СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОТЕНЦИАЛЬНОЙ СОЛЕНОСТНОЙ ТОЛЕРАНТНОСТИ ВОДНЫХ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ Российский патент 2001 года по МПК A01K61/00 

Изобретение относится к гидробиологии и может быть использовано в экологии, рыбоводстве, океанографии, в системе биомониторинга при определении границ жизнеспособности водных организмов, а также в области аквакультуры.

Известен способ определения потенциальной жизнеспособности культуры микроорганизмов путем дифференциального окрашивания клеток, которые перед окрашиванием подвергают последовательному воздействию ряда неспецифических токсических факторов (1).

Известен также способ определения жизнеспособности фитопланктона, при котором опытный и контрольный образцы после патогенного воздействия выдерживают в темноте в течение 5-15 мин, затем освещают прерывистым светом с длиной волны 600-670 нм и измеряют интенсивность фотохемилюминесценции. Критерием жизнеспособности клеток фитопланктона служит количество импульсов фотосинтетического послесвечения (2).

Данные способы не могут быть использованы для определения потенциальной солеустойчивости и не могут применяться по отношению к водным беспозвоночным.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является метод ступенчатой акклимации, описанный В.В.Хлебовичем (3). Метод ступенчатой акклимации В.В. Хлебовича заключается в следующем. У акклимированных к условиям лаборатории организмов определяют исходный диапазон толерантности на основе одного из удобных показателей физиологической активности. Таким показателем может быть интенсивность дыхания, скорость фильтрации, доля выживших или активных особей в воде различной солености. Далее проводится серия последовательных полностью завершенных акклимаций каждый раз к ранее достигнутым крайним значениям толерантного диапазона. Продолжительность акклимации на каждой ступени составляет около двух недель. Эксперимент проводится до тех пор, пока толерантность не перестанет меняться под воздействием акклимации. Потенциальная соленостная толерантность определяется как диапазон соленостей, заключенный между двумя значениями (верхним и нижним), достигнутыми в результате ступенчатой акклимации.

Метод В.В.Хлебовича имеет существенный недостаток: он требует постановки длительного эксперимента продолжительностью несколько месяцев. Это обстоятельство является неудобным для практической работы и не позволяет оценивать потенциальную толерантность ранних стадий жизненного цикла (в силу непродолжительности существования последних).

В основу предлагаемого изобретения положена задача ускорения и облегчения определения потенциальной соленостной толерантности.

Поставленная задача достигается путем проведения не многоступенчатой (как в методе В.В.Хлебовича), а одноступенчатой акклимации подопытных организмов к различным соленостям в пределах диапазона толерантности с последующим анализом различий толерантных диапазонов у животных, акклимированных к различной солености.

Сущность предлагаемого способа определения потенциальной соленостной толерантности водных беспозвоночных заключается в проведении акклимации подопытных организмов к различной солености, определении характера изменения границ толерантного диапазона в зависимости от солености акклимации и последующем нахождении границ потенциальной толерантности. Для оценки диапазонов толерантности до и после акклимации в данном случае предлагается использовать величины медианной летальной концентрации (солености).

При определении потенциальной соленостной толерантности водных беспозвоночных методом ступенчатой акклимации В.В.Хлебовича производится серия последовательных полностью завершенных акклимаций к ступенчато изменяемой солености. Продолжительность акклимации на каждой ступени составляет около 2 недель, при этом эксперимент проводится до тех пор, пока соленостная толерантность не перестанет меняться под воздействием предыдущей акклимации. В предлагаемом способе проводят одноступенчатую акклимацию, что значительно сокращает время и облегчает процесс определения потенциальной соленостной толерантности водных беспозвоночных. После завершения одноактной акклимации находят границы новых толерантных диапазонов, рассчитывают линии линейной регрессии, отражающие изменения границ толерантных диапазонов при изменении солености акклимации, и, отложив на графике полученные зависимости, на пересечении их с линией изоосмотичности получают границы потенциального толерантного диапазона.

На фиг. 1 показано изменение соленостной толерантности брюхоногих моллюсков гидробий из Губы Сельдяной Белого моря в ходе ступенчатой акклимации.

На фиг. 2 представлена предлагаемая схема определения потенциального толерантного диапазона. Схема содержит: 1 - верхние границы толерантных диапазонов, 2 - нижние границы толерантных диапазонов, 3 - линия изоосмотичности (y = x), 4 - рассчитанные линии регрессии, A и B - верхняя и нижняя границы потенциального толерантного диапазона.

По оси абсцисс (фиг. 1, 2) отложена соленость акклимации, по оси ординат - толерантный диапазон.

Определение потенциальной соленостной толерантности водных беспозвоночных осуществляют следующим образом. Совокупность подопытных животных, потенциальную толерантность которых требуется определить, подразделяют случайным образом на группы (5-10) по 100-200 экземпляров и помещают для акклимации в емкости с водой различной солености. Диапазон (разброс) солености в емкостях акклимации подбирают на основании данных по экологии этих организмов таким образом, чтобы он в максимальной степени охватывал их исходный диапазон толерантности. При отсутствии таких данных перед акклимацией необходимо провести определение исходной толерантности подопытных животных одним из известных способов. Максимальная продолжительность акклимации при температуре 15-20^oC не ограничена, минимальная составляет 2 недели. Условия содержания подопытных беспозвоночных (режим освещенности, содержание кислорода и т.д.) должны быть сходными с теми, в которых данные беспозвоночные встречаются в природе. После завершения периода акклимации (т.е. не менее чем через две недели) проводят определение новых диапазонов толерантности подопытных животных. Для этого совокупность организмов, акклимированных к определенной солености, подразделяют на группы и переносят в емкости с тестовыми соленостями. Время тестирования выбирают произвольно, но оно должно быть достаточно продолжительным (не менее суток) и одинаковым для всех групп акклимированных животных. По окончании тестирования определяют количество погибших особей в каждой тестовой солености и рассчитывают медианную летальную концентрацию (LC(50)). Данную величину принимают за границу толерантного диапазона. Указанную последовательность действий проводят с беспозвоночными из каждой группы, акклимированной к определенной солености.

Далее определяют характер изменения границ толерантного диапазона в зависимости от солености акклимации. Для этого откладывают на графике полученные значения LC(50) для каждой группы акклимированных беспозвоночных напротив соответствующей солености акклимации и проводят прямые линии через отмеченные точки. Такую линию не всегда возможно провести "на глаз", так как в зависимости от точности соблюдения условий в эксперименте или точности расчета значений LC(50), полученные точки могут в той или иной степени отклоняться от прямой. В таком случае требуемую зависимость рассчитывают, используя метод наименьших квадратов. После того как требуемая линия рассчитана, ее наносят на вышеуказанный график. Одновременно на том же графике проводят линию "y = x", соответствующую условиям, когда соленость акклимации и границы диапазона толерантности совпадают. Точки пересечения прямых (одна из которых описывает изменение границ толерантного диапазона в зависимости от солености акклимации, а вторая является линией "y = x") будут соответствовать границам потенциального толерантного диапазона.

Осуществление предлагаемого способа по полной схеме (акклимация к лабораторным условиям, 2 недели соленостной акклимации и последующее определение толерантности) потребует для своего завершения от 1 до 1,5 месяцев. В случае же применения адаптогенов в ходе акклимации (что позволило бы сократить ее срок) или использования уже акклимированных к разным соленостям организмов, (например, из естественного градиента солености) для осуществления способа потребуется еще меньший период времени.

Пример. Для определения нижней границы диапазона потенциальной толерантности бокоплавов Pontoporeia affinis, животных, собранных в море при солености воды 6.2 г/л, помещали для акклимации по 200 штук в 20-литровые пластиковые аквариумы с соленостями: 1.3; 1.9; 2.6; 4.1; 6.0; 8.9; 13.6; 20,4 г/л. После 2 недель акклимации определяли их устойчивость к пониженной солености. Для этого беспозвоночных рассаживали по 10 экземпляров в 1-литровые стаканы с водой пониженной солености и определяли их смертность через 2 суток. По полученным данным рассчитывали величины LC(50), которые составили:
Соленость акклимации - LC(50)
20.4 - 4.2
13.6 - 2.9
8.9 - 2.1
6.0 - 1.65
4.1 - 1.55
2.6 - 1.2
1.9 - 0.95
1.3 - 0.97
Линия регрессии, описывающая изменение значения LC(50) в зависимости от солености акклимации и рассчитанная по вышеприведенным данным, имела вид: Y = 0.168X + 0.701, где Y - LC(50), а X - соленость акклимации. Она пересекала линию "y = x" в точке с соленостью 0.8 г/л, которая и являлась нижней границей потенциального толерантного диапазона исследованных ракообразных.

Литература.

1. А.С. СССР N 203376.

2. А.С. СССР N 547199.

3. Хлебович В.В., Кондратенков А.П. "Потенциальная эвригалинность беломорского моллюска Hydrobia ulvae // Моллюски. Пути, методы и итоги их изучения Л.: Наука, 1971. С. 37-38).

Изобретение может быть использовано в экологии, рыбоводстве, океанографии, в системе биомониторинга при определении границ жизнеспособности водных организмов, а также в области аквакультуры. Проводят одноступенчатую акклимацию подопытных организмов к различной солености, определяют характер зависимости границ толерантного диапазона от солености акклимации и находят путем экстраполяции границы потенциальной толерантности. После завершения одноактной акклимации находят границы новых толерантных диапазонов, рассчитывают линии регрессии, отражающие изменения границ толерантных диапазонов в зависимости от солености акклимации, и, отложив на графике полученные зависимости, на пересечении их с линией "y=x" получают границы потенциального толерантного диапазона. Изобретение позволит значительно сократить время и упростить процесс определения потенциальной соленостной толерантности водных беспозвоночных. 2 ил.

Способ определения потенциальной соленостной толерантности водных беспозвоночных путем деления совокупности исследуемых организмов на группы, проведения одноступенчатой соленостной акклимации различных групп организмов, каждую к своей солености в пределах исходного диапазона толерантности, определения по окончании акклимации новой границы толерантности в каждой группе организмов, нахождения линейной зависимости между границей толерантности и соленостью акклимации, отображения полученной зависимости на графике и определения точек, в которых рассчитанные зависимости пересекают прямую "x=y" и которые являются границами потенциальной толерантности.