СПОСОБ ОЦЕНКИ МОРОЗОСТОЙКОСТИ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ Российский патент 2003 года по МПК A01H1/04 

Изобретение относится к области сельского хозяйства /селекция растений/ и может быть использовано для оценки морозостойкости селекционного материала и новых сортов озимой пшеницы.

Известны способы определения морозостойкости, в основе которых лежит изменчивость электропроводности растительных тканей [1] , интенсивности сверхслабого свечения [2] и накопление в листьях связанной воды [3].

Для реализации названных способов требуется наличие современной лаборатории, оснащенной сложным оборудованием, а также высокая квалификация исполнителей, что существенно препятствует их широкому использованию в селекционном процессе.

Известен также широко распространенный в селекционной практике лабораторный метод оценки морозостойкости озимых, предусматривающий ступенчатое промораживание проросших семян растений с последующим вычислением процента их выживаемости при промораживании [4] - прототип.

Между тем, указанный метод отличается существенными недостатками, главными из которых являются долгосрочность получения результатов и непроизводительный расход ценного селекционного материала, что существенно снижает эффективность селекционного процесса.

Имеются также сведения о том, что морозостойкость форм и сортов культурных растений связана с гидролитической активностью фермента β-фруктофуранозидазы. Причем наиболее морозостойкие растения обладают в период криостресса повышенной ферментативной активностью [5, 6].

Целью предлагаемого изобретения является ускорение процесса получения результатов оценки и экономный расход селекционного материала, а также повышение объективности оценки, так как использование сортов-классификаторов с известной степенью морозостойкости дает возможность детально дифференцировать селекционный материал по степени морозостойкости с выделением при этом трех групп слабо-, средне- и морозостойких форм.

Поставленная цель достигается путем трехнедельного проращивания семян сортов-классификаторов и испытуемых образцов в растильнях на увлажненной многослойной фильтровальной бумаге в термостате при температуре 25^oС и 12-часовом /в сутки/ освещении интенсивностью 7 тыс. лк с последующим определением гидролитической активности фруктофуранозидазы в третьем листе в процессе их ступенчатого промораживания в холодильной камере в режиме: первые сутки при температуре 0...-2^oС, вторые сутки при температуре -5....-7^oС. При этом растения сохраняются для получения из них потомства, что обеспечивает экономию селекционного материала.

Для этого у проростков испытуемых образцов и сортов-классификаторов с помощью лезвия или скальпеля отделяют третий лист.

Растительный материал после гомогенизации с 20-30 мл дистиллированной воды и доведения кислотности раствора с помощью ацетатного буфера до 5,0 и добавления 3-5 г сахарозы настаивают в термостате в течение 10 ч при температуре 40^oС. При этом происходит peaкция гидролиза сахарозы с образованием инвертного сахара.

Количество образовавшихся редуцированных сахаров определяют стандартным колориметрическим методом по Швецову. Оптическую плотность хромофора измеряют на ФЭК-56М с красным светофильтром.

Вычисление содержания сахаров производят по калиброчной кривой, составленной по растворам глюкозы.

Для определения гидролитической активности β-фруктофуранозидазы двухграммовые навески листьев гомогенизируют в 10 мл дистилированной воды до однородной массы с использованием гомогенизатора или растирают в ступке с кварцевым песком. Гомогенат переносят в мерные колбы на 50 мл, доводят дистилированной водой до метки и тщательно перемешивают. После взбалтывания из суспензии отбирают две пробы по 10 мл и переносят в мерные колбы по 100 мл. Одну колбу /контрольную/ нагревают до 100^oС и с целью инактивации фермента кипятят в течение 2 - 3 мин, а затем суспензию охлаждают в ледяной бане. После этого в контрольные и опытные колбы добавляют по 5 мл ацетатного буферного раствора с кислотностью 5,0, по 10 мл 5%-ного свежеприготовленного раствора сахарозы и по 4 капли толуола. Колбы помещают на 2 ч в термостат при температуре 40^oС, после чего добавляют по 2,5 мл 1н. раствора NaOH, по одной капле фенолфталеина и по каплям 10%-ный раствор сернокислого цинка до обесцвечивания индикатора.

Объем раствора доводят дистилированной водой до метки, интенсивно перемешивают и фильтруют. В полученном фильтрате определяют содержание редуцированных сахаров. Для этого в пробирку диаметром 30 мм приливают 5 мл фильтрата; доводят объем водой до 10 мл, затем приливают 10 мл медно-щелочного раствора, интенсивно взбалтывают и помещают на 15 мин в кипящую водяную баню. Реакцию ограничивают погружением пробирок в холодную /2-5^oС/ воду. К охлажденным растворам постепенно добавляют по 5 мл смеси равных объемов щавелевой и серной кислот. Когда закись меди растворится, остаток йода титруют 0,001 н. раствором тиосульфата натрия в присутствии 0,5 мл 0,5%-ного раствора крахмала.

Активность β-фруктофуранозидазы определяют в мг инвертного сахара, образовавшегося в течение 1 ч в 1 г исследуемого образца.

На основании полученных данных производят расчет индексов стойкости, которые вычисляют отношением гидролитической активности фермента в третьем листе после ступенчатого промораживания в названном выше режиме к исходной. В результате сопоставления индексов стойкости, которые выражают степенью повышения активности фермента в третьем листе сортов-классификаторов и испытуемых образцов, дают заключение о принадлежности селекционного образца озимой пшеницы к той или иной группе морозостойкости.

В качестве примера приводится сравнительная оценка морозостойкости селекционного материала озимой пшеницы с помощью традиционного и нового методов /табл./.

Селекционные образцы 2446 и 2093 по результатам оценки отнесены к морозостойким. В то же время образцы 2134 и 2560 проявили себя как среднеморозостойкие, а образцы 2361 и 2209 - слабоморозостойкие, что согласуется с результатами выживаемости проросших семян при промораживании в холодильной камере.

Источники информации
1. Авт. св-во 353684 /СССР/. Способ определения морозостойкости растений /Е.П. Алешин, К.М. Цой, В.А. Куницкий. Опубл. в 1972 г., бюлл. 12.

2. Авт. св-во 488548 /СССР/ Способ определения морозостойкости растений /Б. Н.- М. Китлаев, Г.И. Третьяков, Т.С. Дубоносов и др./. Опубл. в 1975 г., бюл. 29.

3. Патент на изобретение 2145194 /Россия/ Способ оценки морозостойкости растений /А.П. Стаценко., А.А. Галлиулин. Опубл. в 1999 г., бюл. 36.

4. Физиология растений в помощь селекции. М.: Наука, 1974, с. 54-57.

5. Колоша О.И. Криофитофизиологические механизмы адаптации и устойчивости//Физиология и биохимия культ. растений. - 1986. - Т.18. - 6. - с. 555-567.

6. Колоша А.И., Костенко И.И. Водный режим, активность ферментов и морозостойкость озимой пшеницы // Доклады BACXНИЛ. - 1973. - 3.

Изобретение предназначено для использования в области сельского хозяйства в селекции. Способ включает трехнедельное проращивание семян в термостате при 25^oС на увлажненной фильтровальной бумаге при 12-часовом в сутки освещении 7 тыс. лк. При этом в первые сутки после проращивания осуществляют промораживание растений при 0...-2^oС, во вторые сутки при -5...-7^oС с последующим определением гидролитической активности фермента - фруктофуранозидазы. Вычисляют индексы стойкости растений, которые выражают отношением гидролитической активности фермента в третьем листе растений после промораживания к исходной, а также выделяют три группы стойкости: морозостойкую (индекс стойкости 3,00 и выше), среднеморозостойкости (1,51-3,00) и слабоморозостойкую (1,5 и ниже). Для сравнительной оценки морозостойкости используют стандартные сорта-классификаторы. Изобретение позволяет ускорить процесс получения результатов оценки, экономно использовать селекционный материал, повысить объективность оценки. 1 табл.

Способ оценки морозостойкости озимой пшеницы, включающий трехнедельное проращивание семян в термостате при 25^oС на увлажненной фильтровальной бумаге при 12-часовом в сутки освещении 7 тыс. лк, отличающийся тем, что в первые сутки после проращивания осуществляют промораживание растений при 0... -2^oС, во вторые сутки при -5...-7^oС с последующим определением гидролитической активности фермента-фруктофуранозидазы, вычисляют индексы стойкости растений, которые выражаются отношением гидролитической активности фермента в третьем листе растений после промораживания к исходной, а также выделяют три группы стойкости: морозостойкую (индекс стойкости 3,00 и выше), среднеморозостойкости (1,51-3,00) и слабоморозостойкую (1,5 и ниже) и используют для сравнительной оценки морозостойкости стандартные сорта классификаторы.