спустя 3 недели крыс усыпляли и исследовали череп. Показано, что на правой стороне дефект покрывало больше остероидной и новообразованной костной ткани, чем на левой стороне. Помимо этого, наблюдалась менее выраженная воспалительная реакция на гепаринизированные хитозановые мембраны.

Пример 12
Приготовление хитозановых гранул, покрытых декстрансульфатом или гепарином или хондроитин-4-сульфатом
По каплям из шприца добавляли водные растворы хитозана (2 вес.%/объем, 18% ацетилирования) к раствору декстрансульфата, или гепарина, или хондроитин-4-сульфата (0,1 вес. %/объем) в триполифосфатном буфере. Полученные гранулы помещали на стеклянный фильтр, промывали водой (1 л) и высушивали при 30^oC в течение ночи.

Пример 13
Остеогенная активность хитозановых гранул по результатам образования кости после субпериостального депонирования на черепе
Помещение испытуемого в отношении остеогенной активности соединения под надкостницу черепа является хорошо известной методикой.

Гранулы, изготовленные из хитозана и гепарина, хитозана, покрытого декстрансульфатом, и хитозана, покрытого хондроитин-4-сульфатом, как описано в примере 12, помещали субпериостально на лобную кость взрослых крыс. Одну такую гранулу помещали на каждой стороне. Образование кости оценивали спустя 3 недели.

Хитозан-гепариновые гранулы являлись остеогенными, о чем свидетельствовало образование остеоида и костной ткани на лобной кости. Хитозановые гранулы, покрытые хондроитинсульфатом и хитозановые гранулы, покрытые декстрансульфатом, также продемонстрировали остеогенную активность. Также определялись клетки воспаления в различных, обычно малых, количествах.

Эти эксперименты показали, что хитозан в комбинации с определенными полисахаридами демонстрирует остеогенную активность.

Возможно, можно добиться еще более качественной стимуляции заживления посредством комбинирования настоящего изобретения с факторами роста.

Эксперименты in vitro с кФРФ, меченным иодом 125 (кислый фактор роста фибробластов, Bachem California), показали значимо более высокое специфическое связывание фактора роста с гепаринизированным винтом по сравнению с негепаринизированным винтом. Даже если не ограничивать настоящее изобретение какой-либо конкретной теорией, представляется вероятным, что эндогенные факторы роста накапливаются на границе между имплантатом и окружающей костью, если винт снабжен покрытием из хитозан-гепарина, что приводит к стимулированию регенерации кости.

Настоящее изобретение не ограничивается вариантами его осуществления, описанными выше, и применимо ко всем формам имплантатов, предназначенных для интегрирования в твердую ткань, в частности в костную ткань. Таким образом, настоящее изобретение применимо во всех областях, например, одонтологии, ортопедии, нейрохирургии, хирургии кисти и пластической и реконструктивной хирургии. Также настоящее изобретение вполне пригодно для применения в области стоматологии.

Изобретение относится к применению хитозана и фиксированного на нем полисахарида, выбранного из гепарина, гепарансульфата, хондроитинсульфатов и декстрансульфата, в качестве агента, способного обеспечить стимулированную регенерацию твердой ткани. Также раскрыт способ стимуляции и/или ускорения регенерации твердой ткани путем нанесения указанного агента на соответствующий участок ткани. Третьим объектом является имплантат для интегрирования в твердую ткань. По меньшей мере, часть имплантата, предназначенная для интегрирования, покрыта указанным агентом. Изобретение обеспечивает стимуляцию роста клеток твердой ткани, образование регенерированной костной ткани преимущественно пластинчатого, компактного типа. 3 с. 17 з.п. ф-лы.

1. Применение хитозана и фиксированного на нем полисахарида, выбранного из гепарина, гепарансульфата, хондроитинсульфатов и декстрансульфата, в качестве агента, способного обеспечить стимулированную регенерацию твердой ткани. 2. Применение по п.1, отличающееся тем, что стимулированная регенерация твердой ткани создается в связи с имплантатами в твердую ткань, такую как костная ткань. 3. Применение по п.1 или 2, отличающееся тем, что полисахарид фиксируется на хитозане посредством ионных связей. 4. Применение по п.1 или 2, отличающееся тем, что полисахарид фиксируется на хитозане посредством ковалентных связей. 5. Применение по любому из предыдущих пунктов, отличающееся тем, что полисахаридом является гепарин или гепарансульфат. 6. Применение по любому из предыдущих пунктов, отличающееся тем, что агент находится в форме порошка или раствора. 7. Применение по любому из пп.1 - 5, отличающееся тем, что агент находится в форме геля. 8. Применение по любому из пп.1 - 5, отличающееся тем, что агент находится в форме гранул. 9. Применение по любому из предыдущих пунктов, отличающееся тем, что хитозан имеет степень N-ацетилирования не более приблизительно 90% и предпочтительнее не более приблизительно 50%. 10. Применение по п.9, отличающееся тем, что хитозан имеет степень N-ацетилирования менее приблизительно 25%. 11. Применение по любому из пп.2 - 10, отличающееся тем, что имплантат включает в себя титан. 12. Способ стимуляции и/или ускорения регенерации твердой ткани, отличающийся тем, что агент, включающий хитозан и фиксированный на нем полисахарид, выбранный из гепарина, гепарансульфата, хондроитинсульфатов и декстрансульфата, в количестве, достаточном для стимуляции, наносят на соответствующий участок. 13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что регенерация твердой ткани связана с оссеоинтеграцией. 14. Способ по п.13, отличающийся тем, что оссеоинтеграция выполняется в связи с имплантатами в твердую ткань, такую как костная ткань. 15. Способ по любому из пп.12 - 14, отличающийся тем, что указанный агент наносят в форме порошка. 16. Способ по любому из пп.12 - 14, отличающийся тем, что указанный агент наносят в форме геля. 17. Способ по любому из пп.12 - 16, отличающийся тем, что полисахарид представляет собой гепарин или гепарансульфат. 18. Способ по любому из пп.13, 14 или 17, отличающийся тем, что агент наносят путем погружения той части имплантата, которая предназначена для интегрирования в твердую ткань, в раствор хитозана и указанного полисахарида. 19. Имплантат, предназначенный для интегрирования в твердую ткань, отличающийся тем, что по меньшей мере часть имплантата, которая предназначена для интегрирования, покрыта агентом, стимулирующим регенерацию твердой ткани, включающим в себя хитозан и фиксированный на нем полисахарид, который выбирают из гепарина, гепарансульфата, хондроитинсульфатов и декстрансульфата. 20. Имплантат по п.19, отличающийся тем, что он включает в себя титан.