Настоящее изобретение относится к способам и композициям для доставки лекарственно полезных пептидов и белков.
Предпосылки к созданию изобретения.
Хотя появление генной инженерии привело к быстрому расширению списка лекарственных средств на основе пептидов, однако, основным препятствием терапии на основе пептидов является значительно затруденная реализация всего потенциала этой области: в общем, лекарственные средства на основе пептидов нельзя вводить в эффективных дозах перорально, поскольку они быстро разрушаются под действием ферментов в желудочно-кишечном тракте до того, как они могут достигать кровотока. Если интересующий полипептид нельзя изменить, чтобы сделать его относительно устойчивым к таким ферментам, единственным практическим способом доставки лекарственного средства, вероятно, является парентеральный путь, например, внутривенная, внутримышечная и подкожная инъекция. Введение другими парентеральными путями (например, абсорбцией через носовые, щечные или ректальные оболочки или через легкие) оказалось менее успешным.
Краткое изложение существа изобретения
Было найдено, что, когда пептид или белок ( в дальнейшем собирательно именуемые как полипептиды) сочетают с подходящим усилителем абсорбции и вводят в легкие в форме порошка с подходящим размером частиц, он легко входит в малый круг кровообращения путем абсорбции через слой эпителиальных клеток в нижних дыхательных путях. Это удобно выполняется ингаляцией порошка из устройства-ингалятора, которое отпускает точную дозу порошкообразной комбинации полипептид/усилитель с размером частиц, который увеличивает до максимума отложение в нижних дыхательных путях в отличие от полости рта и горла. (С целью облегчения упоминания полипептид и усилитель в дальнейшем собирательно именуются как "активные соединения". Для выполнения этой предпочтительной доставки в легкие по возможности больше активных соединений должно состоять из частиц, имеющих диаметр менее, чем приблизительно 10 мкм (например, между 0,01-10 мкм, идеально между 1-6 мкм). В предпочтительных вариантах по меньшей мере 50% (предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере 80% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90%) от общей массы активных соединений, которые находятся в устройстве-ингаляторе, состоит из частиц с желаемым пределом размеров диаметров.
Изобретение, таким образом, включает фармацевтическую композицию, содержащую смесь активных соединений: (А) фармацевтически активного полипептида и (В) соединения-усилителя, которое усиливает системную абсорбцию полипептида в нижней дыхательной системе (предпочтительно легких) пациента, причем смесь находится в форме пригодного для ингаляции сухого порошка, в котором по меньшей мере 50% общей массы активных соединений (А) и (В) состоит из первоначальных частиц, имеющих диаметр менее чем или равный около 10 микронам. Первоначальные частицы могут быть упакованы как таковые или могут быть превращены в агломераты, которые затем, в основном, дезагломерируются до введения в дыхательные пути пациента. Композиция может, конечно, содержать, если требуется, другие компоненты, включая другие фармацевтически активные агенты, другие усилители и фармацевтически приемлемые наполнители, например, разбавители или носители. Следовательно, терапевтический препарат настоящего изобретения может содержать только эти активные соединения или он может содержать другие вещества, например, фармацевтически приемлемый носитель. Этот носитель может преимущественно состоять из частиц, имеющих диаметр менее чем около 10 микрон, так что по меньшей мере 50% полученного в результате порошка в целом состоит из возможно агломерированных первоначальных частиц, имеющих диаметр менее чем около 10 микрон; альтернативно носитель может в основном состоять из гораздо больших частиц ("грубых частиц"), так что "готовую к употреблению смесь" можно образовать из активных соединений и этого носителя. В упорядоченной смеси, альтернативно известной как взаимодействующая или адгезивная смесь, мельчайшие частицы лекарственного средства (в настоящем изобретении активные соединения) довольно равномерно распределены на поверхности грубых частиц наполнителя (в настоящем изобретении фармацевтически приемлемого носителя). В таком случае активные соединения предпочтительно не находятся в форме агломератов до образования готовой к употреблению смеси. Грубые частицы могут иметь диаметр больше 20 микрон, например больше 60 микрон. Выше этих низших пределов диаметр грубых частиц не имеет критического значения, поэтому при желании можно применять крупные частицы разного размера в соответствии с практическими требованиями конкретной готовой препаративной формы. Не требуется, чтобы грубые частицы в назначенной смеси были одинакового размера, но они могут иметь сходный размер в пределах размера назначенной смеси с предпочтительным диаметром, равным 60-800 микрон.
Полипептид может быть любым лекарственно или диагностически пригодным пептидом или белком с размером от небольшого до среднего, т.е. с молекулярной массой (MW) до около 40 кДа, для которого желательна системная доставка. Для всех таких пептидов в общем пригодны и могут применяться механизмы повышенной полипептидной абсорбции в соответствии с настоящим изобретением, хотя степень, до которой повышается их адсорбция, может изменяться в соответствии с MW и физико-химическими свойствами полипептида и конкретным применяемым усилителем. Ожидается, что в настоящем изобретении будут наиболее пригодны полипептиды, имеющие молекулярную массу до 30 кДа, например полипептиды, имеющие молекулярную массу до 25 кДа или до 20 кДа, особенно до 15 кДа или до 10 кДа. Любой желаемый полипептид можно легко испытать для применения в настоящем изобретении с конкретным усилителем посредством анализов in vivo или in vitro, как здесь описано.
Соединением-усилителем, применяемым в композициях настоящего изобретения, может быть любое соединение, которое усиливает абсорбцию полипептида через эпителий нижних дыхательных путей и в большой круг кровообращения. Термин "усиливает абсорбцию" обозначает, что количество полипептида, абсорбированного в большой круг кровообращения в присутствии усилителя, больше, чем в его отсутствие. Предпочтительно количество абсорбированного полипептида значительно выше (p < 0,05) в присутствии усилителя. Пригодность любого потенциального усилителя для применения в настоящем изобретении можно легко определить при помощи анализов in vivo или in vitro, как здесь описано.
Количество абсорбированного полипептида в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно составляет по меньшей мере 150% количества, абсорбированного в отсутствие усилителя. В предпочтительных вариантах абсорбция полипептида по меньшей мере удваивается, более предпочтительно утраивается и наиболее предпочтительно учетверяется в присутствии усилителя по сравнению с абсорбцией его в отсутствие усилителя.
Усилитель предпочтительно является поверхностно-активным веществом, например солью жирной кислоты, солью желчной кислоты, производным соли желчной кислоты, алкилгликозидом, циклодекстрином или фосфолипидом. Усилитель может быть, например, солью натрия, калия или органического амина жирной кислоты, жирная кислота предпочтительно является каприновой кислотой или другой жирной кислотой с 10-14 атомами углерода. Предпочтительным усилителем является капрат натрия. Отношение полипептида к усилителю предпочтительно будет изменяться от 9:1 до 1:1. Хотя относительное содержание усилителя выше, чем 1: 1, должно, по-видимому, усиливать поглощение так же или лучше, чем более низкие относительные содержания, считают, что количество усилителя не должно быть выше, чем необходимо для достижения требуемого уровня усиления, поскольку избыток усилителя может вызывать нежелательные побочные действия, например местное раздражение.
В пределах изобретения находится также способ системного введения фармацевтически активного полипептида путем назначения пациенту вдыхания фармацевтической композиции настоящего изобретения, в которой по меньшей мере 50% общей массы активных соединений в месте входа в дыхательные пути пациента состоит из частиц, имеющих диаметр менее чем или равный около 10 микронам. Это предпочтительно осуществляется при помощи устройства-ингалятора, из которого пациент вдыхает порошок. Когда порошкообразная композиция находится в форме агломератов первоначальных частиц, устройство предпочтительно имеет такую форму, которая индуцирует значительное дезагломерирование агломератов при ингаляции порошка пациентом из устройства, так что основная часть агломератов распадается на частицы, имеющие диаметр менее чем или равный около 10 микрон, до входа порошка в дыхательную систему пациента. Такое дезагломерирование должно происходить внутри устройства, оно обычно индуцируется воздушной турбулентностью, создаваемой в устройстве силой вдыхания. В упорядоченной смеси агломераты в общем предпочтительно не образуются. В случае упорядоченной смеси активные соединения должны высвобождаться из больших частиц, предпочтительно при ингаляции, или при помощи механических средств в устройстве-ингаляторе, или только под действием вдыхания, или при помощи других средств, причем активные соединения затем отлагаются в нижних дыхательных путях, а частицы носителя отлагаются в полости рта.
Устройство-ингалятор предпочтительно является ингалятором с одной дозой сухого порошка, но может быть альтернативно ингалятором со многими дозами сухого порошка.
Данное изобретение включает также способы изготовления фармацевтической композиции, пригодной для введения ингаляцией. По одному такому способу сначала приготовляют раствор, в котором растворены (а) фармацевтически активный полипептид и (в) соединение-усилитель, которое усиливает системную абсорбцию полипептида в нижних дыхательных путях пациента. Растворитель затем удаляют из раствора, получая сухой твердый остаток, содержащий полипептид и усилитель, и этот сухой твердый остаток тонко измельчают для получения порошка. Второй такой способ включает сухое смешивание (а) фармацевтически активного полипептида и (в) соединения-усилителя и тонкое измельчение полученной смеси. Однако, третий пригодный способ включает стадии получения первого тонко измельченного препарата, содержащего полипептид, и второго тонко измельченного препарата, содержащего соединение-усилитель, и смешивание вместе двух тонко измельченных препаратов. Когда нужно включить носитель, исключая случаи, когда желательно получить упорядоченную смесь, его можно добавить в раствор или в сухую смесь фармацевтически активного полипептида до тонкого измельчения или тонко измельченный носитель можно смешать с другими тонко измельченными компонентами. При получении упорядоченной смеси тонко измельченные полипептид и усилитель смешивают с подходящим носителем.
Краткое описание рисунков
Фиг. 1 является графиком, иллюстрирующим влияние различных концентраций усилителя, в качестве которого применяют капрат натрия, на перенос соединения-маркера (маннита) через монослой культивированных эпителиальных клеток.
Фиг. 2 является графиком, иллюстрирующим влияние различных концентраций усилителя, в качестве которого применяют капрат натрия, на перенос соединения-маркера (маннита) через монослой культивированных эпителиальных клеток в присутствии полипептида (массовое соотношение капрата натрия и полипептида 1:3).
Фиг. 3 является графиком концентрации полипептида плазмы как функции времени после ингаляции только полипептида, полипептида с капратом натрия при соотношении 90:10 и полипептида и капрата натрия при соотношении 75:25.
Подробное описание
Некоторые предпочтительные варианты осуществления изобретения в общем описываются ниже.
Полипептид
Полипептид предпочтительно является пептидным гормоном, за исключением инсулина, например, вазопрессином, аналогом вазопрессина, дезмопрессином, глюкагоном, кортикотропином (АСТН), гонадотропином (лютеинизирующий гормон или LHPH), кальцитонином, c-пептидом инсулина, паратироидным гормоном (PTH), гормоном роста человека (hGH), гормоном роста (HG), рилизинг-гормоном гормона роста (GHRH), окситоцином, рилизинг-гормоном кортикотропина (CRH), аналогом соматостатина, аналогом агониста гонадотропина (GhRHa), предсердным натриуретическим пептидом (hANP), рилизинг-гормоном тироксина (TRHrh), фолликулостимулирующим гормоном (FSH) и пролактином.
Другие возможные полипептиды включают факторы роста, интерлейкины, полипептидные вакцины, ферменты, эндорфины, гликопротеины, липопротеины и полипептиды, включенные в систему свертывания крови, которые системно оказывают фармакологическое действие. Предполагается, что большинство (если не все) полипептидов с размером от малого до среднего, относительно высокой растворимостью в воде и изоэлектрической точкой между приблизительно pH3 и pH8 можно эффективно доставить способами изобретения.
Усилитель
Применение усилителя абсорбции имеет критическое значение, поскольку полипептид сам (один) плохо абсорбируется через легкие. Применяемый усилитель может быть любым из числа соединений, которые действуют, усиливая абсорбцию через слой эпителиальных клеток, выстилающий нижние дыхательные пути, и в соседнюю легочную сосудистую сеть. Усилитель может выполнять это действие любым из нескольких возможных механизмов. Эти механизмы предусматривают:
(1) Усиление парацеллюлярной проницаемости полипептида путем индуцирования структурных изменений в месте плотного соединения эпителиальных клеток.
(2) Усиление парацеллюлярной проницаемости полипептида путем взаимодействия с белковыми или липидными компонентами мембраны или экстракции их и посредством этого нарушения мембранной целостности.
(3) Взаимодействие между усилителем и полипептидом, которое повышает растворимость полипептида в водном растворе. Это можно осуществить путем предупреждения образования агрегатов инсулина (димеров, тримеров, гексамеров) или растворением молекул полипептида в мицеллах усилителя.
(4) Снижение вязкости или растворение слизистого барьера, выстилающего альвеолы и проходы легких, в результате чего эпителиальная поверхность становится способной к непосредственной абсорбции полипептида.
Усилители могут функционировать только по одному из изложенных выше механизмов или по двум или более. Усилитель, действующий по нескольким механизмам, более подходит для промотирования эффективной абсорбции полипептида, чем усилитель, который использует только один или два механизма.
Поверхностно-активные вещества являются, например, классом усилителей, которые, как полагают, действуют посредством всех указанных выше механизмов. Поверхностно-активные вещества являются амфифильными молекулами, имеющими как липофильную, так и гидрофильную часть, с изменяющимся балансом между этими двумя характеристиками. Если молекула очень липофильная, низкая растворимость вещества в воде может ограничить его пригодность. Однако, если гидрофильная часть подавляюще доминирует, то поверхностно-активные свойства молекулы могут быть минимальными. Следовательно, чтобы быть эффективным, поверхностно-активное вещество должно обеспечивать подходящий баланс между достаточной растворимостью и достаточной поверхностной активностью.
Другим свойством поверхностно-активного вещества, которое может быть важным, является общий заряд поверхностно-активного вещества при значении pH в легких (приблизительно 7,4). При pH 7,4 некоторые полипептиды имеют отрицательный общий заряд. Это может привести к электростатическому отталкиванию между молекулами, которое, в свою очередь, может предотвращать агрегирование и тем самым повышать растворимость. Если поверхностно-активное вещество также заряжено отрицательно, оно может взаимодействовать с полипептидом, например, путем гидрофобного взаимодействия, и может иметь место дополнительное отталкивание среди полипептидных молекул. В таком случае анионогенное поверхностно-активное вещество будет обладать дополнительным преимуществом (по сравнению с поверхностно-активными веществами, имеющими нейтральный или общий положительный заряд) в усилении абсорбции, способствуя стабилизации полипептида в мономерном состоянии.
Ряд различных соединений, потенциально пригодных в качестве усилителей в способах изобретения, испытывали на крысах, как описано в приведенном ниже примере 2. Другие вещества с известными свойствами по усилению абсорбции или с физическими характеристиками, которые делают их вероятными кандидатами для применения в способе настоящего изобретения, могут легко испытываться специалистом обычной квалификации анализом in vivo или альтернативно анализом in vitro, описанным в примере 1.
Возможно, что комбинация двух или более веществ-усилителей также дает удовлетворительные результаты. Считается, что применение такой комбинации в способе настоящего изобретения находится в пределах изобретения.
Усилитель, пригодный для способов настоящего изобретения, может объединять эффективное усиление абсорбции полипептида с (1) отсутствием токсичности при применяемых концентрациях и (2) хорошими порошковыми свойствами, т. е. отсутствием клейкой или восковидной консистенции в твердом состоянии. Токсичность данного вещества можно проверить стандартными способами, такими как МТТ-испытание, например, как описано в Int. J.Pharm., 65 (1990), 249-259. Порошковые свойства данного вещества можно выяснить из опубликованных данных для этого вещества или эмпирически.
Одним очень перспективным типом усилителя является соль жирной кислоты. Найдено, что натриевая соль насыщенных жирных кислот с углеродной цепью из 10 (т. е. капрат натрия), 12 (лаурат натрия) и 14 (миристат натрия) атомов хорошо пригодна для способа изобретения. Найдено также, что соли калия и лизина каприновой кислоты эффективны в способе настоящего изобретения. Если углеродная цепь состоит из менее чем 10 атомов, поверхностная активность поверхностно-активного вещества может быть слишком низкой и, если углеродная цепь состоит более чем из 14 атомов, пониженная растворимость соли жирной кислоты в воде ограничивает ее пригодность.
Наиболее предпочтительным в настоящем изобретении веществом, которое усиливает абсорбцию полипептида в нижних дыхательных путях, является капрат натрия.
Различные противоионы могут изменять растворимость соли насыщенной жирной кислоты в воде, так что усилитель, углеродная цепь которого содержит не 10-14 атомов, может оказаться даже более предпочтительным, чем усилители, конкретно указанные выше. Соли ненасыщенных жирных кислот можно также применять в настоящем изобретении, поскольку они более растворимы в воде, чем соли насыщенных жирных кислот, и могут иметь более длинную углеродную цепь, чем последние, и в то же время поддерживают растворимость, необходимую для удачного усилителя абсорбции полипептида.
Все из испытанных солей желчных кислот и производных солей желчных кислот (натриевые соли урсодезоксихолата, таурохолата, гликохолата и тауродигидрофузидата) эффективно усиливают абсорбцию полипептида в легких.
В качестве усилителей испытывали также фосфолипиды. Было найдено, что одноцепочечный фосфолипид (лизофосфатидилхолин) является эффективным усилителем, тогда как двухцепочечные фосфолипиды (диоктаноилфосфатидилхолин и дидеканоилфосфатидилхолин) не являются активными усилителями. Это можно объяснить тем фактом, что двухцепочечные фосфолипиды значительно менее растворимы в воде, чем их одноцепочечные аналоги; однако, разумно предположить, что двухцепочечные фосфолипиды с более короткой цепью, имеющие большую растворимость в воде, чем их аналоги с более длинной цепью, можно применять в настоящем изобретении в качестве усилителей, так что можно применять как одноцепочечные, так и двухцепочечные фосфолипиды.
Один гликозид, октилглюкопиранозид, испытывали в настоящем изобретении в качестве усилителя. Было найдено, что он обладает некоторой способностью усиливать абсорбцию. Следует также предположить, что другие алкилгликозиды, например тиоглюкопиранозиды и мальтопиранозиды, обладают способностью усиливать абсорбцию в способах настоящего изобретения.
Циклодекстрины и их производные эффективно усиливают назальную абсорбцию и аналогично могут функционировать в легких. Испытывали диметил-β-циклодекстрин и нашли, что он обладает усиливающим абсорбцию действием.
Другими потенциально пригодными поверхностно-активными веществами являются салицилат натрия, 5-метоксисалицилат натрия и встречающиеся в природе поверхностно-активные вещества, например соли глицирризиновой кислоты, сапонингликозиды и ацилкарнитины.
Для ионных усилителей (например, описанных выше анионогенных поверхностно-активных веществ) может быть важна природа противоиона. Конкретный выбранный противоион может влиять на порошковые свойства, растворимость, стабильность, гигроскопичность и локальную/системную токсичность усилителя или любой готовой препаративной формы, содержащей этот усилитель. Он может также влиять на стабильность и/или растворимость полипептида, с которым его комбинируют. В общем, предполагается, что одновалентные металлические катионы, например, натрия, калия, лития и цезия должны быть пригодны в качестве противоионов для анионогенных усилителей. Аммиак и органические амины образуют другой класс катионов, которые, как ожидается, пригодны для применения с анионогенными усилителями, имеющими остаток карбоновой кислоты. Примеры таких органических аминов включают этаноламин, диэтаноламин, триэтаноланин, 2-амино-2-метилэтиламин, бетаины, этилендиамин, N,N-дибензилэтилентетраамин, аргинин, гексаметилентетраамин, гистидин, N-метилпиперидин, лизин, пиперазин, спермидин, спермин и три(гидроксиметил)аминометан.
Поскольку эффективное усиление абсорбции полипептида в легких наблюдали для ряда испытанных усилителей, предполагается, что можно найти много больше веществ, которые функционируют таким же образом. Микросферы крахмала эффективно усиливают биологическую доступность полипептида, доставленного через носовые оболочки. Их испытывали в качестве усилителя в способах настоящего изобретения. Хотя они оказались мало пригодными для доставки полипептида через легочный путь в животной модели, применяемой в изобретении, считается, что это было в основном обусловлено техническими трудностями, преодоление которых может привести к успешной доставке полипептида через легочный путь.
Хелатообразующие средства являются классом усилителей, которые, как полагают, действуют путем связывания ионов кальция. Поскольку ионы кальция помогают поддерживать расстояние между клетками и дополнительно снижают растворимость полипептидов, связывание этих ионов должно по теории как повышать растворимость полипептидов, так и повышать парацеллюлярную проницаемость полипептидов. Хотя испытывали одно хелатообразующее средство, натриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA), которая, как было найдено, неэффективна в усилении абсорбции инсулина в испытуемой крысиной модели, другие связывающие ионы кальция хелатообразующие агенты могут оказаться более пригодными.
Соотношение полипептида и усилителя
Относительные соотношения полипептида и усилителя можно при желании изменять. Для обеспечения эффективной абсорбции вдыхаемого полипептида должно присутствовать достаточное количество усилителя, однако, количество усилителя следует поддерживать по возможности низким, чтобы минимизировать риск отрицательного действия, вызванного усилителем. Хотя следует испытывать каждую конкретную комбинацию полипептид/усилитель, чтобы определить оптимальные соотношения компонентов комбинации, ожидается, что для достижения приемлемой абсорбции полипептида содержание усилителя должно быть более 10% смеси полипептид/усилитель. Для большинства типов усилителей содержание усилителя должно быть более чем 15% или более чем 20%, предпочтительно между 25% и 50%. Предпочтительное соотношение для каждой комбинации полипептид/усилитель (или полипептид/усилитель/разбавитель) может быть легко определено специалистом обычной квалификации в области фармакологии стандартными методиками, основанными на таких критериях, как эффективная, совместная доставка оптимальной дозы, минимизация побочных действий и приемлемая скорость абсорбции.
Для действия препарата не требуются дополнительные компоненты, но при желании их можно ввести. Например, количество порошка, которое составляет однократную дозу данной комбинации полипептид/поверхностно-активное вещество, можно увеличить (например, для применения в устройстве-ингаляторе, которое по конструкции требует большего объема порошка на дозу) путем разбавления порошка фармацевтически приемлемыми разбавителями. Для облегчения обработки или улучшения порошковых свойств или стабильности препарата в него можно включать другие добавки. Можно добавлять корригент (вкусовое вещество), чтобы количество порошка, которое неизбежно оседает в полости рта и горле, служило бы для получения пациентом указания о том (положительной обратной связи), что доза из устройства-ингалятора доставлена. Любая такая добавка должна обладать следующими свойствами: (a) она стабильна и не оказывает неблагоприятного действия на стабильность полипептида и усилителя, (b) она не препятствует абсорбции полипептида, (c) она имеет хорошие порошковые свойства, как этот термин понимается в фармации, (d) она не гигроскопична и (e) она при применяемых концентрациях не обладает отрицательным действием в дыхательных путях. Пригодные типы таких добавок включают моно-, ди- и полисахариды, спирты ряда сахаров и другие полиолы, например лактозу, глюкозу, рафинозу, мелезитозу, лактит, мальтит, трегалозу, сахарозу, маннит и крахмал. Так как восстанавливающие сахара, например лактоза и глюкоза, имеют тенденцию образовывать комплексы с белками, невосстанавливающие сахара, например рафиноза, мелезитоза, лактит, мальтит, трегалоза, сахароза, маннит и крахмал, могут быть предпочтительными добавками для применения в настоящем изобретении. Такие добавки во всех случаях могут составлять от 0% (т.е. без добавки) до почти 100% от всего препарата.
В предпочтительном варианте изобретение предлагает терапевтический препарат фармацевтически активного полипептида и вещества, которое усиливает абсорбцию этого полипептида в нижних дыхательных путях. Этот препарат имеет форму сухого порошка, пригодного для ингаляции. По меньшей мере 50 мас.% этого порошка состоит из (a) частиц, имеющих диаметр менее чем около 10 микрон, или (b) агломератов этих частиц. В другом предпочтительном варианте изобретение предлагает терапевтический препарат, содержащий фармацевтически активный полипептид, вещество, которое усиливает абсорбцию полипептида в нижних дыхательных путях, и фармацевтически применяемый носитель. Препарат имеет форму сухого порошка, пригодного для ингаляции. По меньшей мере 50 мас. % этого порошка состоит из (a) частиц, имеющих диаметр менее чем около 10 микрон, или (b) агломератов этих частиц. В следующем предпочтительном варианте изобретение предлагает терапевтический препарат, содержащий активные соединения: (A) фармацевтически активный полипептид и (B) вещество, которое усиливает абсорбцию этого полипептида в нижних дыхательных путях, причем по меньшей мере 50% общей массы активных соединений (A) и (B) состоит из частиц, имеющих диаметр менее чем около 10 микрон, и фармацевтически приемлемый носитель. Препарат имеет форму сухого порошка, пригодного для ингаляции. Упорядоченную смесь можно получить из активных соединений и фармацевтически приемлемого носителя
Описанный порошкообразный препарат можно изготовить несколькими путями, применяя обычные методики. Во многих случаях очищенный полипептид можно получить из коммерческих источников. И наоборот, интересующий полипептид можно очистить из природного источника с применением стандартных биохимических методик или можно получить экспрессией прокариотических или эукариотических клеток, генетически сконструированных таким образом, чтобы они содержали нуклеотидную последовательность, которая кодирует данный полипептид и имеет соединенные с ней подходящие последовательности контроля экспрессии (в том числе трансгенного животного, способного к экспрессии желаемого пептида или белка, например, в его молоке). Такие способы стандартны в данной области (смотри, например, Sambrook et. al., Molekular Cloning: A Laboratory Manual: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Пептиды (т. е. полипептиды, имеющие 30 или менее аминокислотных остатков) можно легко синтезировать известными химическими способами.
Усилители абсорбции, описанные выше, также обычно доступны из коммерческих источников или их можно получить при помощи опубликованных методик. В случае ионогенных усилителей противоион, ассоциированный с усилителем, можно заменить при желании на другой, применяя стандартные методики ионообмена.
При получении описанного порошкообразного препарата порошок обычно необходимо в некоторой стадии способа тонко измельчить в подходящей мельнице, например струйной мельнице, чтобы получить первоначальные частицы с пределом размера частиц, подходящим для максимального отложения в нижнем дыхательном пути (т.е. менее 10 мкм). Например, можно провести сухое смешивание порошков полипептида и усилителя и затем вещества тонко измельчить вместе. Альтернативно вещества можно тонко измельчить по отдельности и затем смешать. Когда смешиваемые соединения имеют различные физические свойства, например твердость и хрупкость, устойчивость к тонкому измельчению их различается и для их измельчения в частицы пригодного размера могут требоваться различные давления. Следовательно, когда вещества тонко измельчают вместе, размер полученных частиц одного из компонентов может быть неудовлетворительным. В таком случае может быть выгодно различные компоненты тонко измельчить по отдельности и затем смешать их.
Можно также сначала растворить компоненты в подходящем растворителе, например воде, чтобы получить смешивание на молекулярном уровне. Эта методика позволяет также устанавливать требуемое значение pH, например, для улучшения абсорбции полипептида. Нужно принимать во внимание фармацевтически приемлемые пределы pH от 3,0 до 8,5 для ингаляционных продуктов, поскольку продукты с pH вне этих пределов могут индуцировать раздражение и сужение дыхательных путей. Для получения порошка растворитель следует удалить способом, который позволяет сохранить биологическую активность полипептида. Пригодные методы сушки включают вакуумное концентрирование, открытую сушку, распылительную сушку и сушку вымораживанием. Обычно следует избегать температур выше 40oC в течение более чем нескольких минут, поскольку может иметь место некоторое разрушение некоторых полипептидов. После стадии сушки твердый материал можно, если необходимо, измельчить для получения крупного порошка и затем, если необходимо, тонко измельчить.
При желании тонко измельченный порошок можно обработать для улучшения реологических свойств, например, сухим гранулированием для образования сферических агломератов с лучшими эксплуатационными характеристиками до введения его в предназначенное для него устройство-ингалятор. В таком случае устройство должно иметь форму, обеспечивающую значительное дезагломерирование агломератов до выхода порошка из устройства, так что частицы, входящие в дыхательные пути пациента, в основном имеют размер, находящийся в пределах желаемого размера. В тех случаях, когда нужно получить упорядоченную смесь, активное соединение можно обработать, например, тонким измельчением для получения, если нужно, частиц с размером, находящимся в пределах конкретного размера частиц. Носитель также можно обработать, например, для получения частиц желаемого размера и желаемых поверхностных свойств, например конкретного отношения поверхности к массе, или достижения определенной прочности и обеспечения оптимальной силы адгезии в упорядоченной смеси. Такие физические требования для упорядоченной смеси хорошо известны, так же как и различные способы получения упорядоченной смеси, удовлетворяющей эти требования, их может легко определить специалист данной области в соответствии с конкретными деталями.
Предпочтительное ингаляционное устройство должно иметь конструкционные характеристики, защищающие порошок от увлажнения и не допускающие риска случайных больших доз. Кроме того, желательно, чтобы устройство по возможности удовлетворяло как можно больше из следующих условий: защищало порошок от света; обеспечивало легко вдыхаемую фракцию и значительное отложение в легких при широком интервале объемной скорости потока, низкую девиацию дозы и вдыхаемой фракции, низкую ретенцию порошка в наконечнике - это особенно важно для многодозового ингалятора, где полипептид, сохраняющийся в наконечнике, может разрушаться и затем вдыхаться вместе с последующими дозами, низкую адсорбцию у поверхности ингалятора, гибкость в размере доз и низкую ингаляционную устойчивость. Предпочтителен ингалятор с однократной дозой, хотя можно также применять ингалятор с многократной дозой, например, приводимый в действие вдыханием ингалятор многоразового пользования, содержащий многократную дозу сухого порошка. Предпочтителен приводимый в действие вдыханием ингалятор одноразового пользования, содержащий однократную дозу сухого порошка.
Был получен и испытан в анализах in vivo описанный ниже ряд сухих порошкообразных готовых форм, содержащих полипептид и различные усилители. Описан также анализ in vitro, пригодный для испытания комбинаций полипептид/усилитель.
Пример 1: Способ определения in vivo пригодности конкретных полипептидов для настоящего изобретения
Стандартный анализ in vivo с применением эпителиальной клеточной линии CaCо-2 (доступна через American Type Culture Collection (ATCC), Bockville, MD, USA) разрабатывали для определения способности различных соединений-усилителей промотировать перенос маркеров через монослой эпителиальных клеток как модели эпителиального клеточного слоя, который функционирует в легких для отделения альвеол от легочного кровоснабжения.
В этом анализе усилитель и полипептид или другой маркер растворяют в водном растворе при различных отношениях и/или концентрациях и контактируют с апикальной стороной клеточного монослоя. После инкубирования в течение 60 мин при 37oC и 95% RH (относительная влажность) определяли, например, с применением маркера, меченого радиоактивным изотопом, количество маркера на базолатеральной стороне клеток.
Для испытываемого усилителя, капрата натрия, количество маркера (маннит, молекулярная масса 360), которое появляется на базолатеральной стороне, зависит от концентрации применяемого усилителя, которая составляет по крайней мере вплоть до 16 мМ капрата натрия (фиг. 1). Это справедливо, даже если в смесь усилитель/маннит добавляют полипептид инсулин (массовое соотношение капрата натрия и инсулина 1:3) (фиг. 2). Найдено также, что эта концентрация капрата натрия (16 мМ) промотирует абсорбцию через клеточный монослой двух низкомолекулярных пептидов, инсулина (MW 5734) и вазопрессина (MW1208). Количество инсулина, которое прошло через монослой, в присутствии 16 мМ капрата натрия удваивалось по сравнению с количеством его в отсутствии любого усилителя, количество вазопрессина, которое абсорбировалось через монослой, повышалось в 10-15 раз по сравнению с количеством в отсутствии любого усилителя.
Наоборот, никакого повышения в скорости переноса не наблюдали для более высокомолекулярных белков, например цитохрома C (MW12300), карбоновой ангидразы (MW30000) и альбумина (MW69000) в анализах с применением до 16 мМ капрата натрия. Ожидается, что при более высоких концентрациях капрата натрия проницаемость клеток должна повышаться, что позволит осуществить перенос более высокомолекулярных полипептидов; однако, возможная цитотоксичность капрата натрия может препятствовать применению значительно более высоких концентраций этого усилителя.
Другие усилители могут позволять перенос более высокомолекулярных полипептидов; их также можно испытывать в этой (in vivo) модели эпителиальной клеточной проницаемости, которую можно применять в качестве средства для скрининга с целью быстрого испытания любой желаемой комбинации полипептид/усилитель, чтобы определить пригодность ее в способах настоящего изобретения.
Пример 2: Способ отбора усилителей, пригодных для настоящего изобретения.
Каждое из соединений, указанных в таблице, испытывали на его способность усиливать поглощение полипептида (инсулина) в крысиной модели. Результаты по инсулину взяты в качестве критерия потенциала усилителя в усилении абсорбции других полипептидов.
В различных испытаниях применяли различные формы инсулина: рекомбинантный человеческий, полусинтетический человеческий или бычий. Каждую готовую форму приготовляли, как указано выше, сушкой и обработкой раствора инсулин/усилитель или инсулин/усилитель/лактоза для получения вдыхаемого порошка. Порошок вводили крысам ингаляцией и содержание глюкозы в крови крыс затем контролировали для измерения поглощения инсулина. Эти величины сравнивали с соответствующими величинами, полученными у крыс, которые вдыхали готовые формы инсулина без усилителя.
Ту же самую модельную систему in vivo можно применять для испытания любого данного пептида или белка на пригодность в способах изобретения путем доставки тем же способом ингаляции готовой формы, содержащей желаемый пептид или белок в комбинации с усилителем, и количественного определения концентрации желаемого пептида или белка в большом круге кровообращения испытываемого животного (например, стандартными иммунологическими или биохимическими анализами, подходящими для данного пептида или белка).
Пример 3: Терапевтический препарат в соответствии с изобретением.
Гормон роста человека (hGH, MW 22 кДа, источник Humatrope из Lilly, 3 части) смешивали с капратом натрия (1 часть). Смесь измельчали в механической мельнице Retsch до получения частиц со средним диаметром 6,7 мкм.
Полученный порошок вводили крысам внутритрахеально и поглощение hGH сравнивали с поглощением порошка, MMD 9,6 мкм, содержащего hGH и маннит в тех же соотношениях и полученного таким же образом, как указано выше.
Результаты указали на улучшение поглощения hGH в готовой форме, включающей капрат натрия, по сравнению с поглощением в случае готовой формы без усилителя.
Пример 4. Препарат, содержащий полипептид инсулин
Инсулин здесь применяли в качестве критерия для других пептидов в соответствии с настоящим изобретением.
Биосинтетический человеческий инсулин (53 г) подвергали тонкому измельчению в струйной мельнице Airfilco (товарный знак, Airfilco Process Plant Limited) со сжатым азотом (давление загрузки 7•105 Па, давление в камере 5•105 Па) до получения частиц со средним размером 2,4 мкм.
Капрат натрия (170 г) подвергали тонкому измельчению в струйной мельнице Airfilco (TM) со сжатым азотом (давление загрузки 5•105 Па, давление в камере 3•105 Па) для получения частиц со средним диаметром 1,6 мкм.
Тонко измельченный биосинтетический инсулин (45 г) и капрат натрия (14,26 г) смешивали в сухом состоянии в соответствии со следующей методикой: половину инсулина добавляли в смешивающее устройство, содержащее цилиндр для смешивания объемом 4,4 л, разделенный ситом с отверстием 1 мм на два отделения, с металлическим кольцом в каждом отделении, помогающим смешиванию и перемешиванию. Добавляли капрат натрия и в заключении оставшееся количество инсулина. Цилиндр для смешивания закрывали, поворачивали на 180 градусов и устанавливали в моторизованный аппарат для встряхивания. Мотор включали и встряхивание продолжали приблизительно в течение двух минут, пока весь порошок не проходил через сито. Мотор выключали и цилиндр для смешивания поворачивали на 180 градусов, снова устанавливали в аппарат для встряхивания и встряхивали снова до тех пор, пока весь порошок не прошел через сито. Эту процедуру повторяли еще восемь раз при общем времени перемешивания приблизительно 20 минут.
Полученный таким образом препарат вводили 5 собакам ингаляцией при дозе 1 Е/кг. Уровень инсулина в плазме крови определяли в разные моменты времени после введения препарата.
Полученные результаты сравнивали с результатами уровня инсулина в плазме, полученными, когда биосинтетический инсулин, тонко измельченный, как указано выше, для получения частиц со средним диаметром 2,4 микрон вводили пяти собакам таким же образом и в таких же дозах и с результатами уровня инсулина, полученными, когда терапевтический препарат инсулина и капрата натрия в соотношении 90:10 вводили пять собакам таким же образом и в таких же дозах, как указано выше. В этом случае терапевтический препарат получали следующим образом. Человеческий полусинтетический инсулин гель-фильтровали для снижения содержания цинка от 0,52% до 0,01% относительно содержания инсулина. Инсулин (4,5 г) и капрат натрия (0,5 г) растворяли в воде (232 мл). Раствор перемешивали до осветления (прозрачности) и pH устанавливали 7,0. Раствор концентрировали выпариванием при 37oC в течение периода около двух дней. Полученную твердую лепешку размалывали и просеивали через сито с размером отверстий 0,5 мм и образованный порошок тонко измельчали в струйной мельнице в частицы со средним диаметром 3,1 мкм.
Результаты этих сравнений представлены на фиг. 3. (p = 0,0147 для соотношений от 75:25 до 100:0). Результаты демонстрируют некоторое улучшение в биологической доступности инсулина в случае готовой формы с соотношением 90: 10 и драматическое улучшение в биологической доступности инсулина в случае препарата с соотношением 75:25, включающего капрат натрия, по сравнению с введением только инсулина.
Композиция содержит фармацевтически активный полипептид в смеси с соединением-усилителем. Соединение-усилитель увеличивает абсорбцию полипептида в нижних дыхательных путях больного. Усилитель является поверхностно-активным веществом. Его количество составляет более 10% от общей массы полипептида и соединения-усилителя. Смесь представляет собой сухой порошок. По меньшей мере 50% общей массы порошка состоит из частиц с диаметром, меньшим или равным 10 микронам, или агломератов этих частиц. Композиция вводится путем ингаляции, обеспечивает системную доставку в легкие лекарственных пептидов и белков и улучшенное поглощение указанных лекарственных соединений. 5 с. и 26 з. п. ф-лы, 3 ил., 1 табл.
| Огнетушитель | 0 |
|
SU91A1 |
| Шланговое соединение | 0 |
|
SU88A1 |
| МАШКОВСКИЙ М.Д | |||
| ЛЕКАРСТВЕННЫЕ СРЕДСТВА | |||
| - М.: МЕДИЦИНА, 1986, ч.1, с.33 - 35. | |||
