СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ ВИТРЕОРЕТИНОПАТИИ Российский патент 2002 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к области экспериментальной медицины, конкретно к способам моделирования пролиферативной витреоретинопатии.

Известны способы моделирования данного патологического процесса, заключающиеся во введении в стекловидное тело различных видов клеток [2-7] и последующем гистологическом исследовании, подтверждающем развитие заболевания. Серийные срезы окрашивают гематоксилин-эозином и по Ван-Гизону.

Однако данные методы имеют следующие недостатки:
- в качестве ведущего патогенетического фактора используются клетки (фибробласты, активированные макрофаги), изначально играющие важную роль в процессах пролиферации и обеспечивающие морфогенетическую функцию соединительной ткани;
- длительность эксперимента - до 6 месяцев и более.

Наиболее близким по технической сущности является способ моделирования пролиферативной витреоретинопатии, заключающийся в введении в стекловидное тело взвеси активированных тромбоцитов с последующим гистологическим исследованием через 2 недели, 1, 3, 12 месяцев [1]. Однако данный способ является недостаточно точным, т.к.:
- в ходе эксперимента не проводилась непрямая офтальмоскопия;
- получение описанной модели зависит от дозы введенных активированных тромбоцитов.

Следовательно, страдают воспроизводимость и точность способа моделирования пролиферативной витреоретинопатии. Процесс создания модели также отличается длительностью - 12 месяцев.

Новый технический результат, повышающий точность и воспроизводимость способа моделирования, сокращающий время получения модели, достигают применением нового способа моделирования пролиферативной витреоретинопатии, заключающегося во введении в стекловидное тело взвеси клеточных элементов в физиологическом растворе и последующем периодическом гистологическом исследовании серийных срезов глазного яблока, причем в качестве клеточных элементов используют мононуклеары крови, а для контроля проводят непрямую офтальмоскопию и гистологические исследования на 1-, 3-, 5-, 7-, 14- и 21-й день и по развитию массивных витреоретинальных мембран судят о получении модели.

Способ осуществляют следующим образом. Мононуклеары крови выделяют с помощью градиента фиколл-гипак. Кровь, полученную от животного, разбавляют в 2 раза физиологическим раствором. Полученную суспензию наслаивают на 3 мл смеси фиколла-гипака. Пробы центрифугируют в течение 15 мин при 800 g (2000 об/мин). После центрифугирования интерфазный слой, содержащий мононуклеары и располагающийся между плазмой и градиентом, забирают пастеровской пипеткой. Добавляют 1 мл физиологического раствора и полученную суспензия вновь центрифугируют в течение 7 мин при 400 g (15500 об/мин) для отмывания полученных мононуклеаров (схема разделения мононуклеаров представлена на фиг. 1). Чистота мононуклеаров, полученных на градиенте фиколл-гипак, составляет до 96%.

После эфирного наркоза каждому животному выполняют интравитреальные инъекции: через плоскую часть цилиарного тела в один глаз вводят 0,05 мл физиологического раствора, содержащего мононуклеары из расчета 2700/мм³, во второй глаз для контроля вводят 0,05 мл физиологического раствора.

Способ апробирован на 20 крысах породы Wistar весом 200-250 г.

Обзор экспериментального материала. В ходе эксперимента проводили непрямую офтальмоскопию на 1-, 3-, 5-, 7-, 14- и 21-й день после инъекции в условиях медикаментозного мидриаза (инсталляции S.Tropicamidi). В глазах с введенными мононуклеарами выявлены следующие изменения. На 3-й день после инъекции у всех животных в центральных отделах стекловидного тела отмечены локальные малоподвижные помутнения серовато-белого цвета, сетчатка не изменена. На 5-7-й дни офтальмоскопия затруднена из-за ограниченных фиксированных помутнений в стекловидном теле. На 14-й день у 2 животных отмечено помутнение задних отделов хрусталика, препятствующее офтальмоскопии; в глазах остальных животных грубое фиксированное помутнение в преретинальных и центральных отделах стекловидного тела, что затрудняло оценку состояния сетчатки. На 21-й день у всех животных рефлекс с глазного дна отсутствовал из-за развития катаракты. В контрольных глазах с инъекцией физиологического раствора изменений не выявлено.

В ходе эксперимента после каждой офтальмоскопии за исключением 1-го дня умерщвляли по 4 животных и выполняли энуклеацию. При подготовке материала для гистологических исследований макроскопически, начиная с 14-го дня, появились признаки субатрофии экспериментальных глаз (у 3 животных передне-задний размер составил 5-6 мм, в норме 7-8 мм). На 21-й день во всех экспериментальных глазах субатрофия (передне-задний размер около 4 мм). Весь полученный материал зафиксирован для световой и электронной микроскопии по стандартным методикам. Серийные срезы для световой микроскопии окрашены гематоксилин-эозином по Браше и по Ван-Гизону. Полутонкие срезы для электронной микроскопии окрашены толуидиновым синим.

В ходе гистологического исследования на 3-й день после введения мононуклеаров наблюдали скопления макрофагов в стекловидном теле (см. фиг.2 - полутонкий срез для электронной микроскопии. Здесь и на фиг. 3, 4 окраска толуидиновым синим. х1200). На 7-й день после инъекции - позади хрусталика скопления макрофагов и фибробластоподобных клеток (см. фиг.3), преретинально - обширные скопления фибробластов и клеток мононуклеарного ряда, окруженные коллагеновыми фибриллами (см. фиг.4). Эти морфологические изменения формировали преретинальную мембрану, которая к 14-му дню превращалась в довольно мощное образование в результате слияния отдельных, изолированных преретинальных мембран (см. фиг.5 - световая микроскопия. Окраска гематоксилин-эозином. х600).

Отмечено формирование эпиретинальных мембран с деструкцией внутренних слоев сетчатки (см. фиг.6 - световая микроскопия. Окраска по Браше. х600), локальная тракционная отслойка сетчатки (см. фиг.7 - световая микроскопия. Окраска по Браше. х600). На 21-й день были обнаружены грубые изменения в виде массивных интравитреальных мембран (см. фиг.8 - световая микроскопия. Окраска гематоксилинэозином. х600), а также развитие преретинальной и интраретинальной фиброзной ткани с полной утратой структуры сетчатки (см. фиг.9 - световая микроскопия. Окраска гематоксилин-эозином. х600; см. фиг.10 - световая микроскопия. Окраска по Ван-Гизону. х600). В контрольных глазах с инъекцией физиологического раствора изменений не выявлено.

Таким образом, офтальмоскопические и гистологические исследования в ходе эксперимента показали развитие преретинального швартообразования, являющегося основным признаком пролиферативной витреоретинопатии. Следовательно, предлагаемый способ моделирования является не только подтверждением участия мононуклеаров крови в патогенезе данного патологического процесса, но и позволяет создать более точную и высоко воспроизводимую модель пролиферативной витреоретинопатии и за более короткий срок - 21 день.

Источники информации
1. Хорошилова-Маслова И.П., Бабижаев М.А., Киселева О.А., Илатовская Л. В. Пептид клеточной адгезии в профилактике посттравматической пролиферативной витреоретинопатии (экспериментально-морфологическое исследование) // Вестн. офтальмол. 1997. 4. С. 27-31,
2. Algvere PV; Hallnas K; Dafgard E; Hoog A. Panretinal photocoagulation aggravates experimental proliferative vitreoretinopathy. // Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 1990; 228(5): p. 461-6
3. Chandler DB; Quansah FA, Hida T; Machemer R. A refined experimental model for proliferative vitreoretinopathy. // Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 1986; 224(1): p. 86-91.

4. de Juan E Jr; Dickson J; Hatchell DL. Interaction of retinal glial cells with collagen matrices: implications for pathogenesis of cell-mediated vitreous traction. // Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 1989; 227(5): p. 494-8.

5. Forrester JV; Stott DI; Hercus KM. Naturally occurring antibodies to bovine and human retinal S antigen: a comparison between uveitis patients and healthy volunteers. // Br. J Ophthalmol, 1989, Feb; 73(2): p. l55-9.

6. Hitchins CA; Grierson I., Hiscott PS. The effects of injections of cultured fibroblasts into the rabbit vitreous. // Graefes Arch Clin. Exp. Ophthalmol, 1985, 223 (5): p. 237-49.

7. Hui YN; Goodnight R; Sorgente N; Ryan SJ. Fibrovascular proliferation and retinal detachment after intravitreal injection of activated macrophages in the rabbit eye. // Am. J. Ophthalmol, 1989, Aug. 15, 108(2): p. l76-84.

Изобретение относится к области экспериментальной медицины, конкретно к способам моделирования пролиферативной витреоретинопатии. Способ обеспечивает повышение точности воспроизводимости и сокращение времени получения модели. Вводят в стекловидное тело взвесь клеточных элементов в физиологическом растворе с последующим периодическим гистологическим исследованием серийных срезов глазного яблока, при этом в качестве клеточных элементов используют мононуклеары крови и для контроля проводят непрямую офтальмоскопию и гистологические исследования на 1-, 3-, 5-, 7-, 14-, 21-й день и по развитию массивных витреоретинальных мембран судят о получении модели. 10 ил.

Способ моделирования пролиферативной витреоретинопатии, заключающийся во введении в стекловидное тело взвеси клеточных элементов в физиологическом растворе и последующем периодическом гистологическом исследовании серийных срезов глазного яблока, отличающийся тем, что в качестве клеточных элементов используют мононуклеары крови и для контроля проводят непрямую офтальмоскопию и гистологические исследования на 1-, 3-, 5-, 7-, 14- и 21-й день и по развитию массивных витреоретинальных мембран судят о получении модели.