БАКТЕРИЗОВАННОЕ УДОБРЕНИЕ Российский патент 2002 года по МПК C05F11/08 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/07 

Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано при производстве почвогрунтов и удобрений на основе торфа и биогумуса.

Известно бактеризованное удобрение (Авт. свид. СССР, 655694, МКИ: С 05 F 11/08, опубл. 08.04.79), включающее в качестве гуминосодержащей основы торф. Удобрение содержит также мочевину, известь, бактериальную маточную культуру АМБ и препарат Азотобактерин.

Наличие в составе извести 0,2-0,3 и мочевины 0,02-0,03 вес. ч. на 100 вес. ч. торфа позволяет повысить его рН примерно до значений 6,5-7. Однако оптимальным для роста и поддержания жизнеспособности клеток Азотобактерина является значение рН 7,5. Недостаток этого удобрения заключается в том, что Азотобактерин находится в неоптимальных условиях кислотности, предопределяющих слабый рост бактерий, и неизбежно ведет к большой потере жизнеспособности клеток при длительном хранении удобрения. Кроме того, этот процесс усугубляется тем, что Азотобактерин вносится в естественные компосты, содержащие множество разнообразной микрофлоры, в т.ч. токсичной, и компост не подвергается стерилизации (пастеризации).

Такой состав является удобрительной смесью, но не обладает антигрибной активностью и не снижает поражения растений почвенными фитопатогенами, т.к. бактериальная маточная культура АМБ используется для ускорения процесса компостирования инокулированного торфа, а препарат Азотобактерин выступает только как стимулятор роста растений и слабый фиксатор атмосферного азота.

Известно также бактеризованное удобрение (Патент РФ 2125549, МКИ: С 05 F 11/08, опубл. 27.01.99), являющееся наиболее близким аналогом. Удобрение включает гуминосодержащую основу в виде биогумуса с рН 6,5-7,5 и микроорганизмы, обладающие фунгицидной активностью. В биогумус вносится бактериальная культура Bacillus subtilis ИМП-215 в концентрациях 1,10⁹-1,10¹² спор на 1 кг биогумуса.

К недостаткам удобрения следует отнести то, что входящий в него биогумус содержит случайный и обильный набор микрофлоры и поэтому антифунгальная активность интродуцируемого штамма мала в силу его ингибирования набором этой микрофлоры. В процессе хранения при большой населенности удобрения разнородной микрофлорой происходит интенсивный расход питательных веществ, содержащихся в нем, что приводит к большим потерям интродуцируемого штамма. Кроме того, потери жизнеспособных клеток штамма происходят из-за затрудненной аэрации препарата, обусловленной увеличением плотности влажного биогумуса в процессе хранения препарата (от нескольких недель до 1-2 месяцев). При длительном хранении 8-10 месяцев и более содержание жизнеспособных клеток интродуцируемого штамма снижается столь существенно, что удобрение теряет свое первоначальное предназначение.

При использовании удобрения наблюдается небольшое повышение продуктивности растений, обусловленное тем, что большая часть гуматов, содержащаяся в биогумусе, находится в неактивном состоянии и не вовлекается в обмен веществ растения.

Изобретение позволяет повысить продуктивность растений за счет синергетического эффекта от двойного активирования гуминосодержащей основы, а также повысить содержание жизнеспособных клеток при длительном хранении удобрения за счет подавления жизнедеятельности микрофлоры, присутствующей в торфе и биогумусе и введения штамма, устойчивого к высокощелочной среде.

Это достигается в бактеризованном удобрении, включающем гуминосодержащую основу из биогумуса и бактериальную добавку, обладающую фунгицидной активностью. Новым является то, что оно дополнительно содержит аммиачную воду или мочевину, а в качестве гуминосодержащей основы - торф, при следующем соотношении компонентов, вес. ч:
Торф - 100
Биогумус - 10-50
Аммиачная вода или мочевина с содержанием общего азота - 2,0-10,0
при этом бактериальная добавка выбрана из групп бактерий Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus polymyxa с сохранением жизнеспособности в аммиачной среде с рН не менее 9, в количестве 7,5•10⁴-7,5•10⁸ кл/г гуминосодержащей основы.

Бактеризованное удобрение может включать в качестве бактериальной добавки бактерии Bacillus cereus, штамм 138Д, а также бактерии Bacillus subtilis, штамм Д-606 и бактерии Bacillus polymyxa, штамм 375Д. Эти бактерии обладают наиболее выраженным ингибирующим действием по отношению к фитопатогенным грибам, сохраняя при длительном хранении жизнеспособность в условиях высоких концентраций аммиака.

Бактеризованное удобрение может дополнительно содержать 4,5-7,0 вес. ч. доломитовой муки в качестве источника кальция и магния или мела, источника кальция, что влияет на повышение продуктивности растений.

Использование в составе аммиачной воды или мочевины с содержанием общего азота 2,0-10,0 вес. ч. влияет на состояние естественной микрофлоры, содержащейся в торфе и биогумусе. Кроме того, они являются источником азота. Более высокие концентрации азота оказывают ингибирующее действие на всходы овощных культур, а более низкие несущественно влияют на рост растений.

Были проведены исследования, в результате которых определилось состояние естественной микрофлоры смеси биогумус-торф (торф 100 вес. ч. = 1 кг, биогумус 30 вес. ч. = 0,3 кг) до и после обработки ее раствором аммиака и последующего хранения при комнатной температуре в течение 12 месяцев. Для этого 1,3 кг смеси биогумуса и торфа обрабатывались технической аммиачной водой в количестве 20 г, что в пересчете на общий азот составляет 2,3 вес. ч. Затем периодически отбирали пробу и подсчитывали количество микроорганизмов методом серийного разведения.

Результаты опытов приведены в таблице 1.

Из таблицы 1 видно, что в смеси, не обработанной аммиачной водой, содержание бактерий и грибов со временем увеличивается. В смеси, обработанной аммиачной водой, к 12 месяцам хранения грибы отсутствуют, а бактерии присутствуют в незначительном количестве. Таким образом, аммиак оказывает стерилизующее действие на естественную микрофлору смеси торф-биогумус: грибы погибают полностью, а количество бактериальной флоры уменьшается в 15-20 раз. Это создает благоприятные условия для развития и сохранения вводимой (интродуцируемой) культуры бактерий при условии ее устойчивости к аммиаку и соответствующих высоких значений рН 9-11.

Кроме этого, аммиак (мочевина) активирует органическое вещество субстрата-носителя и почвы (Тишкевич А.В. Теория и практика аммонизации торфа, Минск, Наука и техника, 1972, с.170), что благоприятствует росту растений.

Наличие торфа, который является структурирующим материалом в удобрении, уменьшает его слеживаемость, обеспечивая аэрацию (обмен СО₂ и О₂) внесенным бактериям, что имеет решающее значение в поддержании их жизнеспособности.

В процессе определения оптимального состава гуминосодержащих веществ, которые должны служить субстратом-носителем, было установлено, что именно смесь торфа и биогумуса в соотношении вес. ч. торф 100, биогумус 10-50 является оптимальной для роста и сохранения вводимых бактерий. Предварительно торф и биогумус раздельно обрабатывали аммиачной водой с концентрацией аммиака 25%. Аммиачная вода бралась в количестве 20 г к весу торфа 1000 г, что соответствует содержанию общего азота 5,0 вес. ч. и 8 г к весу биогумуса 30 г, что соответствует содержанию общего азота 2,0 вес. ч. Исследования проводились также на смеси, составленной из 1000 г торфа и 20 г биогумуса. Аммиачная вода в этом случае бралась в количестве 14 г на общий вес смеси 1020 г, что в пересчете на общий азот составило 3,0 вес. ч.

В полученную таким образом смесь вводили культуру отобранной бактерии Bacillus cereus, штамм 138Д в количестве 5,0•10⁶ кл/г гуминосодержащей основы (торф и биогумус).

Состав выдерживался 3-12 месяцев и определялось количество жизнеспособных бактерий. рН состава составляло 10. Эта же культура вводилась в обработанные аммиаком биогумус и торф (таблица 2.)
Значение рН состава при этом достигает 10-11. Проведенные исследования для разных соотношений компонентов торфа и биогумуса, показали, что наибольшее количество жизнеспособных клеток содержится в бактеризованном удобрении с соотношением компонентов, вес. ч.: торф 100, биогумус 10-50.

Подобные результаты были получены в опытах с использованием мочевины и штаммов Bacillus subtilis, штамм 606Д и Bacillus polymyxa, штамм 375Д.

Среди ряда микроорганизмов, подавляющих жизнедеятельность грибных и, в меньшей степени, бактериальных фитопатогенов, большая роль отводится споровым бактериям рода Bacillus. Однако состав содержит высокую концентрацию аммиака (мочевины) и соответственно значение рН 10-11, что ограничивает круг жизнеспособных в таких условиях микроорганизмов, потому что, как известно, все бактерии рода Bacillus предпочитают рН 7,0-8,0 см (Смирнов В.В. и др. Спорообразующие аэробные бактерии - продуценты биологически активных веществ, Киев, Наукова думка, 1982, стр.116).

Многие штаммы рода Bacillus, видов subtilis, cereus, polymyxa обладают фунгицидной способностью, однако в известных источниках не содержится сведений о том, что какие-либо из них обладают также и устойчивостью к высокой щелочности среды рН 9-1 (алкалофильность).

Были проведены исследования фунгицидных свойств и устойчивости в аммиачной среде с рН 10 разных штаммов этих бактерий из коллекции Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии (ВНИИСХМ). Использовали также бактерии рода Bacillus, выделенные из почв различных регионов России, а также из почв Вьетнама, Китая, Индии. Все они тестировались по отношению к тест-грибам Fusarium Culmorun и Fusarium oxysporum, являющихся основными патогенами культурных растений.

С этой целью Fusarium Culmorum высевался газоном на агаризованную среду, состоящую из отвара отрубей с мелом. Одновременно методом "колодцев" в указанную среду вносилась пятисуточная культура испытуемых бацилл.

Штаммы отбирались по величине зоны ингибирования (подавления) роста испытуемого тест-гриба. У перспективных штаммов определялась стабильность титров при выдерживании бацилл в 20% растворе аммиачной воды в течение одного месяца, при комнатной температуре 20^oC. За 100% принималось первоначальное количество бацилл. Остаточное количество жизнеспособных клеток определяли методом высева на питательную среду (МПА) с мясо-пептонным агаром (таблица 3).

Из 72 исследованных культур были отобраны штаммы (1-15), совмещающие свойства высокой устойчивости к концентрированным растворам аммиака или мочевины (20-25%) и сохраняющие фунгицидность.

Бациллы, обитающие в гуминосодержащей основе (субстрате) предлагаемого состава, активно развиваются и в течение длительного времени остаются жизнеспособными, сохраняя высокое значение титра.

Из таблицы 3 также видно, что бактерии Bacillus cereus, штамм 138Д, Bacillus subtilis, штамм Д-606 и Bacillus polymyxa, штамм 375Д обладают наиболее выраженным ингибирующим действием по отношению к фитопатогенным грибам, сохраняя при длительном хранении жизнеспособность в условиях высоких концентраций аммиака.

Количество бацилл 7,5•10⁴-7,5•10⁸ кл/г гуминосодержащей основы обеспечивает высокую продуктивность растений и позволяет сохранить жизнеспособность клеток при длительном хранении (не менее 12 месяцев). Внесение бацилл с более высокими титрами приводит к их относительно быстрому отмиранию, что объясняется эффектом автоингибирования. Более низкие титры оказывают незначительное воздействие на продуктивность растений.

Бациллам, сохраняющим жизнеспособность при предельно высоких значениях рН, свойственна высокая биологическая буферность, т.е. в данном случае способность активно метаболизировать гуматы и другие потенциально активные вещества торфа, биогумуса, а также почвы.

В результате чего имеет место двойное активирование (аммиачное и бактериальное), наблюдается синергетический эффект по отношению к продуктивности растений, обусловленный поступлением большого количества гуматов непосредственно из торфа, биогумуса и почвы, а также метаболизированных гуматов и потенциально активных веществ (белков, углеводов, минеральных компонентов). Существенно повышается устойчивость растений к фитопатогенам, обитающим в почве.

Синергетическая эффективность компонентов питательного состава исследовалась в Ленинградской области в 1998-99 гг. Полевые опыты проводились по следующей схеме: эквивалентное количество по числу бактерий Bacillus cereus вносили в почву и перемешивали. Использовали препарат Bacillus cereus, штамм 138Д в жидкой форме (культуральная жидкость) и в виде удобрение (таблица 4).

Из таблицы 4 видно, что в варианте 3 продуктивность растений под воздействием предлагаемого удобрения существенно возрастает.

Бактеризованное удобрение получают следующим образом.

Приготавливают смесь биогумуса, рН которого составляет 7,0-7,5, и торфа с рН 4,0-5,0. Могут быть выбраны кислые торфы, что снижает в них присутствие исходной бактериальной микрофлоры. Биогумус получают одним из известных способов, например вермикомпостированием (Вермикомпостирование - производство и применение биогумуса, Екатеринбург, Уральский НИИ сельского хозяйства, 1992) с последующим отделением биогумуса от червей. Торф и биогумус смешивают в пропорции на 100 вес. ч. торфа 10-50 вес. ч. биогумуса. Далее в смесь вносят аммиачную воду или мочевину. Аммиачная вода может быть внесена концентрацией 20-25% в количестве, соответствующем содержанию общего азота - 2,0-10,0 вес. ч.

Аммиачной водой можно обработать биогумус и торф в отдельности, а затем их смешать. Возможен вариант, когда смешивание торфа и биогумуса ведут в присутствии аммиачной воды или мочевины.

Мочевина так же, как и аммиачная вода, может быть внесена отдельно в биогумус или торф, а также при их смешении.

Мочевину вносят в количестве, соответствующем содержанию общего азота - 2,0-10,0 вес. ч.

Затем практически стерильную массу инокулируют жидкой культурой, выбранной из групп бактерий: Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus polymyxa в количестве 7,5•10⁵-7,5•10⁶ кл/г гуминосодержащей основы (торф и биогумус). Эти бактерии совмещают свойства высокой устойчивости к концентрированным растворам аммиака или мочевины (20-25%) и сохранения фунгицидности.

Количество бацилл 7,5•10⁴-7,5•10⁸ кл/г гуминосодержащей основы обеспечивает высокую продуктивность растений и позволяет сохранить жизнеспособность клеток при длительном хранении (не менее 12 месяцев).

Бактерии, используемые для приготовления удобрения, отбираются из данного вида бацилл по показателю жизнеспособности спор и вегетативных клеток в количестве не менее 50% от исходного количества, при выдерживании их в аммиачной среде с рН не менее 9, в течение 1 месяца при t=28-35^oС.

Показатель жизнеспособности может быть и менее 50%. В этом случае количество жизнеспособных клеток при длительном хранении удобрения снижается.

Таким образом получают удобрение со следующим соотношением компонентов, вес. ч: гуминосодержащая основа (Торф-100; Биогумус 10-50); аммиачная вода или мочевина с содержанием общего азота 2,0-10,0; бактериальная добавка, выбранная из групп бактерий: Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus potymyxa с сохранением жизнеспособности в аммиачной среде с рН не менее 9, в количестве 7,5•10⁴-7,5•10⁸ кл/г гуминосодержащей основы.

Бактеризованное удобрение может включать в качестве бактериальной добавки бактерии Bacillus cereus, штамм 138Д, а также бактерии Bacillus sublilis штамм Д-606 и бактерии Bacillus polymyxa, штамм 375Д. Эти бактерии обладают наиболее выраженным ингибирующим действием по отношению к фитопатогенным грибам, сохраняя при длительном хранении жизнеспособность в условиях высоких концентраций аммиака.

При добавлении каждого компонента ведут перемешивание в течение 3-5 минут, например в шнековом смесителе.

Бактеризованное удобрение может дополнительно содержать 4,5-7,0 вес. ч. доломитовой муки в качестве источника кальция и магния или мела, источника кальция, что влияет на повышение продуктивности растений.

Каждый из этих компонентов также может быть введен на любой стадии процесса.

Пример 1
К 70 кг (100 вес. ч.) торфа древесо-осокового с рН 5,5 добавляют 5 кг (7 вес. ч.) доломитовой муки и перемешивают в шнековом смесителе в течение 3-5 минут, затем 20 кг (30 вес. ч.) биогумуса и 5 л аммиачной (технической) воды с концентрацией 25%, в пересчете на общий азот - 2 вес. ч.

Полученную стерильную массу инокулируют 1 литром жидкой культуры Bacillus cereus, штамм 138Д, депонированной в коллекции Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии (ВНИИСХМ) в количестве 7,5•10⁵ кл/г питательной основы.

Показатель жизнеспособности спор и вегетативных клеток этой культуры 50% от исходного количества, при выдерживании их в аммиачной среде с рН 9 в течение 1 месяца, при t=28^oС.

Таким образом получают удобрение следующего состава, вес. ч.:
Торф - 100
Биогумус - 30
Аммиачная вода с содержанием общего азота - 2
Бактерии Bacillus cereus, штамм 138Д - 7,5•10⁵ кл/г гуминосодержащей основы
Доломитовая мука - 7
Бактериальное удобрение имеет рН 10.

Удобрение упаковывают в полиэтиленовые пакеты или другую герметичную тару и сохраняют при комнатной (складской) температуре. Количество жизнеспособных клеток после 10 месяцев хранения составило 7,0•10⁷ кл/г. Удобрение внесли в почву (1:4 по объему) с посевами моркови. Урожайность составила 290 ц/га.

Пример 2
К 70 кг (100 вес. ч.) торфа древесо-осокового с рН 5,5 добавляют 20 кг (30 вес. ч. ) биогумуса и 5 л аммиачной (технической) воды с концентрацией 25% в пересчете на общий азот 1,9 вес. ч., перемешивают в шнековом смесителе в течение 3-5 минут. Полученную стерильную массу инокулируют 1 литром жидкой культуры Bacillus subtilis, штамм Д-606, депонированной в коллекции Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии (ВНИИСХМ), в количестве 10,5•10⁵ кл/г гуминосодержащей основы (торф и биогумус). Показатель жизнеспособности спор и вегетативных клеток этой культуры 50% при выдерживании их в аммиачной среде с рН 9 в течение 1 месяца, при t=28^oС.

Таким образом получают удобрение следующего состава, вес. ч.:
Торф - 100
Биогумус - 30
Аммиачная вода с содержанием общего азота - 1,9
Бактерии Bacillus subtilis, штамм 606Д - 10,5•10⁵ кл/г гуминосодержащей основы
Бактериальное удобрение имеет pH 10,5.

Удобрение упаковывают в полиэтиленовые пакеты или другую герметичную тару и сохраняют при комнатной (складской) температуре. Количество жизнеспособных клеток после 12 месяцев хранения составило 5,0•10⁷ кл/г. Удобрение внесли в почву, в которую произвели посев капусты. Урожайность составила 440 ц/га.

Пример 3
К 70 кг (100 вес. ч.) торфа древесо-осокового с рН 5,5 добавляют 35 кг (50 вес. ч. ) биогумуса и 5 л аммиачной (технической) воды с концентрацией 25% в пересчете на общий азот 10 вес. ч., перемешивают в шнековом смесителе в течение 3-5 минут. Полученную стерильную массу инокулируют 1 литром жидкой культуры Bacillus polymyxa, штамм 375Д, депонированной в коллекции Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии (ВНИИСХМ), в количестве 7,5•10⁶ кл/г гуминосодержащей основы (торф и биогумус). Показатель жизнеспособности спор и вегетативных клеток этой культуры 50% при выдерживании их в аммиачной среде с рН 9 в течение 1 месяца, при t=28^oC.

Таким образом получают удобрение следующего состава вес. ч.:
Торф - 100
Биогумус - 50
Аммиачная вода с содержанием общего азота - 10
Бактерии Bacillus subtilis, штамм 606-Д - 10,5•10⁵ кл/г гуминосодержащей основы
Бактериальное удобрение имеет pH 11.

Удобрение упаковывают в полиэтиленовые пакеты или другую герметичную тару и сохраняют при комнатной (складской) температуре. Количество жизнеспособных клеток после 12 месяцев хранения составило 7,0•10⁵ кл/г. Удобрение внесли в почву, в которой произвели посев свеклы. Урожайность составила 170 ц/га.

Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано при производстве почвогрунтов и удобрений на основе торфа и биогумуса. Изобретение позволяет повысить продуктивность растений и содержание жизнеспособных клеток при длительном хранении удобрения. Это достигается в бактеризованном удобрении, включающем гуминосодержащую основу из биогумуса и бактериальную добавку, обладающую фунгицидной активностью, выбранную из группы бактерий Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus polymyxa с сохранением жизнеспособности в аммиачной среде с рН не менее 9, в количестве 7,5•10⁴-7,5•10⁸ кл/г гуминосодержащей основы. Удобрение дополнительно содержит аммиачную воду или мочевину, а в качестве гуминосодержащей основы - торф. 4 з.п. ф-лы, 4 табл.

1. Бактеризованное удобрение, включающее гуминосодержащую основу из биогумуса и бактериальную добавку, обладающую фунгицидной активностью, отличающееся тем, что оно дополнительно содержит аммиачную воду или мочевину, а в качестве гуминосодержащей основы - торф при следующем соотношении компонентов, вес. ч. :
Торф - 100
Биогумус - 10-50
Аммиачная вода или мочевина с содержанием общего азота - 2,0-10,0
при этом бактериальная добавка выбрана из групп бактерий: Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus polymyxa с сохранением жизнеспособности в аммиачной среде с рН не менее 9, в количестве 7,5•10⁴-7,5•10⁸ кл/г гуминосодержащей основы. 2. Бактеризованное удобрение по п. 1, отличающееся тем, что в качестве бактериальной добавки оно содержит бактерии Bacillus cereus, штамм 138Д. 3. Бактеризованное удобрение по п. 1, отличающееся тем, что в качестве бактериальной добавки оно содержит бактерии Bacillus subtilis, штамп Д-606. 4. Бактеризованное удобрение по п. 1, отличающееся тем, что в качестве бактериальной добавки оно содержит бактерии Bacillus polymyxa, штамм 375Д. 5. Бактеризованное удобрение по п. 1, отличающееся тем, что оно дополнительно содержит 4,5-7,0 вес. ч. доломитовой муки или мела.