СПОСОБ УДАЛЕНИЯ КОСТНОГО МОЗГА ИЗ АЛЛОТРАНСПЛАНТАТОВ Российский патент 1995 года по МПК A61K35/28 A01N1/02 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при заготовке губчатых костных трансплантатов.

Установлено, что важнейший фактоp, препятствующий вживанию и ассимиляции спонгиозных аллотрансплантатов при костно-пластических операциях это находящийся в ячейках губчатой кости, быстро некротизирующийся в процессе ее заготовки и являющийся основным носителем антигенных веществ аллогенный костный мозг.

Известны многочисленные способы обработки спонгиозных алло- и гетеротрансплантатов, направленные на освобождение костно-мозговых ячеек от их содержимого, удаление белковых и жировых веществ. Одним из наиболее старых является предложенный S. Orell в 1934 году способ получения так называемой "чистой кости" os purum. Сущность данного и всех позднее предложенных аналогичных способов заключилась либо в прокалывании, либо в вываривании ("бульонная кость" по Г.И.Турнеру), либо в обработке кости сильнодействующими химическими реактивами. Однако от всех предложенных способов в дальнейшем отказались, ибо они приводили к денатурации основного вещества кости и снижению ее пластических свойств.

Известен получивший наибольшее распространение за рубежом в шестидесятые-семидесятые годы способ получения так называемой "кильской кости" путем последовательной обработки губчатых трансплантатов комплексом химических растворителей. Однако специальными исследованиями, в том числе экспериментальными, было установлено, что этот материал часто рассасывается, как инородное тело, а по клиническим наблюдениям результаты костно-пластических операций с использованием "кильской кости" оказались неблагоприятными, что связано с отрицательным воздействием применяемых реактивов на костное вещество трансплантатов и их пластические свойства.

Известен, наиболее близкий к предлагаемому, получивший применение в нашей стране, используемый в клинике с 1975 года до настоящего времени способ удаления костного мозга из аллотрансплантатов, разработанный Э.Н.Беллендиром и И. У.Салмагамбетовым, заключающийся в обработке фрагментов губчатой кости сильными, направленными струями физиологического раствора в специальной установке, сконструированной авторами без применения химических или физических воздействий, что исключает неблагоприятное влияние обработки на пластические свойства костного вещества. Однако несмотря на высокие положительные качества данного способа длительные экспериментальные и клинические исследования показали, что существуют резервы и предпосылки для его дальнейшего усовершенствования.

Недостатком указанного способа, является то, что тотального или даже субтотального его удаления нередко достичь не удается, так как в зависимости от строения обрабатываемой губчатой кости в ней имеется большее или меньшее количество мелких или глубоко расположенных костно-мозговых ячеек, не доступных прямому воздействию струй физраствора, несмотря на высокое давление, используемое в установке, к тому же обработка трансплантата (его промывание) требует значительного времени (30 мин), т.е. представляет собой трудоемкую процедуру.

Целью изобретения является повышение полноты удаления костного мозга из губчатых трансплантатов и сокращение времени его обработки в установке.

Поставленная цель достигается тем, что перед помещением обрабатываемого фрагмента спонгиозы в установку производят разжижение некротизированного в процессе заготовки фрагмента спонгиозы костного мозга в растворе протеолитического фермента террилитина, под воздействием которого костно-мозговая ткань распадается, превращаясь в полужидкий клеточный детрит, который легко удаляется из костно-мозговых ячеек, причем полнота удаления костного мозга увеличивается, а время на обработку трансплантата уменьшается.

Принципиальными отличиями способа являются применение ранее не использованного с данной целью биологического (энзиматического) воздействия на костный мозг спонгиозного трансплантата, направленного на его удаление, комплексное воздействие на костный мозг спонгиозного трансплантата путем последовательного использования биологической (энзиматической) и механической (промывания сильными направленными струями физраствора) его обработки, что в наибольшей степени сохраняет пластические свойства кости и использование оптимальных параметров обработки аллотрансплантатов в растворе фермента и последующего его промываания.

Преимущества предлагаемого способа по сравнению с известным состоят в улучшении качества получаемых трансплантатов. Известное сохранение части костного мозга в ячейках губчатой кости требует специальных условий хранения трансплантатов (в морозильной камере) для предупреждения нежелательных форм процессов разложения, развивающихся в мягких тканях при более высоких температурах, тогда как освобожденную от мягких тканей кость можно хранить даже при комнатной температуре. Некротизированный чужеродный костный мозг затрудняет ассимиляцию пересаженной кости, его сохранение увеличивает к тому же возможность реакций тканевой несовместимости. Все эти нежелательные явления по объему и возможности их развития прямо пропорциональны количеству остающегося неудаленного костного мозга. Указанные недостатки ранее предлагаемого способа вынуждали выбирать для обработки спонгиозные трансплантаты с более крупными ячейками, из которых костный мозг удаляют полностью, но которые имеют меньшую прочность. Кроме того, применение предлагаемого способа позволяет сократить время обработки трансплантата с 30 до 10 мин, что ведет к большей производительности труда специалистов, заготавливающих трансплантаты, и дает экономический эффект. В сравнении с известными способами обработки трансплантатов химическими реактивами или физическими воздействиями (прокаливанием, выравниванием и т.д.) предлагаемый способ обладает тем неоспоримым преимуществом, что он позволяет в полной мере сохранять свойства нативной кости и ее высокие качества как пластического материала.

Способ осуществляется следующим образом.

Полученные от трупа в течение первых 24 часов после смерти фрагменты губчатой кости погружают в раствор протеолитического фермента террилитина концентрацией 20 ПЕ в 1 мл с таким расчетом, чтобы объем раствора в 10 раз превышал объем обрабатываемых фрагментов спонгиозы. В одной емкости можно одновременно обрабатывать до 3-4 фрагментов. Указанную емкость помещают в термостат на 24 ч при температуре +37^оС. В течение этого времени необходимо периодически (через каждые 2-3 ч) перемешивать раствор и менять положения трансплантатов. По истечении указанного времени фрагменты спонгиозы извлекают из раствора и обрабатывают в установке по известному способу в течение 10 мин.

С целью проверки эффективности способа проведены следующие исследования: сравнение массы удаляемого костного мозга из фрагментов аллоспонгиозы путем взвешивания их до и после обработки с целью определения уменьшения веса после обработки, происходящего за счет удаляемого костного мозга, в случаях предварительной экспозиции трансплантата в растворе террилитина и без таковой (табл. 1); II сравнение определяемой планиметрически площади, занятой неудаленным костным мозгом трансплантатов (табл.2) путем морфометрии гистологических препаратов в тех же группах испытуемых образцов (а и б, см. п. 1); III эксперименты на 28 кроликах по трансплантации в костные полости аллотрансплантатов, обработанных террилитином (10) и не подвергавшихся обработке (18), с целью исключения отрицательного влияния энзиматической обработки на пластические свойства трансплантатов путем сравнения темпов и интенсивности восстановительных процессов на основании рентгенологических и гистологических критериев.

Установлено следующее.

При сравнительном изучении 29 фрагментов спонгиозных трансплантатов после их обработки в установке в течение 10 мин в случаях предварительной экспозиции в растворе террилитина по указанной методике (предлагаемый способ) и без таковой (прототип) установлено, что остаточная масса трансплантатов составляла в первом случае 34,6±1,36% от исходного, а во втором 48,2±6,20% (р= 0,04), что подтверждает эффективность предлагаемого способа. Установлено, что последний эффективен при различных вариантах структуры спонгиозы. Для проверки данного положения трансплантаты брали на 5 уровнях, начиная от подхрящевой мыщелковой зоны суставного конца бедра, где плотность спонгиозы наиболее высока, а ячейки наиболее мелки, до метадиафизарной зоны, где последние наиболее велики и губчатая костная ткань разрежена. Как видно из табл.1, более высокая эффективность предлагаемого способа отчетливо видна на всех уровнях, за исключением последнего, где благодаря крупным ячейкам костный мозг вымывается полностью и без энзиматической обработки, а костное вещество составляет лишь 18,7-20,0% от общей массы губчатой кости.

Гистологические исследования показали (табл.2), что основные закономерности, выявленные в первой группе исследований определяются и при планиметрическом изучении гистологических препаратов. Установлено, что незначительные остатки костного мозга (от 0,3 до 1,52% от площади препарата) сохраняются не более, чем в 50% изученных образцов, тогда как в контроле (без применения предлагаемого способа) площадь, занятая остатком костного мозга, достигает уровня до 16,79% и он обнаруживается во всех 100% образцах. Количественный анализ различий между прототипом и предлагаемым способом по сравнительной оценке планиметрических данных отличается высокой значимостью и статистической достоверностью (p < 0,001).

Наконец, в хронических экспериментах на 28 кроликах было показано, что при замещении костных полостей в эпиметафизах бедренных костей животных не наблюдалось каких-либо различий в развитии восстановительных процессов в случаях использования спонгиозных или компактных (в виде костной щебенки) аллотрансплантатов обработанных или необработанных террилитином, т.е. сама по себе обработка ферментом не оказывает неблагоприятного влияния на пластические свойства костного вещества аллотрансплантата в отличие от ранее применявшихся химических или физических воздействий, что лишний раз свидетельствует о преимуществах использования биологических веществ и методов в медицинской практике. Это подтверждено также рентгенологически и гистологически на материале указанных экспериментов, а также клиническими наблюдениями у оперированных больных.

Способ удаления костного мозга из аллотрансплантатов. Изобретение относится к медицине и может быть использовано при заготовке губчатых костных трансплантатов. Способы удаления костного мозга из заготавливаемых спонгиозных алло- и гетеротрансплантатов с целью устранения иммунологически активного субстрата и освобождения костно-мозговых ячеек для облегчения ассимиляции спонгиозы, предложенные ранее, были не эффективны из-за применения сильных физических и химических воздействий, денатурирующих основное вещество кости и снижающих ее пластические свойства, а промывание ее в специальной установке сильными струями теплого физраствора в случаях мелкоячеистой структуры кости не позволяло полностью удалить костный мозг, что снижало эффективность способа и требовало длительного времени обработки. С целью повышения полноты удаления костного мозга и сокращения времени обработки в установке фрагменты спонгиозы последовательно выдерживают в растворе протеолитического фермента - террилитина концентрацией 20 ПЕ в 1 мл в течение 24 ч и промывают в установке в течение 10 мин. При уменьшении времени обработки трансплантатов в 3 раза масса удаляемого костного мозга достоверно увеличивается на 13,6% , благодаря чему пластические свойства трансплантатов, возможности их хранения и транспортировки улучшаются.

СПОСОБ УДАЛЕНИЯ КОСТНОГО МОЗГА ИЗ АЛЛОТРАНСПЛАНТАТОВ путем промывания губчатой кости направленными струями физиологического раствора при 30 - 40^oС, отличающийся тем, что перед обработкой физиологическим раствором фрагменты губчатой кости выдерживают в течение 24 ч в растворе, содержащем 20 ПЕ/мл террилитина, при 37^oС и промывают их в течение 10 мин.