СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СТЕРОИДРЕЗИСТЕНТНОСТИ У БОЛЬНЫХ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ Российский патент 2003 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к пульмонологии, к способам диагностики стероидрезистентности, и может быть использовано для подбора адекватной дозы препаратов глюкокортикоидных гормонов при лечении больных бронхиальной астмой (БА).

Известен способ диагностики стероидрезистентности у больных БА, согласно которому стероидрезистентными считают пациентов, у которых после 7-дневного курса лечения преднизолоном в дозе не менее 20 мг в сутки объем форсированного выдоха за первую секунду (ОФВ₁) увеличивается менее чем на 15% по сравнению с исходным (Шмушкович Б.И. Клиническая эффективность и механизмы противовоспалительного действия глюкокортикоидных гормонов в лечении больных бронхиальной астмой. //Бронхиальная астма. / Под ред. А.Г. Чучалина - 1997. - Т.2. - С. 224-253). К недостаткам способа следует отнести диагностику post factum в случае необходимости применения высоких доз глюкокортикоидных гормонов per os.

Известен способ диагностики стероидрезистентности у больных БА, основанный на подавлении глюкокортикоидными гормонами in vitro фитогемагглютинин индуцированной пролифирации лимфоцитов (Corrigan C.J., Brown P.H., Barnes N. C. , Szefler S.J., Tsai J.-J., Frew A.J. et al. Glucocorticoid resistance in chronic asthma: glucocorticoid pharmacokinetics, glucocorticoid receptor characteristics and inhibition of peripheral blood Т cell proliferation by glucocorticoids in vitro. //Am. Rev. Respir. Dis. - 1991. - Vol.144. - P. 1016-1025).

Известен способ диагностики стероидрезистентности у больных БА, основанный на определении уровня IL-8 в мокроте больных БА в динамике на фоне терапии препаратами глюкокортикоидных гормонов (Шапорова Н.Л., Трофимов В.И., Шири Зиад Али, Сесь Т.П., Малышев М.Е., Васильева Т.А., Дудина О.В. Мониторинг цитокинового профиля у больных бронхиальной астмой: влияние глюкокортикоидной терапии. //Медицинская иммунология. - 2001. - Т.3, 1. - С. 69-77).

Известен способ диагностики стероидрезистентности по определению подавления IL-8 в культуре эпителиальных клеток бронхов под влиянием дексаметазона (Kwon O.J., An В.Т., Collins P.D. Inhibition of interleukin-8 expression by dexamethasone in human cultured airway epithelial cells. //Immunology. - 1994. - Vol. 81, N3. - P.389-394).

Известен способ диагностики стероидрезистентности у больных БА, включающий определение индуцированной липополисахаридом продукции туморнекротизирующего фактора α (TNFα) мононуклеарами периферической крови пациентов в динамике на фоне проведения курса терапии глюкокортикоидными гормонами. Диагностический вывод делают исходя из того, что преднизолон подавляет индуцированную липополисахаридом продукцию TNFα только у кортикочувствительных, но не у стероидрезистентных пациентов (Vecchiarelli A., Siracusa A., Cenci Е. et al. Effect of corticosteroid treatment on interleukin-1 and tumour necrosis factor secretion by monocytes from subjects with asthma. //J. Clin. Exp. Allergy. -1992. - Vol. 22. - P.365-369).

Все указанные способы оценивают стероидрезистентность не на основании непосредственного взаимодействия глюкокортикоидных гормонов с клеткой, а на основании определения последствий регулирующего влияния глюкокортикоидных гормонов на клетки организма. По отсутствию этого влияния судят о стероидрезистентности. Это предполагает обследование в динамике (по крайней мере 2 раза).

Известен способ диагностики стероидрезистентности у больных БА, основанный на оценке связывающей способности глюкокортикоидрецепторных комплексов с соответствующими сайтами на ДНК методом изменения электрофоретической подвижности образцов (Adcock I.M., Lane S.J., Brown C.R., Peters M.J., Lee T.H., Barnes, P. J. Differences in binding of glucocorticoid receptor to DNA in steroid-resistant asthma. J Immunol. - 1995. - Vol. 154. - P. 3500-3505). Вывод о стероидрезистентности делают на основании снижения связывающей способности глюкокортикоидных рецепторов. Данный способ принят за прототип.

Однако известный способ, несмотря на очень высокую специфичность, чрезвычайно дорогостоящ и доступен только очень хорошо оснащенным специализированным лабораториям, поэтому не может быть применен в практической работе и имеет только фундаментальное значение.

Задачей изобретения является создание способа диагностики стероидрезистентности у больных БА, обладающего высокой информативностью и не требующего специального оснащения.

Поставленная задача решается тем, что в известном способе диагностики стероидрезистентности у больных бронхиальной астмой путем исследования лимфоцитов периферической крови согласно изобретению лимфоциты окрашивают азотнокислым серебром, определяют среднее количество аргентофильных гранул на лимфоцит и при среднем количестве аргентофильных гранул на лимфоцит менее 1,66 диагностируют стероидрезистентность.

Предложенный способ диагностики стероидрезистентности основан на определении непосредственно активности процессов транскрипции в ядрах клеток-мишеней, т.е. в месте, где реализуются эффекты глюкокортикоидных гормонов, что позволяет оценивать исходное состояние клеток и их возможность ответить на регулирующие сигналы глюкокортикоидов. От прототипа предлагаемый метод отличается тем, что исследуется несвязывающая способность глюкокортикоидрецепторных комплексов с ДНК, что технически чрезвычайно трудно и требует дорогостоящих реактивов и специального оборудования, а следствие этого связывания - активность процессов транскрипции в ядре клетки.

Способ был разработан на основании обследования 25 больных гормонозависимой БА. Группу контроля составили 10 здоровых лиц. Среди больных гормонозависимой БА было 16 кортикочувствительных пациентов (БАКЧ), получавших терапию препаратами глюкокортикоидных гормонов в дозе, не превышающей 15 мг преднизолона в сутки. Максимальная доза пероральных глюкокортикоидов у этих больных в среднем составила 13,2±0,83, а средняя поддерживающая доза равнялась 8,7±0,35 мг в пересчете на преднизолон в сутки. Также были обследованы 9 стероидрезистентных больных (БАСР), получавших более 20 мг преднизолона в сутки. Максимальная доза пероральных глюкокортикоидов в среднем составила 28,9±1,69, а средняя поддерживающая доза равнялась 21,2±0,79 мг в пересчете на преднизолон в сутки. Прирост OФВ₁ в динамике у кортикочувствительных больных составил 23,7±4,0% от исходного уровня, а у стероидрезистентных пациентов оказался достоверно (р=0,013) ниже 11,34±1,36%.

У всех обследованных больных определяли содержание аргентофильных гранул в ядрышках лимфоцитов, в каждом случае анализировали не менее 100 клеток.

У пациентов с гормонозависимой астмой среднее количество аргентофильных гранул на лимфоцит оказалось значительно ниже, чем у здоровых лиц. При этом у стероидрезистентных больных среднее количество аргентофильных гранул на лимфоцит было достоверно более низким по сравнению как со здоровыми лицами, так и с кортикочувствительными больными БА. Полученные данные представлены в таблице.

Как видно из таблицы, среднее значение показателя у стероидрезистентных пациентов составило 1,610±0,020 аргентофильных гранул на лимфоцит, а доверительный коридор с вероятностью 95% находился в пределах от 1,52 до 1,66 аргентофильных гранул на лимфоцит, это и позволило установить диагностический критерий.

Способ осуществляют следующим образом.

Производят забор венозной крови из локтевой вены, лимфоциты выделяют из гепаринизированной крови путем центрифугирования в градиенте плотности (1,077) фикол-верографин (Pharmacia Fine Chemicals, Швеция) при 1500 оборотах в минуту в течение 30 минут. Затем полученное в интерфазе кольцо снимают пипеткой и трижды отмывают физиологическим раствором, после чего из взвеси лимфоцитов на предметных стеклах приготавливают мазки. Приготовленные из взвеси лимфоцитов мазки высушивают на воздухе, после чего фиксируют смесью метанола и уксусной кислоты в соотношении 3:1 в течение 10 минут. После инкубации стекла тщательно ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе. Окрашивание препаратов азотнокислым серебром осуществляют по известной методике (Мамаев Н.Н. Использование серебрения цистронов рибосомной РНК для комплексной оценки гемопоэза при заболеваниях крови. //Метод. рекомендации. СПбГМУ им. ак. И.П. Павлова. - 1998. - СПб. - 11с.) На подготовленный для серебрения препарат наносят в зависимости от необходимой площади окраски 1-3 капли 2% раствора желатина, предварительно приготовленного на 1% водном растворе муравьиной кислоты и, соответственно, 2-6 капель свежеприготовленного 50%-ного водного раствора азотнокислого серебра. Смешивают нанесенные на стекло реагенты с помощью предварительно обезжиренного покровного стекла и закрывают чистыми покровными стеклами. Экспонируют при комнатной температуре в течение 1 минуты. Помещают препарат в чашку Петри с увлажненной атмосферой и температурой, предварительно доведенной до 68-70^oС, что лучше всего достигается при постановке чашки Петри в водяную баню. Экспонируют препараты при высокой температуре в течение 2,5-3,5 минут. Тщательно ополаскивают препараты дистиллированной водой. В световом микроскопе при увеличении х 1000 определяют среднее количество аргентофильных гранул на лимфоцит (в каждом случае анализируют не менее 100 клеток) и при среднем количестве аргентофильных гранул на лимфоцит менее 1,66 диагностируют стероидрезистентность.

Способ иллюстрируется следующими клиническими примерами.

Пример 1. Больная Т. , 59 лет. Болеет бронхиальной астмой в течение 9 лет. Течение бронхиальной астмы тяжелое. Максимальная доза пероральных глюкокортикоидов в пересчете на преднизолон составляет 30 мг в сутки. Доза глюкокортикоидных гормонов при поступлении 20 мг в пересчете на преднизолон в сутки.

Уровень аргентофильных гранул в лимфоцитах периферической крови составил 1,58 аргентофильных гранул/лимфоцит. Пациентка была расценена как больная стероидрезистентной БА.

Диагноз был подтвержден следующими исследованиями.

Показатели функции внешнего дыхания: ОФB₁ при поступлении 48,1% должной величины. OФB₁ в динамике равнялось 54,3% должной величины. Таким образом, терапия пероральными глюкокортикоидами в дозе 20 мг в сутки в пересчете на преднизолон не привела к повышению ОФB₁ на 15% от исходной величины и показатели функции внешнего дыхания оставались существенно ниже 60% должной.

Показатели гормонального гомеостаза: уровень 11ОКС в плазме крови при поступлении составил 190 нмоль/л (норма 350 - 372 нмоль/л), содержание кортизола в плазме крови оказалось равно 88 нмоль/л, что также значительно ниже нормы.

Пример 2. Больная Б., 59 лет. Болеет бронхиальной астмой в течение 10 лет. Течение бронхиальной астмы тяжелое. Доза пероральных глюкокортикоидов в пересчете на преднизолон составляет 25 мг в сутки.

Уровень аргентофильных гранул в лимфоцитах периферической крови составил 1,65 аргентофильных гранул/лимфоцит. Пациентка была расценена как больная стероидрезистентной БА.

Диагноз был подтвержден следующими исследованиями:
Показатели функции внешнего дыхания: OФB₁ при поступлении 42,2% должной величины. OФB₁ в динамике, несмотря на проводимую терапию, равнялось 48,4% должной величины. Таким образом, терапия пероральными глюкокортикоидами в дозе 25 мг в сутки в пересчете на преднизолон не привела к повышению OФB₁ на 15% от исходной величины и показатели функции внешнего дыхания оставались существенно ниже 60% должной.

Показатели гормонального гомеостаза: уровень 11ОКС в плазме крови при поступлении составил 207 нмоль/л (норма 350 - 372 нмоль/л), кортизол сыворотки оказался равен 33 нмоль/л (норма 150 - 650 нмоль/л), что значительно ниже нормы.

Пример 3. Больная О., 52 лет. Болеет бронхиальной астмой 8 лет. Течение бронхиальной астмы тяжелое. Доза пероральных глюкокортикоидов в пересчете на преднизолон составляет 10 мг в сутки.

Уровень аргентофильных гранул в лимфоцитах периферической крови составил 1,75 аргентофильных гранул/лимфоцит.

Пациентка была расценена как больная кортикочувствительной БА.

Диагноз был подтвержден следующими исследованиями.

Показатели функции внешнего дыхания составили: OФB₁ при поступлении 59,8% должной величины. В динамике OФB₁ 69,4% должной величины. Из приведенных данных видно, что терапия пероральными глюкокортикоидами в дозе 10 мг в сутки в пересчете на преднизолон привела к стабилизации состояния и улучшению показателей функции внешнего дыхания: ОФB₁ возросло на 16,1% от исходной величины.

Показатели гормонального гомеостаза: уровень 11ОКС в плазме крови составил 254 нмоль/л при поступлении и 361 нмоль/л в динамике. Уровень 11ОКС в плазме крови вырос в 1,4 раза и достиг нормальной величины.

Способ был проверен при исследовании 139 больных гормонозависимой БА: у 112 пациентов была диагностирована кортикочувствительная и у 27 - стероидрезистентная астма, что потребовало назначения дополнительных методов корригирующей терапии, позволивших понизить дозу пероральных глюкокортикоидных гормонов.

Использование предложенного способа позволяет осуществлять диагностику стероидрезистентности у больных БА при однократном исследовании, оценивать возможность адекватного ответа клеток дыхательных путей пациента на регулирующие воздействия препаратов глюкокортикоидных гормонов без использования дорогостоящего оборудования и реактивов.

Изобретение относится к области медицины, в частности к пульмонологии. Способ обеспечивает высокую информативность и не требует специального оснащения при диагностике стероидрезистентности у больных бронхиальной астмой. Проводят исследование лимфоцитов периферической крови, при этом лимфоциты окрашивают азотнокислым серебром, определяют среднее количество аргентофильных гранул на лимфоцит и при среднем количестве аргентофильных гранул на лимфоцит менее 1,66 диагностируют стероидрезистентность. 1 табл.

Способ диагностики стероидрезистентности у больных бронхиальной астмой путем исследования лимфоцитов периферической крови, отличающийся тем, что лимфоциты окрашивают азотнокислым серебром, определяют среднее количество аргентофильных гранул на лимфоцит и при среднем количестве аргентофильных гранул на лимфоцит менее 1,66 диагностируют стероидрезистентность.