СПОСОБ БИОЛОГИЧЕСКОЙ РЕКУЛЬТИВАЦИИ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННОЙ ПОЧВЫ Российский патент 2007 года по МПК C12N1/20 B09C1/10 C12R1/85 

Изобретение относится к почвоведению, землепользованию и экологии, а именно к способу проведения биологической рекультивации нефтезагрязненной почвы с использованием биопрепаратов-нефтедеструкторов на основе микробных удобрений (ферментированных отходов сельскохозяйственного производства) и на основе микроорганизмов-деструкторов (бактерий рода Bacillus), и используется для очистки загрязненной нефтью и нефтепродуктами почвы при одновременном восстановлении ее физико-химических свойств и естественного биоценоза.

Известны бактериальные культуры p.Bacillus, для которых характерна способность продуцировать антибиотические вещества и подавлять рост фитопатогенных микроорганизмов, см. Junge H., Krebs S., Frier К.// Mitt.Biol. Land - und Frostwirt. Berlin-Dahlem. - 1990. - №226.

Известно бактеризованное удобрение, включающее гуминосодержащую основу и бактериальную добавку из группы бактерий: Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus polymyxa, RU №2186049 C2, C05F 11/08, C12N 1/20, C12R 1/07, 2002.07.27. В бактериальной добавке использованы культуры бактерий штамма Bacillus cereus, штамма 138Д в количестве 5,0·10⁶ клеток/г основы.

Известны штаммы бактерий, используемые для очистки почвы и воды от нефтяных загрязнений, в частности Bacillus sp., RU №2083667 C1, C12N 1/20, В09С 1/10, C02F 3/34, 1997.07.10; RU №2115629 C1, C02F 3/34, В09С 1/10, 1998.07.20; RU №2182529 C1, B09C 1/10, C02F 3/34, C12N 1/20, C12N 1/26, 2002.05.20; RU №2204597 C2, C12N 1/20, C02F 3/34, B09C 1/10, C12N 1/20, 2003.05.20.

Известен способ очистки почвы от загрязнения нефтью и нефтепродуктами, включающий введение в торф культуры микроорганизмов и минеральных добавок, содержащих азот и фосфор, RU №2137559 C1, B09C 1/10, В09С 1/08, 1999.09.20.

Известен способ очистки почвы от нефти и нефтепродуктов, включающий введение бактериальной культуры в смеси с удобрением, RU №2041172 С1, C02F 3/34, Е02В 15/04, C12N 1/20, 1995.08.09.

Известен способ очистки воды и почвы от нефтяных загрязнений, включающий внесение биомассы нефтеокисляющих бактерий и удобрений, RU №2039714 C2, C02F 3/34, C12N 1/20, 1995.07.20.

Известен способ рекультивации почвы, загрязненной нефтепродуктами, путем внесения в почву добавки в виде активного ила биологических очистных сооружений, RU №2183142 С2, В09С 1/10, 2002.06.10.

Известен способ рекультивации почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, путем обработки почвы бактериальным препаратом на основе природного штамма бактерий рода Bacillus, RU №2077397 C1, B09C 1/10, C09K 3/32, C12N 1/20, 1997.04.20.

Все известные способы требуют длительных сроков проведения рекультивации, а используемые биопрепараты обладают низкой деструктирующей способностью.

Известен способ очистки нефтезагрязненных почв, включающий известкование, внесение минеральных удобрений, обработку загрязненных участков биопрепаратом-нефтедеструктором, содержащим микробное удобрение-носитель в виде ферментированных отходов сельскохозяйственного производства и культуру бактерий, иммобилизованную на носитель, внесение семян и боронование, Архипченко И.А., Загвоздкин В.К. Очистка нефтезагрязненных почв с помощью биопрепаратов на основе микробных удобрений//Экология и промышленность России. Спецвыпуск. 2004. С.16-18.

Данное техническое решение принято в качестве ближайшего аналога настоящего изобретения.

Однако оно обладает недостатком.

Нефтедеструктирующая активность применяемых микробных удобрений недостаточная для того, чтобы проводить биологическую рекультивацию в районах с коротким тепловым периодом.

В основу настоящего изобретения положено решение технической задачи, позволяющей повысить технологичность проведения биологической рекультивации и сократить время рекультивации нефтезагрязненных почв в условиях Крайнего Севера, за счет применения биопрепарата-нефтедеструктора комплексного действия:

- с высокой нефтедеструктирующей активностью,

- с положительными свойствами минеральных и органических удобрений.

Согласно изобретению эта задача решается за счет того, что способ биологической рекультивации нефтезагрязненной почвы в природных условиях Крайнего Севера включает известкование, внесение минеральных удобрений, обработку загрязненных участков биопрепаратом-нефтедеструктором, содержащим микробное удобрение-носитель в виде ферментированных отходов сельскохозяйственного производства и культуру бактерий, иммобилизованную на носитель, внесение семян и боронование.

Обработку проводят сухим биопрепаратом-нефтедеструктором один раз в сезон в течение теплого периода в дозе 100 г/м², а в качестве культуры бактерий используют штамм Bacillius cereus 3 К. с титром 10¹² клеток/г носителя, при этом биопрепарат-нефтедеструктор разбрасывают при внесении семян или перед ним с последующим боронованием на глубины 5-10 см.

Заявителем не выявлены источники, содержащие информацию о технических решениях, идентичных настоящему изобретению, что позволяет сделать вывод о его соответствии критерию «новизна».

За счет реализации отличительных признаков изобретения /в совокупности с признаками, указанными в ограничительной части формулы/ достигаются важные новые свойства объекта.

В предложенном техническом решении:

- использование биопрепарата-нефтедеструктора повышает технологичность биологической рекультивации;

- наличие у биопрепарата-нефтедеструктора высокой нефтедеструктирующей активности способствует улучшению процессов восстановления почвы и сокращению сроков проведения рекультивации;

- иммобилизация культуры бактерий штамма Bacillus cereus 3 К. на микробное удобрение-носитель повышает нефтедеструктирующую активность и обеспечивает получение перспективной технологии создания сухих сыпучих биопрепаратов-нефтедеструкторов высокоэффективных и простых в использовании;

- разбрасывание биопрепарата-нефтедеструктора один раз при внесении семян или перед ним упрощает технологию проведения биологической рекультивации;

- известкование почвы и внесение минеральных удобрений улучшает процесс биологической рекультивации;

- боронование после внесения биопрепарата-нефтедеструктора на глубину 5-10 см способствует повышению деструкции и созданию благоприятных условий для работы нефтеокислительных бактерий;

- использованная доза 100 г/м² биопрепарата-нефтедеструктора является оптимальной.

Заявителю не известны какие-либо публикации, которые содержали бы сведения о влиянии отличительных признаков изобретения на достигаемый технический результат, в связи с этим, по мнению заявителя, можно сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «изобретательский уровень».

Восстановление нефтезагрязненных почв в районах Крайнего Севера сложный и длительный процесс. Это обусловлено климатическими условиями данного региона: коротким вегетационным периодом с низкими среднесуточными температурами.

Загрязнение почв нефтью сопровождается изменениями их химических и агрохимических свойств.

Изучение технологий рекультивации проводилось на участках разлива нефти в условиях Крайнего Севера и на аварийных разливах дизельного топлива Ленинградской области.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Проводят известкование и внесение минеральных удобрений, после чего осуществляют биологическую рекультивацию.

Обработку загрязненных участков проводят сухим биопрепаратом-нефтедеструктором.

Биопрепарат-нефтедеструктор содержит микробное удобрение-носитель и культуру бактерий.

Используют микробное удобрение-носитель в виде ферментированных отходов сельскохозяйственного производства.

В качестве культуры бактерий используют штамм Bacillius cereus 3 К. с титром 10¹² клеток/г носителя.

Обработку проводят один раз в сезон в течение теплого периода.

Внесение биопрепарата-нефтедеструктора осуществляют в дозе 100 г/м².

Биопрепарат-нефтедеструктор разбрасывают при внесении семян трав или перед ним с последующим боронованием на глубины 5-10 см.

В качестве микробного удобрения-носителя используют микробное удобрение Бамил или микробное удобрение Омуг.

Микробное удобрение Бамил в виде высушенной биомассы микроорганизмов активного ила сформировано при переработке отходов свиноводческих комплексов и содержит нативные микроорганизмы: Bacillus pumilus, Bacillus sphaericus, Micrococcus hylae, Arthrobacter viscosus, Bacillus licheniformis.

Иммобилизацию культуры бактерий штамма Bacillus cereus 3 К. на микробное удобрение Бамил осуществляют следующим образом:

- смешивают навозосодержащие сточные воды с рециркуляционным активным илом;

- проводят аэробную переработку при нагрузке на ил 70-225 мг ХПГ/г ч и скорости роста ила 0,01-0,02 ч^-1 до достижения загрязнения сточной воды по ХПК на 40-70%;

- осуществляют отделение избыточного активного ила, его уплотнение и сушку при температуре 170-190°С;

- наращивают бактерии штамма Bacillus cereus 3 К. на плотном сухом питательном агаре в течение 3 суток;

- создают водную суспензию бактерий штамма Bacillus cereus шт. 3 К. с титром 10¹³ клеток/г и распределяют на поверхности 1 м² 1 кг сухого микробного удобрения Бамил;

- распрыскивают 100 мл суспензии бактерий штамма Bacillus cereus шт. 3 К. с титром 10¹³ клеток/г.

Полученный биопрепарат-нефтедеструктор содержит культуру бактерий штамма Bacillus cereus 3 К. с титром 10¹² клеток/г микробного удобрения Бамил.

Иммобилизация культуры бактерий штамма Bacillus cereus 3 К. на микробное удобрение Бамил способствует созданию сухого сыпучего биопрепарата-нефтедеструктора.

Микробное удобрение Омуг в виде ферментированного подстилочного птичьего помета содержит нативные микроорганизмы: Clavibacter michiganese, Bacillus amyloliquefaciens, Micrococcus varians.

Иммобилизацию культуры бактерий штамма Bacillus cereus 3 К. на микробное удобрение Омуг осуществляют следующим образом:

- проводят аэробную ферментацию термофильными бактериями отходов птицеводческих хозяйств (подстилочного птичьего помета), которая активизирует рост аэробной микрофлоры;

- добавляют минеральные удобрения (NPK) массой около 2% от массы перерабатываемого материала;

- обеспечивают активацию жизнедеятельности за счет оптимизации влажности исходной смеси (40-60%), поддержания высокой пористости (20-30%);

- поддерживают температуру обработки смеси за счет тепла, выделенного при окислении органического вещества обрабатываемого материала;

- наращивают бактерии штамма Bacillus cereus 3 К. на плотном сухом питательном агаре в течение 3 суток;

- создают водную суспензию бактерий штамма Bacillus cereus 3 К. с титром 10¹³ клеток/г и распределяют на поверхности 1 м² 1 кг сухого микробного удобрения Омуг;

- распрыскивают 100 мл суспензии бактерий штамма Bacillus cereus 3 К. с титром 10¹³ клеток/г.

Полученный биопрепарат-нефтедеструктор содержит культуру бактерий штамма Bacillus cereus 3 К. с титром 10¹² клеток/г микробного удобрения Омуг.

Иммобилизация культуры бактерий штамма Bacillus cereus 3 К. на микробное удобрение Омуг способствует созданию сухого сыпучего биопрепарата-нефтедеструктора.

Культура бактерий штамма Bacillus cereus шт. 3 К. депонирована в ГНУ ВНИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ микробиологии РАСХН и ООО НТЦ «Ника», 2003 г. (дата заполнения 25.11.03).

Штамм Bacillus cereus шт. 3 К. депонирован в качестве производственного штамма для изготовления биопрепарата-нефтедеструктора под регистрационным номером «ВНИИСХМ Д143» от 24 декабря 2003 г.

Культура бактерий штамма Bacillus cereus 3 К. выделена из техногенной почвы, загрязненной дизельным топливом (г. Санкт-Петербург).

Из техногенной почвы на территории Кировского завода в районе ТЭЦ (г. Санкт-Петербург) были взяты образцы. Выделение проводили посевом (методом серийных разведений) на плотную питательную среду Придхем-Готлиба, в которой единственным источником углерода использована сырая нефть.

Условия культивирования - рост обильный, на питательной среде с панкриатическим гидролизом кильки (СПА), температура 25-27°С, аэроб.

Пигментация культуры - отсутствует.

Форма колоний - амебоидная, неправильной формы, профиль плоский, край волнистый, складчатая, беловатая.

Форма и размер вегетативных клеток - палочки, палочки с закругленными концами, размером 0,6-0,8×1,9-2,6 мкм.

Спорообразование - споры эллипсовидные, расположение центральное, не изменяют форму клетки, размером 0,6-0,8×1,2-2,1 мкм.

Подвижность клеток - подвижность в вегетативном состоянии.

Жгутикование - перетрихиальное.

Окрашивание по Грамму - Грам⁺.

Отношение к источнику углерода - утилизирует мальтозу, сахарозу, маннозу, глюкозу, лактозу, инозан, рацимозу, сорбит, ксилозу, арабинозу, глицерин, маннит, галактозу, рамнозу.

Отношение к источнику азота - хороший рост на средах с минеральными и органическими источниками азота (NH₃·NO₃), пептон, аспаратин).

Другие диагностические признаки - образует каталазу, лицетиназу; реакция Вогес-Проскауэра - положительная, индол не образует, глюкозу использует слабо без образования газа, рост при 60°С отсутствует, ризоидные колонии и параспоральные включения.

Культура бактерий штамма Bacillus cereus 3 К. обладает высокой углеводородокисляющей активностью: способна утилизировать сырую нефть в почве. Штамм Bacillus cereus 3 К. используют в биопрепарате-нефтедеструкторе на основе микробных удобрений Бамил и Омуг.

В качестве аналога используют биопрепарат Родер. Биопрепарат Родер вводят в нефтезагрязненную почву два раза в месяц. Биопрепарат Родер состоит из нефтеокисляющих микроорганизмов Rhodococcus ryber AC-1513 D Rhodococcus erythropolis AC-1514 D в виде концентрированной суспензии клеток бактерий с титром 10¹² /мл, разбавляемой водой при соотношении 1:40, соответственно, при t=25-30°С с добавлением 0,2% минерального удобрения (N, P, K).

Способ биологической рекультивации осуществляют на заболоченном торфяном участке аварийного разлива нефти в окрестностях г. Усинска, расположенного в Усинско-Колвинском елово-лесотундровом округе в подзоне лесотундры и крайнесеверной тайги Печерско-Уральской подпровинции.

Закладку полевого эксперимента нефтью проводят на опытном участке площадью 2000 м² (доза загрязнения в пределах 17 - 110 г/кг) и после внесения минерального удобрения (N, P, K) определяют: участок для контроля (без внесения биопрепарата-нефтедеструктора), участок для внесения биопрепарата Родер, участок для внесения биопрепарата-нефтедеструктора на основе микробного удобрения Омуг и участок для внесения биопрепарата-нефтедеструктора на основе микробного удобрения Бамил.

Сущность изобретения поясняется примерами.

ПРИМЕР 1.

Определяют нефтедеструктирующую активность нефтезагрязненной почвы опытных участков.

Проводят анализ нефтедеструктирующей активности почвенных бактерий методом флуоресцентной спектроскопии.

Динамика нефтедеструктирующей активности в нефтезагрязненной почве в зависимости от внесения биопрепарата-нефтедеструктора на основе микробного удобрения Бамил представлена в таблице 1.

Из таблицы 1 видно, что бактерии микроорганизмов биопрепаратов утилизировали нефть на уровне природных микроорганизмов - алканотрофов при дозе нефти 17 г/кг, а при дозе 110 г/кг нефть разрушалась наибоолее эффективно при использовании биопрепарата-нефтедеструктора на основе микробного удобрения Бамил.

ПРИМЕР 2.

Численность бактерий-алканотрофов в нефтезагрязненной почве опытных участков определяют методом Коха: посев почв на питательную среду Придхем-Готлиба. В качестве единственного источника углерода используют нефть - 1%.

Минеральная среда Придхем-Готлиба, г/л: (NH₄)₂SO₄ - 2,64; К₂HPO₄ - 5,65; КН₂PO₄ - 2,38; MgSO₄·7Н₂О - 1,0; CuSO₄ - 0,064; FeSO₄ - 0,01; MnCl₂ - 0,079; ZnSO₄ - 0,015.

Динамика численности бактерий-алканотрофов в нефтезагрязненной почве в зависимости от внесения биопрепаратов-нефтедеструкторов на основе микробных удобрений Бамил и Омуг представлена в таблице 2.

Из таблицы 2 очевидно, что в нефтезагрязненной почве с внесенными биопрепаратами численность бактерий увеличилась в среднем на 3 порядка по сравнению с контролем.

ПРИМЕР 3.

Биологическую активность опытных участков оценивают по интенсивности выделения CO₂.

СО₂ определяют через месяц после внесения в нефтезагрязненную почву биопрепаратов-нефтедеструкторов на основе микробных удобрений Бамил и Омуг газохроматографическим методом.

Навеску почвы массой 20 г (в расчете на абсолютно сухой вес) помещают в склянки объемом 120 мл, закрывают ватной пробкой и инкубируют во влажной камере при температуре 27°С. Интенсивность выделения СО₂ определяют через 3 суток. Для этого склянки «промывают» сжатым воздухом в течение 3 минут и герметически закрывают пластмассовыми крышками с эластичной резиновой прокладкой. Инкубируют 24 часа в термостате при температуре 27°С. После этого медицинским шприцом отбирают пробы газа объемом 0,5 мл и вводят их в приемник газового хроматографа Хром-4, предварительно делают его калибровку. Для хроматографии используют сорбционные колонки из нержавеющей стали длиной 120 см с внутренним диаметром 2 мм, наполненные сорбентом полисорб-1. В качестве газа применяют гелий, который пропускают со скоростью 20 мм/мин. Температура термостата детектора 100°С. Температура камеры и колонок 20-22°С. Выход СО₂ происходит на 48-й секунде, на хроматографе появляется четкий пик, фиксирующий выход СО₂.

Интенсивность выделения СО₂ в нефтезагрязненной почве в зависимости от внесения биопрепаратов-нефтедеструкторов на основе микробных удобрений Бамил и Омуг представлена в таблице 3.

Из таблицы 3 видно, что обработка нефтезагрязненной почвы биопрепаратами-нефтедеструкторами на основе микробных удобрений Бамил и Омуг активизировала выделение СО₂ на 20-35% по сравнению с контролем, что характеризует интенсивность окисления соединений углерода в почве, но наиболее успешно активировал их биопрепарат-нефтедеструктор на основе микробного удобрения Бамил.

Приведенные примеры подтверждают, что проведение биорекультивации с использованием биопрепаратов-нефтедеструкторов на основе микробных удобрений Бамил и Омуг повышает численность бактерий, разлагающих нефть, интенсифицирует окисление углеродсодержащих соединений в почве и сокращает восстановительные сроки.

Предложенный способ биологической рециркуляции проводился на участках разлива нефти в условиях Крайнего Севера, и на основании результатов обработки загрязненных нефтью почв с различными степенями загрязнения, наблюдения и изучения периодов активизации восстановления почв можно сделать вывод о соответствии предложенного способа критерию «промышленная применимость».

Биологическая рекультивация при использовании эффективных биопрепаратов-нефтедеструкторов для очистки нефтезагрязненных почв позволяет:

- повысить технологичность биологической рекультивации за счет использования биопрепаратов-нефтедеструкторов;

- улучшить процессы восстановления почвы и сократить сроки проведения рекультивации за счет высокой нефтедеструктирующей способности используемых биопрепаратов-нефтедеструкторов;

- использовать перспективную технологию получения сухих, сыпучих биопрепаратов-нефтедеструкторов за счет иммобилизации культур бактерий штамма Bacillus cereus 3 К. на микробные удобрения-носители;

- упростить технологию проведения биологической рекультивации за счет применения простого способа внесения биопрепаратов-нефтедеструкторов путем разбрасывания при внесении семян или перед ним;

- улучшить процесс биологической рекультивации за счет известкования почвы и внесения минеральных удобрений;

- повысить нефтедеструктирующую активность за счет боронования после внесения биопрепарата-нефтедеструктора на глубину 5-10 см;

- проводить очистку нефтезагрязненных почв в районах с коротким тепловым периодом.

Изобретение относится к биотехнологии, почвоведению, землепользованию и экологии. Способ биологической рекультивации нефтезагрязненной почвы в природных условиях Крайнего Севера осуществляют путем предварительного известкования и внесения минеральных удобрений, обработки загрязненных участков биопрепаратом-нефтедеструктором, содержащим микробное удобрение-носитель в виде ферментированных отходов сельскохозяйственного производства и культуру бактерий, иммобилизованную на носитель, последующего внесения семян и боронования. Обработку проводят сухим биопрепаратом один раз в сезон в течение теплого периода в дозе 100 г/м², в качестве культуры бактерий используют штамм Bacillus cereus 3 К. с титром 10¹² клеток/г носителя. При этом биопрепарат разбрасывают при внесении семян или перед ним с последующим боронованием на глубину 5-10 см. Изобретение позволяет повысить технологичность биологической рекультивации, улучшить процессы восстановления почвы и сократить сроки проведения рекультивации, использовать перспективную технологию получения сухих, сыпучих биопрепаратов-нефтедеструкторов, упростить технологию проведения биологической рекультивации, проводить очистку нефтезагрязненных почв в районах с коротким тепловым периодом. 3 табл.

Способ биологической рекультивации нефтезагрязненной почвы в природных условиях Крайнего Севера, включающий известкование, внесение минеральных удобрений, обработку загрязненных участков биопрепаратом-нефтедеструктором, содержащим микробное удобрение - носитель в виде ферментированных отходов сельскохозяйственного производства и культуру бактерий, иммобилизованную на носитель, внесение семян и боронование, отличающийся тем, что обработку проводят сухим биопрепаратом-нефтедеструктором один раз в сезон в течение теплого периода в дозе 100 г/м², в качестве культуры бактерий используют штамм Bacillus cereus 3 К. с титром 10¹² клеток/г носителя, при этом биопрепарат-нефтедеструктор разбрасывают при внесении семян или перед ним с последующим боронованием на глубину 5-10 см.