СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА НАТУРАЛЬНЫХ ПОЛОВЫХ ФЕРОМОНОВ САМЦОВ Российский патент 2000 года по МПК A61D19/02 A61K35/48 

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к получению биологических препаратов для стимуляции репродуктивной функции у самок животных.

Известен способ получения препарата натуральных половых феромонов из мочи быков (Авт. св. СССР N 1666102, кл. А 61 D 19/02, 1991, авт. В.П. Кононов и др.), однако он сложный, требует дорогостоящего оборудования, химреактивов и квалифицированного обеспечения. Известен также способ получения препарата натуральных половых феромонов хряка, включающий смесь мочи и эякулята (Schremmer H. , Framz W., et al Industriemossige Schweineproduktion VEB Deutscher Landwirtschafts verlag. Berlin, 1975. - S. 85-87). В этом препарате содержится много балластных веществ, что уменьшает его биологическую активность и срок хранения, а отсутствие процесса обеззараживания при изготовлении препарата не исключает возможности распространения болезней в случае заболевания хряков, от которых получают мочу и эякулят.

Наиболее близким техническим решением, выбранным в качестве прототипа, является способ получения натуральных половых феромонов из тканей и экскретов хряка (Патент N 203421, МПК А 61 D 19/02 "Способ получения препарата натуральных половых феромонов хряка", авт. Сеин О.Б. и др.), заключающийся в механическом измельчении семенников и подчелюстных слюнных желез до фаршеобразной массы, которую смешивают с мочой и гомогенизируют. Для увеличения деструкции клеточной ткани в гомогенизат вносят йодид калия, полученную смесь инкубируют, смешивают с трихлоруксусной кислотой и центрифугируют до разделения смеси на две фракции. Надосадочную жидкость подвергают перегонке с водяным паром и таким образом получают препарат, который представляет способ прозрачную жидкость со специфическим запахом. Недостатками данного способа являются длительность процесса получения препарата и низкий выход конечного продукта.

Целью изобретения является увеличение выхода препарата с высокой биологической активностью.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве исходного сырья используют семенники и мочу, которые получают от половозрелых самцов (хряков, быков, жеребцов) в условиях мясокомбината. Семенники очищают от соединительной ткани, измельчают на мясорубке и гомогенизируют в гомогенизаторе до однородной массы. С целью увеличения деструкции клеточной ткани и выхода феромонов в раствор, в гомогенизат вносят фермент протосубтилин ГЗХ ГОСТ 23636-79 в количестве 1-1,5% от общей массы исходного сырья. Полученную смесь инкубируют в водяной бане при температуре 37-39^oC в течение 50-60 мин, центрифугируют до разделения на две фракции. Надосадочную жидкость смешивают с мочой в соотношении 1:2-2,5 и перегоняют с водяным паром.

Оптимальное соотношение указанных компонентов подбирали с использованием математического планирования эксперимента методом крутого восхождения. При увеличении количества мочи происходит снижение концентрации препарата на 7-9%, а при уменьшении мочи получают на 45-48% меньше препарата, чем при оптимальном соотношении компонентов.

Оптимальный режим инкубации (температура 37-39^oC, продолжительность 50-60 мин) подбирался опытным путем. При температуре ниже 37^oC и выше 39^oC происходит снижение активности фермента, процесс гидролиза проходит недостаточно полно, что приводит к уменьшению выхода препарата. При инкубации менее 40 мин также снижается выход конечного продукта на 10-12%, что связано с неполным завершением реакции. Увеличение времени инкубации более 60 мин проводить нецелесообразно, так как процесс гидролиза к этому времени заканчивается полностью и выход феромонов в раствор прекращается.

После центрифугирования смеси надосадочную жидкость сливают и подвергают перегонке с водяным паром. Полученный конденсат является препаратом, который представляет собой прозрачную жидкость, без оттенков, с пиком поглощения в ультрафиолетовой зоне спектра (λ = 323 нм), со специфическим запахом, стерильную и нетоксичную.

Сопоставительный анализ с прототипом показывает, что для увеличения деструкции клеточной ткани семенников используется фермент протосубтилин ГЗХ ГОСТ 23636-79, который вызывает лизис клеточных мембран и способствует более активному переходу феромонов в раствор.

Таким образом, предлагаемый способ соответствует критерию "новизна". При изучении других известных технических решений в данной области признаки, отличающие предлагаемое изобретение от прототипа, не были выявлены и поэтому они обеспечивают предлагаемому техническому решению соответствие критерию "существенные отличия".

Пример. 500 г семенников, полученных от половозрелых хряков и очищенных от соединительной и жировой ткани, измельчали до фаршеобразного состояния. В полученную массу вносили 50 г фермента протосубтилина и инкубировали в водяной бане при температуре 37-39^oC в течение 50-60 мин. Затем смесь центрифугировали при 6000 об/мин в течение 15-20 мин до разделения смеси на две фракции. Надосадочную жидкость смешивали с 2000 мл мочи хряка и перегоняли с водяным паром. Полученный препарат представлял собой прозрачную жидкость без оттенков со специфическим запахом. Выход препарата с оптимальной активностью составлял 550 мл. Препарат расфасовывали в стеклянные флаконы, обкатывали алюминиевыми колпачками с резиновыми пробками и хранили до использования при 5^oC. Срок хранения 12 мес.

Аналогичным образом получали препараты натуральных половых феромонов из тканей и экскретов быка и жеребца.

Проверка опытных серий препарата на стерильность и токсичность подтвердила его безвредность.

Активность препарата натуральных половых феромонов хряка определяли с использованием биологического теста и специального ольфактометра. При этом изготовленный препарат сравнивали с прототипом и синтетическим половым феромоном хряка СтО - 1, изготовленного в Институте проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова.

Активность препаратов половых феромонов быка и жеребца определяли с применением поведенческого биологического теста (по проявлению "флемен-рефлекса"), разработанного академиком В.Е.Соколовым (Химическая коммуникация животных. М. : Наука, 1986). Результаты исследований показали, что у свиноматок, включенных в биологический тест, процент ключевых (положительных) ответов на опытный препарат был выше (92%), чем на препарат-прототип (80%) и препарат СтО - 1 (78%).

Высокой биологической активностью обладали также опытные препараты половых феромонов быка.

Производственные испытания изготовленных препаратов натуральных половых феромонов проводили в хозяйствах Курской области.

В первом опыте использовали препарат натуральных феромонов для стимуляции у свиней полового созревания. Для этого было сформировано три группы неполовозрелых ремонтных свинок-аналогов крупной белой породы по 20 голов в каждой. Свинок 1-й группы обрабатывали опытным препаратом, свинок 2-й группы обрабатывали препаратом - прототипом, животные 3-й группы были контрольными и их обрабатывали дистиллированной водой. Использовали феромоны через день, методом распыления на уровне головы животных с помощью пульверизатора. Доза препаратов составляла 0,5 мл/гол. Стимуляцию проводили с 6-месячного возраста свинок и до наступления полового созревания (проявления первой половой охоты). Охоту определяли с использованием хряка-пробника.

На 7-е сутки после выявления первой половой охоты проводили контрольный убой 5 свинок из каждой группы. После убоя животных извлекали половые органы, определяли их массу, линейные параметры, площадь рогов матки методом проекции на миллиметровую бумагу, устанавливали объем яичников путем погружения их в измерительный сосуд с водой, определяли размеры фолликулов с использованием штангенциркуля.

Результаты исследований показали, что у большинства свинок, обработанных половыми феромонами, половое созревание наступало в первые 10 суток после начала стимуляции (табл. 1), а у контрольных животных оно значительно задерживалось, и за 30-суточный период наблюдений было выявлено только у 8 свинок. При этом в 1-й группе число половозрелых животных было несколько больше (17), чем во 2-й группе (14). В свою очередь было установлено, что стимуляция ремонтных свинок, натуральными половыми феромонами положительно воздействует на рост и развитие их репродуктивных органов (табл. 2). Во втором опыте проводили производственную апробацию препарата натуральных половых феромонов быка. С этой целью было отобрано три группы коров-аналогов симментальской породы по 30 голов в каждой. Коров 1-й группы обрабатывали опытным препаратом. Животных 2-й группы обрабатывали препаратом-прототипом. Коровы 3-й группы были контрольными, их стимуляции не подвергали. Обработку коров проводили ежедневно, начиная с третьего дня после отела и до проявления половой охоты. Доза препаратов составляла 0,5 мл/гол, применяли их путем распыления на носовое зеркало животных.

Было установлено, что у коров, подвергавшихся стимуляции изготовленным препаратом, раньше наступала половая охота (табл. 3), а после их осеменения было больше стельных животных, чем при обработке препаратом-прототипом и в контроле.

В третьем опыте опытный препарат натуральных половых феромонов быка применяли для стимуляции полового процесса у 48 коров, 40 телок с гипофункцией яичников.

О пониженной функциональной активности яичников судили по результатам вагинальных и ректальных исследований, а также по данным морфологического и биохимического анализа крови.

Отобранных животных с гипофункцией яичников разделили на равные группы - опытные и контрольные. Опытные коровы и телки обрабатывались половыми феромонами, а контрольные - стимуляции не подвергались. После проявления у животных половой охоты их искусственно осеменяли.

Результаты исследований показали (табл. 4), что в начале опыта у животных всех групп матка, как правило, имела уменьшенные размеры, слабо выраженную ригидность, рога ее были истонченные и смещены в каудальную часть таза. Яичники имели величину от фасолины до баба, твердые на ощупь, плоские, поверхность их гладкая. При пальпации яичников фолликулы и желтые тела не обнаруживались. Слизистая оболочка влагалища и шейки матки была бледного цвета и скудно увлажнена. Гипофункция яичников сопровождалась отсутствием половых циклов.

При повторном исследовании, через 15-17 суток после начала стимуляции, у коров и телок опытных групп в яичниках пальпировались фолликулы различной величины, матка приобретала упругую консистенцию, контрактильность ее была выражена лучше, топография и размеры матки соответствовали норме, слизистая влагалища и шейки матки имела бледно-розовый цвет.

В свою очередь было установлено, что у коров и телок, подвергавшихся биологической стимуляции половыми феромонами, были достоверно выше показатели воспроизводительности по сравнению с контрольными животными.

В четвертом опыте использовали препарат натуральных половых феромонов жеребца для стимуляции половой охоты у кобыл. Стимуляции было подвергнуто 11 кобыл. Обработку животных проводили, начиная со 2-го дня после родов и до проявления у них половой охоты. Препарат распыляли один раз в день, по 0,5 мл/гол. У трех кобыл до стимуляции, а также во время стимуляции и после нее проводили регистрацию сократительной функции матки с использованием баллонной гистерографии.

Контролем служили 7 кобыл-аналогов, которых вместо феромонов обрабатывали дистиллированной водой.

Проведенные исследования показали, что у кобыл, подвергавшихся стимуляции препаратом натуральных феромонов жеребца, на 4-7 дней раньше наступала половая охота. При этом установлено, что уже через 30 мин после начала стимуляции феромонами у большинства кобыл усиливалась моторика матки: повышалась амплитуда, частота и продолжительность сокращений. Через 60 мин эти показали увеличивались на 40, 22 и 38% по сравнению с показателями, которые регистрировались до начала стимуляции. Затем сократительная функция матки у кобыл ослабевала и через 2-3 часа возвращалась к исходным величинам.

В свою очередь у кобыл, подвергавшихся стимуляции половыми феромонами жеребца, регистрировался более высокий уровень оплодотворяемости.

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к получению биологических препаратов для стимуляции репродуктивных функций у самок животных. Способ включает измельчение семенников, их гомогенизацию, инкубирование, центрифугирование, смешивание с мочой и перегон с водяным паром. В гомогенизат вносят в количестве 1 - 1,5% от общей массы фермент протосубтилин. После чего смесь инкубируют в течение 50 - 60 мин при 37 - 39°С и смешивают с мочой самца в соотношении 1:2-2,5. Способ позволяет увеличить выход препарата с высокой биологической активностью. 4 табл.

Способ получения препарата натуральных половых феромонов самцов, включающий измельчение семенников, их гомогенизацию, инкубирование, центрифугирование, смешивание с мочой и перегон с водяным паром, отличающийся тем, что в гомогенизат семенников вносят 1 - 1,5% от общей массы фермент протосубтилин, инкубируют смесь в течение 50 - 60 мин при 37 - 39^oС, и смешивают с мочой в соотношении 1 : 2 - 2,5.