СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОКАЗАНИЙ К ЛЕЧЕНИЮ ЦИТОСТАТИКАМИ И ГЛЮКОКОРТИКОИДАМИ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/536 

Изобретение относится к медицине, а именно к терапии, и может быть использовано при определении показаний к лечению цитостатиками и глюкокортикоидами.

Известен способ определения показаний к лечению иммуномодулирующими препаратами больных ревматоидным артритом, включающий оценку влияния препаратов на реакцию активного розеткообразования (Сенчило И.В., Васильева Е.В. Реакция активного розеткообразования в оценке иммуномодулирующей активности базисных препаратов у больных ревматоидным артритом. Терапевтический архив, 1992, т. 64, N 6, с. 77-80). Способ помогает выбрать потенциально наиболее эффективный препарат, а также контролировать его супрессорное действие в ходе лечения.

Недостатком способа является невозможность определения доз показанных препаратов.

Задачей изобретения является создание способа определения показаний к лечению цитостатиками и глюкокортикоидами, позволяющего определить терапевтическую суточную дозу препарата.

Поставленная задача решается тем, что в известном способе определения показаний к лечению цитостатиками и глюкокортикоидами, включающем оценку влияния препарата на реакцию E-розеткообразования, согласно изобретению в пробы добавляют исследуемый препарат в концентрациях, соответствующих диапазону суточных терапевтических доз in vivo и рассчитанных на абсолютное количество мононуклеаров крови больного, и при снижении розеткообразования на 50% и более по сравнению с контролем препарат считают показанным в соответствующей дозе.

Для повышения точности способа целесообразно оценивать спонтанное розеткообразование.

Добавление исследуемого препарата в пробы в концентрациях, соответствующих диапазону терапевтических суточных доз in vivo и рассчитанных на абсолютное количество мононуклеаров крови больного и критерий определения показаний, сформулированный как снижение розеткообразования на 50% и более по сравнению с контролем, обеспечивают не только возможность выбора препарата, но и терапевтической суточной дозы показанного препарата.

При спонтанном E-розеткообразовании оценивается результат реакции связывания эритроцитов барана с рецепторами на мембране лимфоцитов после длительного взаимодействия (не менее 18 ч инкубации). К концу инкубации происходит стабилизация рецепторов к эритроцитам барана и, следовательно, стабилизация функциональной активности E-POK, соответствующей результату окончательной реакции антиген-антитело на мембране лимфоцитов крови. Это снижает вероятность получения ложных результатов, повышает точность способа.

Способ осуществляют следующим образом.

Выделяют взвесь мононуклеарных клеток (МНК) центрифугированием в градиенте фиколл-верографин (1,077 г/мл) из гепаринизированной крови больного путем наслоения 2-3 мл отстоявшейся плазмы на градиент. Центрифугирование осуществляют 40 мин при 400 g. После центрифугирования с интерфазы собирают слой МНК и дважды отмывают в 0,9% NaCl 10-15 мин в том же режиме. Выход МНК после отмывки составляет 84-88% от общего количества в крови. Жизнеспособность клеток при окраске трипановым синим до 94-97%. Готовят рабочую концентрацию МНК, которая составляет 2•10⁹ клеток в 1 мл среды RPMI-1640 или отечественной среды N 199.

Из исследуемого препарата (цитостатик или глюкокортикоид) готовят ряд последовательных разведений из расчета суточной дозы (от максимальной до минимальной) препарата на объем абсолютного количества циркулирующих МНК в крови больного. Расчет абсолютного количества МНК производят по данным клинического анализа крови больного, сделанного накануне. Далее рассчитанные концентрации препарата пересчитывают на абсолютное содержание МНК в одной пробе in vitro, равной 2•10⁵ клеток в 0,1 мл среды RPMI-1640 (можно использовать отечественную среду N 199). Готовят пробы, для чего 100 мкл суспензии МНК (содержащей 2•10⁵ клеток) инкубируют с 100 мкл последовательного разведения исследуемого препарата с добавлением 100 мкл среды. Инкубацию проводят в течение 1 ч при 37^oC в термостате. В контрольную пробу к 100 мкл суспензии МНК добавляют только 100 мкл среды. Далее клетки дважды отмывают 0,9% NaCl 10-15 мин при 200 g и ставят реакцию спонтанного розеткообразования (E-POK) по методу Bach. J. (1973 г.). Для этого готовят суспензию трижды отмытых эритроцитов барана, разведенных средой до концентрации 0,5%, смешивают равные объемы разведенных эритроцитов барана и каждой пробы. Взвесь инкубируют 10 мин в термостате при 37^oC, затем однократно центрифугируют 10 мин при 200 g и далее проводят длительную инкубацию при 4^oC в течение 18-20 ч. После инкубации считают розеткообразующие лимфоциты (E-POK) на 200 клеток. Розеткообразующей клеткой считают лимфоцит, к поверхности которого прикрепляются 3 эритроцита и более.

Оценку результатов осуществляют по отношению к 50% от контрольной пробы. Если исследуемая концентрация препарата вызывает угнетение спонтанного E-розеткообразования на 50% и более по отношению к контрольной пробе, это указывает на наличие чувствительности лимфоцитов больного к данной концентрации препарата.

Способ иллюстрируется следующими клиническими примерами.

Пример 1. Больная Х-а, 1971 г.р. поступила в 1 нефрологическое отделение СПГМУ им. акад. И.П. Павлова с жалобами на отеки по всему телу, одышку при ходьбе, общую слабость, увеличение живота, уменьшение диуреза до 500 мл/сутки без мочегонных. В стационаре после нефробиопсии и лабораторного обследования поставлен диагноз: фокально-сегментарный гломерулосклероз, обострение, нефротический синдром. Анасарка, асцит, двухсторонний гидроторакс, гидроперикардит, вторичная артериальная гипертензия. Ранее в 1994 г. больной был диагносцирован хронический гломерулонефрит и она получила патогенетическую терапию преднизолоном в дозе 30 мг/сут. Эффекта от терапии не было (суммарный курс преднизолона 8 мес). С ухудшением клинико-лабораторных показателей больная была переведена в 1 нефрологическое отделению.

По предлагаемому способу больной было проведено определение показаний к лечению преднизолоном. Для исследования 3 мл отстоявшейся плазмы наслаивали на градиент фиколл-верографин (1,077 г/мл) и центрифугировали 40 мин при 400 g. После центрифугирования с интерфазы собирали слой мононуклеаров (МНК) и дважды отмывали в 0,9% NaCl 10 мин в том же режиме. Жизнеспособность клеток при оценке трипановым синим составила 96%. Далее была приготовлена рабочая концентрация взвеси МНК 2•10⁶ в 1 мл среды RPMI-1640.

Расчет абсолютного количества циркулирующих МНК крови производили по данным клинического анализа крови, сделанного накануне. Из анализа крови: лейкоциты 6,4•10⁹ клеток, содержание лимфоцитов 22%. Абсолютное количество МНК = 1,4•10⁹ клеток. Максимальная суточная доза преднизолона, применяемая в лечении больных в НИИ нефрологии равна 500 мг преднизолона внутривенно (в/в) в сутки. Рассчитывали количество таблетированного преднизолона из расчета 1 таблетка (5 мг) соответствует 30 мг в одной ампуле препарата для в/в введения. На количество 1,4•10⁹ клеток в организме больного необходимо ввести 500 мг в/в преднизолона, а при постановке пробы in vitro расчет идет на 2•10⁵ клеток в 100 мкл среды RPMI-1640 и соответственно равняется 0,07 мг в 100 мкл среды. Отсюда основной расчет преднизолона 7 мг в 10 мл среды. Далее из этого раствора готовили последующие разведения препарата, соответствующие 300 мг в/в раствора преднизолона, 40, 20, 15 мг таблетированного преднизолона на 2•10⁵ клеток в 100 мкл среды. Далее готовили пробы, для чего в течение 1 ч при 37^oC в термостате инкубировали 100 мкл суспензии МНК (2•10⁵ клеток) с 100 мкл последовательных разведений преднизолона. Контрольную пробу инкубировали без добавления преднизолона. Затем клетки дважды отмывали 0,9% NaCl 10 мин при 200 g и ставили реакцию спонтанного розеткообразования (E-POK) по методу Bach. J. Для этого готовили суспензию эритроцитов барана трижды отмытых, разведенных средой до 0,5% концентрации. Смешивали равные объемы каждой пробы с суспензией эритроцитов барана. Пробы инкубировали 10 мин при 37^oC в термостате, затем однократно центрифугировали 10 мин при 200 g и далее инкубировали при 4^oC в течение 18 ч. После инкубации считали E-розеткообразующие лимфоциты (E-POK) на 200 клеток.

Были получены следующие результаты:
контроль = 32% E-POK
разведение 500 мг в/в = 8%
разведение 300 мг в/в = 12%
разведение 40 мг per os = 14%
разведение 20 мг per os = 29%
разведение 15 мг per os = 30%
Из полученных данных видно, что снижение розеткообразования на 50% и более по сравнению с контролем имеет место для доз 500 мг в/в, 300 мг в/в и 40 мг per os.

С учетом полученных данных больной была назначена терапия преднизолоном 500 мг в/в N 3, а далее по 60 мг/сут per os в течение 1,5 мес и далее по 40 мг/сут per os в течение 1 мес.

Получен положительный эффект от терапии. Данные приведены в табл. 1.

Пример 2. Больной С-в, 1954 г.р. поступил в 1 нефрологическое отделение НИИ Нефрологии СПГМУ им. акад. И.П. Павлова с жалобами на отеки ног и голеней, головокружение, слабость, уменьшение диуреза.

В стационаре после нефробиопсии и лабораторного обследования поставлен диагноз: мезангиально-пролиферативный гломерулонефрит, обострение. Нефротический синдром. Транзиторная артериальная гипертензия.

До госпитализации в 1 нефрологическое отделение у больного был диагносцирован хронический гломерулонефрит и назначена патогенетическая терапия циклофосфаном 100 мг/сут без эффекта.

С ухудшением клинико-лабораторных показателей больной поступил в 1 нефрологическое отделение.

До начала патогенетической терапии больному были определены показания к лечению циклофосфаном по предлагаемому способу.

Для постановки способа 3 мл отстоявшейся плазмы наслаивали на градиент фиколл-верографин (1,077 г/мл) и центрифугировали 40 мин при 400 g. После центрифугирования с интерфазы собирали слой мононуклеаров (МНК) и дважды отмывали в 0,9% NaCl 10 мин в том же режиме. Жизнеспособность клеток при оценке трипановым синим составила 96%. Далее была приготовлена рабочая концентрация взвеси МНК 2•10⁶ в 1 мл среды RPMI-1640. Из сухого вещества циклофосфана готовили исходный раствор концентрации препарата из расчета суточной дозы 200 или 100 мг на абсолютное количество циркулирующих МНК крови. Расчет абсолютного количества циркулирующих МНК крови производили по данным клинического анализа крови, сделанного накануне. Из анализа крови: лейкоциты 5,3•10⁹ клеток, содержание лимфоцитов 35%. Абсолютное количество МНК = 1,86•10⁹ клеток. Суточная доза циклофосфана, применяемая в НИИ Нефрологии равна 200 мг/сут или 100 мг/сут. На количество 1,86•10⁹ клеток в организме больного необходимо ввести 200 мг циклофосфана, а при постановке пробы in vitro расчет идет на 2•10⁵ клеток в 100 мкл среды RPMI-1640 и соответственно равняется 0,02 мг в 100 мкл среды. Отсюда готовили основной раствор 2 мг циклофосфана в 10 мл среды. Далее из этого раствора готовили разведение циклофосфана, соответствующее 100 мг на 2•10⁵ клеток в 100 мкл среды. Далее готовили пробы, для чего в течение 1 ч при 37^oC в термостате инкубировали 100 мкл суспензии МНК (2•10⁵ клеток) с 100 мкл последовательных разведений циклофосфана. Контрольная проба инкубировалась без добавления циклофосфана. Затем клетки дважды отмывали 0,9% NaCl 10 мин при 200 g и ставили реакцию спонтанного розеткообразования (E-POK) по методу Bach J. также, как это описано в предыдущем примере.

Были получены следующие результаты:
контроль - 37% E-POK
разведение 200 мг/сут = 10%
разведение 100 мг/сут = 29%
Из полученных данных видно, что снижение розеткообразования более 50% по сравнению с контролем имеет место для дозы циклофосфана 200 мг/сут. С учетом полученных данных больному была назначена терапия циклофосфаном 200 мг/сут.

Через 1,5 мес получен положительный эффект от терапии. Данные приведены в табл. 2.

Способ прошел испытания на двух группах больных.

1 группа. Обследовали 30 больных хроническим гломерулонефритом. Возраст больных колебался от 20 до 49 лет, 17 женщин и 13 мужчин. Хронический гломерулонефрит был представлен разными морфологическими формами: мезангиально-пролиферативный (12), мембранозный (6), мембранозно-пролиферативный I тип (10), фокально-сегментарный гломерулосклероз (2). Нефротический синдром был у 70% больных в группе. Средняя продолжительность заболевания составила 4 года. Больным проводилась терапия преднизолоном по стандартной схеме: 3-5 дней по 300-500 мг в/в с последующим использованием препарата per os в дозе начиная с 60 мг/сут.

21 больному (70%) назначение преднизолона и выбор доз проводили по предлагаемому способу. Через 6 недель от начала лечения оценивали эффект терапии по динамике клинико-лабораторных показателей. У 19 (90,5%) больных отмечалась ярко выраженная положительная клинико-лабораторная динамика. Общий белок, альбумины сыворотки крови достоверно возрастали (p < 0,001), холестерин сыворотки крови снижался с 8,95±0,05 до 6,6±0,03 ммоль/л (p < 0,001). Суточная потеря белка уменьшалась с 6,6±0,05 до 3,0±0,04 г/сут (p < 0,001), у 4 больных значения СПБ были еще ниже, до "следов" в разовых анализах мочи и в СПБ.

9 больным (30%) преднизолон назначался без определения показаний. Через 6 недель от начала лечения оценивали эффект терапии по динамике клинико-лабораторных показателей. Тенденция к положительной динамике отдельных лабораторных показателей сыворотки крови отмечалась у 3 человек, без динамики - у 4 человек и ухудшение течения заболевания - у 2 больных, которое проявилось повышением уровня холестерина сыворотки крови с 6,4±0,32 до 7,6±0,15 ммоль/л, СПБ с 4,6±0,43 до 5,8±0,23 г/л, увеличение отечного синдрома, появление трудно коррегируемой артериальной гипертензии, ухудшение показателей функции почек (снижение клубочковой фильтрации, повышение креатинина сыворотки крови).

2 группа. Группа больных, получающих циклофосфан, составила 18 человек. Средний возраст 38 лет, из них 10 мужчин и 8 женщин. Средняя продолжительность заболевания 6,8 лет. Морфологическая форма хронического гломерулонефрита была представлена: мезангиально-пролиферативный (8), мембранозно-пролиферативный (8), фокально-сегментарный гломерулосклероз (2). Нефротический синдром выявлен у 60% больных.

В этой группе 12 человек получали циклофосфан с определением показаний по предлагаемому способу. Положительный клинико-лабораторный эффект наблюдался у 9 (75%) больных из 12. Изменения общего белка крови и альбуминов крови недостоверны (p > 0,05), холестерин уменьшился с 7,0±0,25 до 6,3±0,15 ммоль/л (p > 0,05), суточная потеря белка с 4,6±0,23 до 1,5±0,32 г/л (p < 0,001). При этом ни у одного больного не наблюдалось осложнений от терапии циклофосфаном.

6 больным не проводили определения показаний к лечению циклофосфаном по предлагаемому способу. Циклофосфан назначали по 200 или 100 мг в сутки внутривенно. У 5 больных не отмечалось никакого клинико-лабораторного эффекта. Более того, выявлено снижение концентрационной функции почек, развитие транзиторной азотемии, требующей полной отмены препарата, также отмечалась тенденция к нарастанию печеночных трансаминаз, увеличение суточной потери белка (p < 0,05), развитие нефротического синдрома.

Использование предлагаемого способа позволяет определять показания к лечению цитостатиками и глюкокортикоидами, а также терапевтическую суточную дозу препарата.

Сущность: в пробы добавляют исследуемый препарат в концентрациях> соответствующих диапазону суточных терапевтических доз и рассчитанных на абсолютное количество мононуклеаров крови больного. Оценивают спонтанное Е-розеткообразование. При снижении Е-розеткообразования на 50% и более по сравнению с контролем препарат считают показанным в соответствующей дозе. Способ позволяет определить терапевтическую суточную дозу, препарата показанную больному. 1 з.п.ф-лы, 2 табл.

1. Способ определения показаний к лечению цитостатиками и глюкокортикоидами путем оценки влияния препарата на реакцию Е-розеткообразования, отличающийся тем, что в пробы добавляют исследуемый препарат в концентрациях, соответствующих диапазону суточных терапевтических доз in vivo и рассчитанных на абсолютное количество мононуклеаров крови больного, и при снижении розеткообразования на 50% и более по сравнению с контролем препарат считают показанным в соответствующей дозе. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что оценивают спонтанное Е-розеткообразование.