СПОСОБ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ЦЕЛОСТНОСТИ КОСТЕЙ И ТРАНСПЛАНТАТ ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Российский патент 2001 года по МПК A61K35/28 

Изобретение относится к медицине, а именно к травматологии и ортопедии, челюстно-лицевой хирургии и нейрохирургии.

Уровень техники.

Разработка методов стимуляции образования кости и ускорение срастания переломов относятся к важным проблемам травматологии и ортопедии и другим областям медицины, связанным с восстановлением целостности костной ткани.

Известны различные способы стимуляции остеорепарации - физические, механические, медикаментозные и т.д. Наряду с перечисленными выше, имеются способы, вовлекающие в остеорепаративный процесс дополнительные остеогенные клетки. Аутологичный костный мозг, полученный из тазовой или бедренной кости, использовали в комбинации либо с кортикальным костным матриксом, который обливали взвесью костномозговых клеток /Амирбекян В.X. и др. Тезисы докл. н/конф Ереван 1978 г./, либо с гомотрансплантатом кости, в просверленные отверстия которого помещали костный мозг /авт. свид. N 85644/. Недостатками данных способов являются как методы трансплантации костного мозга, так и невозможность создания необходимой для костеобразования плотности остеогенных клеток, которые составляют менее 0,1% от числа всех клеток костного мозга. В этих случаях можно говорить лишь о кратковременной стимуляции остеогенных клеток костного ложа, а не о процессе костеобразования за счет пересаженных клеток.

Способ лечения дефектов костей /авт. свид. 1400616/ основан на выделении из костного мозга и размножении в монослойных культурах in vitro стромальных фибробластов костного мозга, заполнение ими трехмерного каркаса с последующей трансплантацией в область дефекта. Последний способ значительно эффективнее предыдущих, но также имеет ряд существенных недостатков: не полное высвобождение стромальных клеток при механическом способе приготовления эксплантируемой в культуру взвеси костномозговых клеток, длительность культивирования для получения необходимого числа остеогенных клеток /1,5-2 месяца/, повреждение клеток при многократных пересевах /6-10 раз/ в процессе культивирования и заключительном сборе клеток перед трансплантацией, использование в качестве фидера, добавляемого к культивируемым клеткам для повышения эффективности клонирования in vitro стромальных фибробластов, гетерологичных клеток костного мозга кролика, возможность заражения клеток в процессе культивирования в связи с использованием гомологичной человеческой сыворотки и др.

Известен "Способ восстановления целостности гиалинового хряща суставов" - патент RU 2142285 C1. Сущность изобретения заключается в том, что с целью органоспецифического восстановления гиалинового хряща в сустав с дефектом гиалинового хряща вводится взвесь аутологичных костномозговых стромальных клеток-предшественников, выращенных in vitro.

Задачей изобретения является восстановление целостности костей и сокращение сроков остеорепаративного процесса.

Сущность изобретения.

Предлагаемый способ восстановления целостности костей включает подготовку принимающего костного ложа, заполнение его комбинированным трансплантатом с остеогенными стромальными клетками-предшественниками костного мозга, выращенными in vitro. При осуществлении изобретения достигаются следующие технические результаты:
более полное высвобождение стромальных элементов при приготовлении взвеси костномозговых клеток за счет того, что вместо механического способа /при помощи шприца с уменьшающимся диаметром игл/ используют ферментативный /3-х кратную обработку фрагментов костного мозга 0,25% раствором трипсина/, который увеличивает их численность в исходной суспензии в 10-30 раз;
сокращение сроков получения необходимого числа остеогенных клеток, уменьшение их повреждения при многократных пересевах за счет того, что культивирование стромальных клеток-предшественников, вырастающих на 12-14 день после первичной эксплантации взвеси клеток костного мозга, проводят на коллагеновых микроносителях в суспензионных культурах из расчета 2х10 клеток на 1 мл среды;
полноценную адгезию стромальных клеток-предшественников на стенках пор каркаса трансплантата за счет того, что губчатый костный матрикс или пористый гидроксиапатит предварительно обрабатывают 0,5% раствором поли-L-лизина или фибронектина и после заполнения трансплантата клетками инкубируют во влажной камере в течение 30-45 мин при 37^oC;
сохранение остеогенных потенции костномозговых стромальных клеток-предшественников при длительном культивировании за счет того, что в культуральную среду дополнительно вводят ascorbate-Na и гидрокортизон из расчета 10 нг каждого реактива на 1 мл среды.

повышение эффективности клонирования стромальных клеток-предшественников за счет того, что в первичную культуру взвеси костномозговых клеток вместо используемых в качестве фидера облученных клеток костного мозга кролика добавляют 10 нг метилпреднизолона на 1 мл среды;
предотвращение заражения в процессе культивирования аутологичных костномозговых стромальных клеток инфекциями /ВИЧ, гепатиты B и C, микоплазмы и т. д. /, которые могут быть привнесены, добавляемой в культуральную среду гомологичной сывороткой человека; культивирование проводят на синтетической питательной среде с добавлением 10% аутологичной сыворотки и 10% сыворотки эмбрионов коров.

Эти и другие преимущества изобретения будут продемонстрированы ниже. Данные и сведения, сообщаемые в следующем разделе описания, призваны подтвердить его осуществимость, но не должны быть использованы для ограничения объема притязаний.

Подробное описание изобретения.

Костный мозг, полученный под местным обезболиванием из тазовой кости, помещают в питательную среду. Путем трипсинизации измельченных фрагментов костного мозга готовят клеточную взвесь, которую засевают в пластиковые флаконы с питательной средой. Колонии стромальных фибробластов, выросшие на 12-14 день культивирования в монослойных культурах, снимают с пластика и пересевают на коллагеновые микроносители. Дальнейшее культивирование, т.е. наращивание клеточной массы, проводят в суспензионных культурах на микроносителях в питательной среде того же состава. Когда численность выросших на микроносителях клеток становится достаточной для замещения дефекта, культивирование прекращают. Микроносителями с выросшими на них клетками заполняют губчатый каркас, который для лучшей адгезии клеток предварительно обрабатывают 0,5% раствором поли-L-лизина или фибронектина. Подготовленный таким образом комбинированный трансплантат помещают в область дефекта кости.

Наиболее предпочтительный вариант выполнения изобретения.

У 17 кроликов опытной группы под местным обезболиванием резецировали часть крыла тазовой кости. Содержащийся в нем костный мозг выскребали в питательную среду α-MEM. Затем фрагменты костного мозга переносили во флаконы с 3-4 мл 0,25% раствора трипсина. Трипсинизацию проводили на магнитной мешалке 3 раза по 20 минут, каждый раз заливая костный мозг свежей порцией трипсина. Инактивацию трипсина проводили добавлением 1 мл эмбриональной сыворотки. Полученную таким образом клеточную взвесь центрифугировали 10 мин при 1000 об/мин, осадок ресуспендировали в свежей среде, фильтровали через капроновый фильтр, подсчитывали число клеток и засевали в культуральные пластиковые флаконы объемом 250,0 мл, из расчета 10⁴-10⁵ клеток на 1 см². Культивирование проводили в монослойных культурах на среде α-MEM с добавлением 20% сыворотки эмбрионов коров и антибиотиков - по 100 ед. пенициллина и стрептомицина на 1 мл среды. (При культивировании костного мозга человека используют 10% сыворотки эмбрионов коров и 10% аутологичной сыворотки больного). Для повышения эффективности клонирования in vitro стромальных клеток-предшественников в культуральную среду добавляли метилпреднизолон (10 нг/мл среды), а для сохранения остеогенных потенций стромальных клеток в процессе культивирования-ascorbate-Na и гидрокортизон (по 10 нг/мл среды). Выросшие на 12-14 день колонии стромальных фибробластов снимали с пластика и пересевали (2х10⁵ клеток/мл среды) на коллагеновые микроносители. Дальнейшее культивирование проводили в суспензионных культурах с тем же составом питательной среды. Когда микроносители полностью обрастали стромальными фибробластами и их общее число было достаточным для заполнения дефекта, культивирование прекращали. Микроносителям давали осесть на дно, надосадочную жидкость отсасывали, а микроносителями заполняли необходимый объем пористого гидроксиапатита или губчатого костного матрикса из расчета 5х10⁶ клеток на 1 см² каркаса. Для полноценной адгезии клеток на поверхности пор каркаса его предварительно обрабатывали 0,5% раствором поли-L-лизина или фибронектина и после заполнения клетками выдерживали во влажной камере 30-45 мин при 37^oC. Подготовленный таким образом комбинированный трансплантат помещали в область дефекта кости аутологичного кролика, который формировали на большеберцовой или теменной костях размером 0,5-0,75 см². Эти животные являлись опытной группой. Контрольной группе кроликов в подобный костный дефект помещали либо пустой пористый каркас, либо гидроксиапатит, заполненный кожными фибробластами, выращенными in vitro. Через 1,5-2 месяца животных как опытной, так и контрольной группы выводили из эксперимента. Фрагменты большеберцовой или теменной костей резецировали за границами дефекта, фиксировали и готовили гистологические препараты.

Микроскопические исследования препаратов всей группы опытных животных показали, что костный дефект был заполнен вновь образованной компактной костью с хорошо выраженным остеобластическим слоем и вмурованными в нее фрагментами резорбирующегося костного матрикса или гидроксиапатита. Она хорошо встраивается в материнскую кость, образуя с ней единый костный орган.

Исследования контрольной группы продемонстрировали, что поры хорошо сохранившегося пористого каркаса были заполнены соединительной тканью. В некоторых препаратах наблюдались небольшие участки остеогенеза, обращенные от краев материнской кости во внутрь костного дефекта.

Таким образом, предложенный способ восстановления целостности костной ткани имеет ряд преимуществ перед описанным выше (Авт. свидетельство N 1400616). Во-первых, ферментативный способ приготовления клеточной взвеси в 10-30 раз увеличивает высвобождение стромальных клеток костного мозга по сравнению с механическим способом, применяемым ранее. Во-вторых, культивирование в суспензионных культурах на микроносителях, а не в монослойных культурах почти вдвое сокращает сроки получения необходимого для трансплантации числа остеогенных клеток-предшественников и полностью исключает их повреждение при многочисленных пересевах. Добавление в культуральную среду ascorbate-Na и гидрокортизона помогает поддержанию остеогенных потенций стромальных клеток-предшественников костного мозга в процессе культивирования, что проявляется в их способности формировать кость в диффузионной камере при трансплантации в нее в 10 раз меньшего числа выращенных in vitro стромальных клеток. Отличием является применение метилпреднизолона, который по своему действию на стромальные элементы аналогичен фидерному эффекту, добавляемых в культуру гетерологичных клеток костного мозга, а также использование аутологичной сыворотки с целью предотвращения возможного заражения культур.

Выделенные методом трипсинизации и выращенные in vitro в данных условиях стромальные клетки-предшественники костного мозга при обратной трансплантации в организм в область дефекта образуют новую кость, которая восстанавливает целостность костного органа.

Специалист в данной области, безусловно, найдет возможности улучшений и дополнений данного изобретения, которые вместе с тем охватываются формулой изобретения, приведенной ниже.

Изобретение относится к медицине, в частности к травматологии. Способ восстановления целостности костей осуществляется следующим образом: под местным обезболиванием резецируется часть крыла тазовой кости, из которой костный мозг выскребается в питательную среду. Клеточную взвесь готовят методом трипсинизации и эксплантируют в пластиковые флаконы с питательной средой, состоящей из 80% среды L-МЕМ и 20% сыворотки эмбрионов коров с добавлением антибиотиков (по 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина), а также метилпреднизолона (10 нг/мл), ascorbate-Na и гидрокортизона (по 10 нг/мл). Выросшие на 1-14 день колонии стромальных клеток-предшественников снимают с пластика и в дальнейшем культивируют на коллагеновых микроносителях в питательной среде того же состава. Микроносителями с выросшими на них клетками заполняют пористые каркасы, которые для лучшей адгезии клеток на поверхности их пор предварительно обрабатывали 0,5% раствором поли-L-лизина или фибронектина. После заполнения клетками пористые каркасы выдерживают во влажной камере 30-45 мин при 37°С. Подготовленный таким образом комбинированный трансплантат переносят аутологично в область костного дефекта. Через 1,5 - 2 месяца на месте трансплантации образуется новая кость, которая хорошо встраивается в материнскую, восстанавливая целостность костного органа. Способ позволяет сократить сроки остеорепаративного процесса. 2 с. и 10 з.п.ф-лы.

1. Способ восстановления целостности костей, включающий заполнение дефекта трансплантатом, при необходимости, фиксации кости, отличающийся тем, что в область дефекта помещают трансплантат, полученный путем выращивания в монослойных культурах клеток, полученных в результате трипсинизации фрагментов аутологичного костного мозга, пересев колоний выращенных стромальных фибробластов на коллагеновые микроносители и культивирование их в суспензионных культурах, заполнение указанными микроносителями с выросшими на них клетками губчатого каркаса, предварительно обработанного раствором поли-L-лизина или фибронектина, инкубирование заполненного клетками губчатого каркаса во влажной камере. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что трипсинизацию проводят путем 3-кратной обработки фрагментов костного мозга 0,25% раствором трипсина. 3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что выращивание в монослойных культурах осуществляется до 2 х 10⁵ клеток на 1 мм среды. 4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что губчатый каркас представляет собой губчатый костный матрикс или пористый гидроксиапатит. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрация раствора поли-L-лизина или фибропектина равна 0,5%. 6. Способ по пп.1 - 5, отличающийся тем, что культивирование во влажной камере осуществляют в течение 30 - 45 мин при 37^oC. 7. Способ по пп.1 - 6, отличающийся тем, что культивирование осуществляют на искусственной питательной среде, в которую добавляют метилпреднизолон, аскорбат-Na или гидрокортизон. 8. Способ по п.7, где концентрация метилпреднизолона в среде составляет 10 нг/мл. 9. Способ по п.7, отличающийся тем, что концентрация аскорбата - Na и гидрокортизона в среде составляет 10 нг/мл. 10. Трансплантат для восстановления целостности костей, представляющий собой каркас, в который помещены стромальные клетки-предшественники костного мозга, отличающийся тем, что он содержит губчатый каркас, в который помещены аутологичные стромальные клетки-предшественники, выращенные на коллагеновых микроносителях в суспензионных культурах, при их плотности не менее 5 • 10⁶ кл/см² каркаса. 11. Трансплантат по п.10, отличающийся тем, что губчатый каркас представляет собой губчатый костный матрикс или пористый гидроксиапатит. 12. Трансплантат по пп.10 и 11, отличающийся тем, что имеет губчатый каркас, предварительно обработанный 0,5% раствором поли-L-лизина или фибронектина.