СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КЛЕТОЧНОЙ МОНОКУЛЬТУРЫ И УСТАНОВКА ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Российский патент 2002 года по МПК C12N1/02 C12M3/00 

Изобретение относится к биологии и медицине. Оно может быть использовано для сортировки клеток, элиминации популяции клеток из гетерогенной смеси популяций и контроля за состоянием выделяемой популяции.

Известен способ получения клеточной монокультуры, предусматривающий сепарирование биохимически подготовленной гетерогенной смеси клеток и полученных на их базе гибридом с антителами, маркированными магнитолипосомами (см. RU 2083976 C1, 10.07.1997 г. ). По этому способу маркированные клетки сепарируют в неоднородном магнитном поле и сепарированную культуру контролируют на наличие в ней остатков меченой популяции при воздействии на нее высокочастотным однородным магнитным полем в зависимости от наличия эталонного сигнала ЯМР.

Недостатком этого способа является его техническая сложность и невысокая степень очистки получаемой монокультуры.

Ближайшим аналогом предложенного способа является способ получения клеточной монокультуры, предусматривающий приготовление исходной суспензии клеток, из части этих клеток - гибридом и антител к ним, маркирование антител флуорохромом, смешивание их и исходной культуры клеток с образованием конъюгатов из антител и соответствующих им клеток, помещение части этой смеси в плоскую кювету в виде монослоя, облучение ее ультрафиолетовым излучением, наблюдение за свечением конъюгатов через управляемый транспарант и элиминацию их воздействием сфокусированного лазерного излучения для образования монокультуры из оставшихся клеток, так что в результате в культуре остается требуемая монокультура (см. RU 2059712 C1, 10.05.1996 г. ).

Недостатком этого способа является необходимость применения управляемого транспаранта, что делает способ недостаточно надежным. Известный способ не обеспечивает достаточно высокой степени чистоты полученной монокультуры.

Технический результат изобретения в части способа заключается в повышении степени чистоты получаемой клеточной монокультуры.

Для достижения этого технического результата в предложенном способе, предусматривающем приготовление исходной суспензии клеток, из части этих клеток - гибридом и антител к ним, маркирование антител флуорохромом, смешивание их и исходной культуры клеток, помещение части этой смеси в плоскую кювету в виде монослоя, облучение ее ультрафиолетовым излучением, наблюдение за свечением конъюгатов и элиминацию их под воздействием сфокусированного лазерного излучения для образования монокультуры из оставшихся клеток, используют плоскую кювету, снабженную фоконом, узкая грань которого является верхней гранью кюветы. Облучение кюветы ультрафиолетовым излучением осуществляют со стороны ее нижней грани для получения координат светящихся конъюгатов на широкой грани фокона, соответствующим координатам конъюгатов в кювете, усиливают яркость изображения на широкой грани фокона, наблюдают изображение светящихся конъюгатов и проводят цифровую обработку этого изображения, причем элиминацию конъюгатов проводят при фокусировании лазерного излучения фоконом. После этого осуществляют повторное наблюдение за свечением оставшихся конъюгатов и их элиминацию и эти приемы повторяют до полной элиминации конъюгатов.

Известна установка для получения клеточной монокультуры (см. RU 2083976 C1, 10.07.1997 г. ), содержащая резервуар смеси конъюгатов и клеток, источники постоянного и переменного магнитных полей, систему контроля клеточной монокультуры с помощью ядерно-магнитного резонанса и резервуар для полученной клеточной монокультуры.

Недостаток установки заключается в сложности и недостаточно высокой эффективности разделения клеток гетерогенной смеси.

Ближайшим техническим решением к предложенной установке является установка для получения клеточной монокультуры, включающая резервуар смеси конъюгатов и клеток, плоскую кювету для размещения упомянутой смеси в виде монослоя, систему подсветки кюветы ультрафиолетовым излучением, оптико-электронное устройство наблюдения за свечением конъюгатов, оптическую систему, содержащую объектив, проецирующий изображение светящихся конъюгатов на управляемый транспарант, служащий модулятором лазерного излучения, устройство для элиминации конъюгатов, состоящее из видикона, блока памяти и лазера, и резервуара для сбора клеточной монокультуры (RU 2059712 C1, 10.05.1996). Оптико-электронная устройство включено в цепь обратной связи с лазером для ввода информации о результате воздействия ультрафиолетового облучения на монослой смеси.

Недостатком установки является наличие управляемого транспаранта, сложность конструкции установки, недостаточная надежность работы установки вследствие малой оптической прочности транспаранта, а также в недостаточной степени чистоты получаемой клеточной монокультуры.

Технический результат изобретения в части установки заключается в упрощении ее конструкции и в повышении степени чистоты получаемой клеточной монокультуры.

Для достижения этого результата предложенная установка, включает резервуар смеси конъюгатов и клеток, плоскую кювету для размещения в ней упомянутой смеси в виде монослоя, систему подсветки кюветы ультрафиолетовым облучением, оптико-электронное устройство наблюдения за свечением конъюгатов и устройство для элиминации их, содержащее видикон блок памяти и лазер, и резервуар для сбора клеточной монокультуры, а плоская кювета снабжена фоконом, узкая грань которого образует верхнюю грань кюветы. Оптико-электронное устройство снабжено делительным зеркалом, усилителем яркости, блоком регистрации координат светящихся конъюгатов и сканатором лазерного излучения по фиксированным координатам светящихся конъюгатов.

Способ получения клеточной монокультуры заключается в следующем. Приготовливают исходную клеточную суспензию. Из части этих клеток - гибридомы и антитела к ним. Маркируют антитела флуорохромом и смешивают их и исходную культуру клеток с образованием конъюгатов из антител и соответствующих им клеток. Помещают часть этой смеси в плоскую кювету в виде монослоя и облучают ее ультрафиолетовым излучением, при этом наблюдают за свечением конъюгатов. Используемая плоская кювета снабжена фоконом, узкая грань которого является верхней гранью кюветы. Облучение ультрафиолетовым излучением кюветы осуществляют со стороны ее нижней грани для получения координат светящихся конъюгатов на широкой грани фокона, соответствующим координатам конъюгатов в кювете. Затем усиливают яркость изображения на широкой грани фокона и наблюдают изображение светящихся конъюгатов. Затем проводят цифровую обработку этого изображения. Элиминацию конъюгатов проводят воздействием сфокусированного лазерного излучения фоконом для образования монокультуры из оставшихся клеток, после чего осуществляют повторное наблюдение за свечением оставшихся конъюгатов, проводят их элиминацию и эти приемы повторяют до полной элиминации конъюгатов.

Пример. Осуществляют очистку костного мозга при лечении острого лейкоза путем аутологической трансплантации костного мозга (АКТМ), т. е. проводят пересадку пациенту его собственных миелокариоцитов, заготовленных в период полной клинико-гематологической ремиссии и сохраняющихся при ультранизкой температуре. Для повышения эффективности АКТМ очистку костного мозга проводят in vitro путем получения моноклональных антител для данной формы лейкоза. Готовят из костного мозга пациента клеточную суспензию, из части этой суспензии готовят моноклональные антитела для данной формы лейкоза, после этого присоединяют к ним флуорохром, в частности, флуоресцеина изотиоцианата. После смешивания исходной клеточной суспензии меченые антитела садятся на соответствующие клетки, в результате чего получают гетерогенную смесь конъюгатов с клеточной культурой. После помещения части этой смеси в плоскую прозрачную кювету, обеспечивающую получение мономолекулярного слоя смеси, и облучения ее ультрафиолетовым излучением при длине волны 488 нм, что соответствует максимуму возбуждения флуоресцеина, в плоскости кюветы получают изображение светящихся конъюгатов. Это изображение появляется в увеличенном виде на широкой стороне фокона и при этом яркость изображения ослабевает. Для усиления яркости используется пленочный полупроводниковый усилитель яркости, после чего изображение считывается видиконом. Для получения координат свечения конъюгатов для считанного изображения проводят цифровую обработку, результаты которого поступают в блок памяти и управления. По этим координатам с помощью сканатора на верхнюю грань фокона через делительное зеркало подаются импульсы лазерного излучения, фокусирующиеся на конъюгатах и разрушающие их клеточную мембрану. После этого осуществляют повторное наблюдение за свечением оставшихся конъюгатов, проводят их элиминацию и эти приемы повторяют до полной элиминации конъюгатов.

В результате получают очищенный от клональных опухолевых стволовых клеток костный мозг, что позволяет при его пересадке пациенту повысить его безрецидивную выживаемость.

Изобретение в части установки поясняется чертежом, на котором схематично изображен общий вид установки.

Установка состоит из резервуара 1 смеси конъюгатов и клеток, связанного с плоской кюветой 2 для размещения в ней смеси в виде монослоя 3. Под кюветой размещается система ультрафиолетовой подсветки, состоящая из источника 4 ультрафиолетового излучения, расположенного соосно с ним расширителя 5 пучка и зеркала 6, расположенного под углом 45 градусов по отношению к направлению пучка излучения. Над кюветой размещается оптико-электронное устройство, состоящее из делительного зеркала 7, фокусирующей линзы 8, и расположенного соосно с ними усилителя 9 яркости. Устройство для элиминации светящихся конъюгатов содержит видикон 10, расположенный над усилителем яркости, связанный с видиконом блок памяти и управления 11, лазер 12, установленный под углом 90 градусов по отношению к оси, на которой расположены кювета и видикон и соосно установленный с лазером сканатор 13, воздействующий на делительное зеркало 7, установленное под углом 45 градусов к упомянутой оси. Полученную клеточную монокультуру размещают в резервуаре 14, расположенном с другой стороны плоской кюветы по отношению к резервуару смеси конъюгатов и клеток. Плоская кювета 2 снабжена фоконом 15, узкая грань которого образует ее верхнюю грань.

Установка работает следующим образом.

Приготавливают исходную суспензию клеток, из части этих клеток - гибридомы и антитела к ним. Маркируют антитела флуорохромом, смешивают их и исходную культуру клеток с образованием конъюгатов из антител и соответствующих им клеток. Помещают эту смесь в резервуар 1, а часть ее - в плоскую кювету 2, где она располагается в виде монослоя 3. После этого облучают монослой с помощью системы ультрафиолетового излучения. При этом излучение источника 4 ультрафиолетового излучения выравнивается по интенсивности с помощью расширителя 5 пучка для однородной засветки кюветы и направляется на нее с помощью зеркала 6. Возникающее под действием ультрафиолетовой подсветки свечение конъюгатов наблюдают с помощью оптико-электронного устройства, состоящего из делительного зеркала 7 и усилителя 9 яркости. С помощью устройства для элиминации светящихся конъюгатов последние разрушают в объеме монослоя. Для этого изображение, получаемое видиконом 10, фиксируется в блоке 11 памяти управления, из которого координаты светящихся конъюгатов передаются в сканатор 13, управляющий подачей излучения лазера 12 с помощью делительного зеркала 7 на широкую грань фокона 15, фокусирующего лазерное излучение на соответствующий данной координате светящийся конъюгат, и тем самым проводя его элиминацию. После этого осуществляют повторное наблюдение за свечением оставшихся конъюгатов, снова проводят их элиминацию и эти приемы повторяют до полной элиминации конъюгатов. Цикл повторяют до полного уничтожения конъюгатов. После этого очищенную культуру из кюветы сливают в резервуар 14 сборника очищенной клеточной монокультуры.

Использование данного способа и установки позволяет осуществить массовую подготовку культур при решении целого ряда задач генной инженерии.

При использовании изобретения в медицине предложенный способ и установка дают возможность радикально повысить эффективность лечения лейкемии путем высокой степени очистки костного мозга.

Изобретение относится к биологии и медицине. Способ предусматривает помещение смеси конъюгатов и клеток в плоскую кювету, снабженную фоконом, узкая грань которого является верхней гранью кюветы. Облучают ультрафиолетовым излучением кювету со стороны ее нижней грани для получения координат светящихся конъюгатов на широкой грани фокона, соответствующих координатам конъюгатов в кювете. Затем усиливают яркость изображения на широкой грани фокона и наблюдают изображения конъюгатов с последующей цифровой обработкой этого изображения. Проводят элиминацию конъюгатов при фокусировании лазерного излучения фоконом. Наблюдение за свечением оставшихся конъюгатов и их элиминацию повторяют до полной элиминации конъюгатов. Установка для осуществления способа содержит плоскую кювету, снабженную фоконом, и оптико-электронное устройство, снабженное делительным зеркалом, усилителем яркости, блоком регистрации координат светящихся конъюгатов и сканатором лазерного излучения. Установка включает также устройство для элиминации конъюгатов, содержащее видикон, блок памяти и лазер. Изобретение обеспечивает повышение степени чистоты клеточной монокультуры и упрощение конструкции установки. 2 с. п. ф-лы, 1 ил.

1. Способ получения клеточной монокультуры, предусматривающий подготовку моноклональных антител, конъюгированных с флуорохромом, введение этой культуры в плоскую кювету в виде монослоя, облучение ее ультрафиолетовым излучением, наблюдение за свечением конъюгатов и элиминацию их воздействием сфокусированного лазерного излучения для образования монокультуры из оставшихся клеток, отличающийся тем, что используют плоскую кювету, снабженную фоконом, узкая грань которого является верхней гранью кюветы, при этом облучение ультрафиолетовым излучением кюветы осуществляют со стороны ее нижней грани для получения координат светящихся конъюгатов на широкой грани фокона, соответствующих координатам конъюгатов в кювете, усиливают яркость изображения на широкой грани фокона, наблюдают изображение светящихся конъюгатов и проводят цифровую обработку этого изображения, причем элиминацию конъюгатов проводят при фокусировании лазерного излучения фоконом, после чего осуществляют повторное наблюдение за свечением оставшихся конъюгатов, проводят их элиминацию и эти приемы повторяют до полной элиминации конъюгатов. 2. Установка для осуществления способа по п. 1, включающая резервуар смеси конъюгатов и клеток, плоскую кювету для размещения в ней упомянутой смеси в виде монослоя, систему подсветки кюветы ультрафиолетовым облучением, оптико-электронное устройство наблюдения за свечением конъюгатов и устройство для элиминации их, содержащее видикон, блок памяти и лазер, и резервуар для сбора монокультуры, отличающаяся тем, что плоская кювета снабжена фоконом, узкая грань которого образует верхнюю грань кюветы, при этом оптико-электронное устройство снабжено делительным зеркалом, усилителем яркости, блоком регистрации координат светящихся конъюгатов и сканатором лазерного излучения по фиксированным координатам светящихся конъюгатов.