СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ, ПРОВЕРКИ И ПРИМЕНЕНИЯ АССОЦИАТОВ МАКРОМОЛЕКУЛ И КОМПЛЕКСНЫХ АГРЕГАТОВ С ПОВЫШЕННОЙ ПОЛЕЗНОЙ НАГРУЗКОЙ И КОНТРОЛИРУЕМОЙ СТЕПЕНЬЮ АССОЦИАЦИИ/ДИССОЦИАЦИИ Российский патент 2003 года по МПК A61K9/127 A61K38/00 A61K38/28 

Изобретение относится к комбинациям веществ, которые проявляют амфипатические свойства и могут образовывать протяженные поверхности, в особенности мембраноподобные поверхности при контакте с жидкой средой. В особенности изобретение относится к ассоциации на молекулярном уровне других амфипатических веществ с такими поверхностями, причем эти другие амфипатические поверхностно-ассоциируемые вещества обычно представляют собой более крупные молекулы с повторяющимися субъединицами, такие как олигомеры или полимеры, и часто относятся к классу биологически активных агентов.

Кроме того, изобретение относится к способам создания таких поверхностей и получения ассоциатов этих более крупных молекул с такими поверхностями, так же как и к различным способам применения таких поверхностей и ассоциатов.

Амфипатические цепочечные молекулы и родственные им макромолекулы, такие как белки, адсорбируются на любом типе поверхности, но в разной степени и очень часто в различных конформациях. Настоящее изобретение описывает уровень техники и предлагает новое логическое обоснование оптимизации и контроля макромолекулярной ассоциации с мягкими комплексными поверхностями. Оно может применяться в биологии, биотехнологии, фармацевтике, терапии и диагностике.

(Макро)молекулярная адсорбция/связывание с адсорбирующей поверхностью (ассоциация адсорбента/адсорбата) является многостадийным процессом:
i) первая стадия включает перераспределение, предпочтительно накапливание, адсорбата на границе раздела адсорбент/раствор. Эта стадия обычно протекает быстро и зависит от скорости диффузии.

ii) на второй стадии молекулы адсорбата гидрофобно ассоциируются с мягкой (мембранной) поверхностью. Этот процесс включает несколько ступеней, таких как частичное молекулярное связывание и последовательную(ые) перегруппировку(и), причем по меньшей мере некоторые из них протекают медленно.

Было доказано (Cevc G., Strohmaier L., Berkholz J., Blume G. Stud. Biophys. 1990, 138: 57ff), что возможность специфичного связывания крупной молекулы с присоединенным к поверхности лигандом, внедренным в "мягкую" липидную мембрану, уменьшается из-за близости границы раздела. Вероятно, это происходит благодаря той же самой некулоновской силе, зависящей от гидратации, которая также предотвращает коллоидное слияние соседних липидных мембран одной с другой. Общая результирующая сила уменьшается с уменьшением гидрофильности и жесткости границы раздела раствор-липид (Cevc G., Hauser M., Kornyshev A.A. Langmuir 1995, 11: 3103-3110).

Ранее было также сделано предположение, что степень неспецифичной адсорбции белков на липидном бислое (Cevc, et al., op. cit: 1990) пропорциональна доступности для белка гидрофобных участков связывания в мембране. Было обнаружено, что создание дефектов в липидных бислоях механическим путем (например, при помощи обработки ультразвуком) или путем индукции переходов липидной фазы увеличивает количество мембраносвязанного белка.

Как правило, считается, что чем более гидрофобная поверхность, тем выше степень адсорбции амфипатических макромолекул. Например, К. Prime и G.M. Whitesides (Science, 1991, 252: (164-1167), которые использовали самоорганизующиеся монослои длинноцепочечных алканов с концевыми группами различной гидрофобности для того, чтобы систематически изменять адсорбцию белков путем связывания гидрофобных аминокислот, подтвердили это "правило" или "принцип". В настоящий момент "гидрофобное притяжение", таким образом, считается преобладающей силой в адсорбции белков.

С другой стороны, широко признано, что в суммарном макроскопическом взаимодействии между гидрофильной макромолекулой, такой как белок, и гидрофильной поверхностью, такой как стекло или монтмориллонитовая глина, погруженными в водный раствор при нейтральном рН, преобладает сильное отталкивание. Таким образом, при условиях, для которых применимы в макроскопическом масштабе правила Ван-дер-Ваальса, кислот-оснований Льюиса и электрических взаимодействий двойного слоя, адсорбция гидрофильных белков на гидрофильных неорганических поверхностях обычно является слабой (H. Quiquampoix et al., Mechanisms and Consequences of Protein Absorption on Soil Mineral Surfaces, Chapter 23 in Proteins at Interfaces (PAI), T.A. Horbett and J.L. Brash, eds. , ASC Symposium Series 602, 1995, New York: 321-333). Однако некоторые гидрофильные белки действительно адсорбируются на стекле из раствора, хотя и более редко, чем они бы адсорбировались на гидрофобной поверхности; такие белки также адсорбируются на поверхностях из монтмориллонитовой глины. Чтобы объяснить это необычное явление, предположили и подтвердили экспериментальными данными, что белки могут связываться с одинаково (например, отрицательно) заряженной гидрофильной неорганической поверхностью, погруженной в водную среду, через многозарядные противоионы (например, кальций), связанные с (отрицательно) заряженными гидрофильными белками. Другие тонкие воздействия зарядов включают образование водородных связей, образование солей в белков и связывание противоионов. Например, предполагалось, что "структурные перегруппировки в молекуле белка, дегидратация поверхности сорбента, перераспределение заряженных групп и поверхностной полярности белка" - все эти факторы могут воздействовать на адсорбцию белка (Haynes С.A et al., Colloids Surface В: Biointerfaces, 2, 1994: 517-566). В соответствии с этим кулоновские взаимодействия хотя и важны, но в целом не являются преобладающими в адсорбции белков на твердых поверхностях, как в случае сильной адсорбции a-LA (альфа-лактальбумина) на PS (полистироле) в условиях, когда белок несет значительный суммарный отрицательный заряд. В другом недавнем обзоре признано, что "в настоящее время еще не пришли к ясному согласию относительно степени воздействия зарядов на адсорбцию белков" (Reversibility and the Mechanism of Protein Adsorption, W. Norde and C. Haynes, Chapter 2 in (PAI), op. cit.: 26-40).

В настоящее время существует точка зрения, что в случае мягких поверхностей, таких как мембраны, по меньшей мере первые стадии адсорбции белков происходят за счет электростатики и/или на них преобладают взаимодействия зарядов (см. например: Deber C.M.; Hughes D.W.; Frasez P.E.; Pawagi А.В.; Moscarello M.A. Arch. Biochem. Biophys. 1986, 245: 455-463; Zimmerman, R.M., Schmidt, C.F., Gaub, N.H. E.J. Colloid Int. Sci. 1990, 139: 268-280; Hernandez-Caseldis Т. ; Villalaain J.; Gomes-Fernandez J.C. Mol. Cell. Biochem. 1993, 120: 119-126.) Ведущие эксперты также считают, что электростатические силы являются определяющими при связывании секреторных фосфолипаз с различными липидными агрегатами (Scott D.L.; Mandel A.M.; Sigler Р.В.; Honig В. Biophys. J. 1994, 67: 493-504).

Вплоть до настоящего времени специалисты считали, что главным определяющим фактором окончательной адсорбции белков является гидрофобное притяжение, несмотря на то, что определенную роль играют ионные взаимодействия, в сочетании с ростом энтропии, вызванным конформационными изменениями в белке при его адсорбции.

Обычно белки сильно адсорбируются к поверхностям, которые противоположно заряжены, а не к поверхностям, которые несут такие же заряды. Зависимость адсорбции белков от рН отражает этот факт. Влияние зарядов можно спутать со "скрытыми" факторами, такими как малые многовалентные противоионы, которые могут образовывать мостики между белком и участками поверхности с тем же зарядом, от которых обычно можно было бы ждать отталкивания.

Окончательная конформация адсорбированного белка редко идентична той, которая была в начале. Это является причиной того, что в большинстве моделей адсорбции белков возникает переход от состояния обратимой адсорбции до состояния более прочного удерживания, которое возникает как следствие молекулярной реструктуризации или релаксации белка на поверхности. Макромолекулярная перегруппировка при адсорбции часто является катастрофической и заканчивается денатурацией белка. На основании того факта, что ферменты и антитела сохраняют по меньшей мере часть своей биологической активности в адсорбированном состоянии, а биологическая активность исключительно зависит от сохранения нативной структуры, можно сделать вывод, что изменения в конформации адсорбированного белка тем не менее часто ограничены по времени и по объему. На свертывание белка наиболее сильно влияют гидрофобные взаимодействия. Оба явления, связывание белка и конформационные изменения, чувствительны к присутствию некоторых амфифильных веществ, таких как поверхностно-активные вещества и фосфолипиды. Считалось, что адсорбция белков уменьшается или становится обратимой при добавлении таких молекул.

Таким образом, белки чаще смешивают, чем не смешивают с поверхностно-активными веществами во время их выделения, чтобы свести к минимуму неспецифическую адсорбцию и потерю белка. В одном из исследований адсорбция белков снижалась до незначительного уровня по мере увеличения поверхностной концентрации привитого поверхностно-активного вещества типа Pluronic. Число этиленгликольных (EG) звеньев в мономерной боковой цепи поверхностно-активного вещества составляло 4, 9 и 24, и мономер с наименьшим числом EG звеньев (4) был самым "инертным" по отношению к компонентам крови (Analysis of the Prevention of Protein Adsorption by Steric Repulsion Theory T.B. McPherson et al., Chapter 28 in PAI, op. cit.: 395-404).

Было показано, что короткие полимеры, ковалентно связанные с поверхностью и увеличивающие толщину и гидрофильность границы раздела и, таким образом, снижающие доступность гидрофобных участков связывания под ним, снижают возможность связывания белков с модифицированными поверхностями, а также денатурации на них белков.

Тот факт, что поверхностно-активные вещества, которые также часто содержат на одном конце короткие полимерные сегменты, имеют тенденцию препятствовать связыванию белков с различными поверхностями или даже делать его частично обратимым, согласуется с вышеупомянутыми выводами. Это явление, возможно, включает солюбилизацию или замещение белка, зависящие от относительной силы взаимодействий поверхностно-активного вещества с поверхностью и связывания поверхностно-активного вещества с белком; обычно оба эти фактора играют определенную роль.

В другом эксперименте добавление неионного поверхностно-активного вещества ряда Brij (алкил-полиоксиэтиленового эфира) в водную фазу при рН 7,0 в интервале концентраций около 10^-4 мас.% вызвало значительное вытеснение белка из границы раздела воздух-вода (T.Arnebrant et al, op. cit.).

Широко изучалось удаление предварительно преадсорбированных белков при помощи поверхностно-активных веществ (Protein-Surfactant Interaction at Solid Surfaces, T. Arnebrant et al. Chapter 17 in PAI, op. cit.: 240-254). Различают три вида взаимодействий:
i) Связывание поверхностно-активного вещества при помощи электростатических или гидрофобных взаимодействий с определенными участками белка, такого как альфа-лактоглобулин или сывороточный альбумин;
ii) Кооперативную адсорбцию поверхностно-активного вещества на белке без существенных конформационных изменений;
iii) Кооперативное связывание поверхностно-активного вещества с белком, сопровождающееся конформационными изменениями;
Например, удаление белка с метилированной (гидрофобной) поверхности из диоксида кремния, является одинаковым для различных поверхностно-активных веществ, что указывает на то, что белки удаляются путем их замещения вследствие более высокой поверхностной активности поверхностно-активного вещества. Можно сделать заключение о том, что воздействия головной группы поверхностно-активного вещества наиболее ярко выражены на гидрофильных поверхностях и менее важны на гидрофобных поверхностях (Protein-Surfactant Interaction at Solid Surfaces, T. Arnebrant et al. Chapter 17 in PAI, op. cit. : 240-254).

Те же самые выводы справедливы и по отношению к другим липидам. Количество белков плазмы, адсорбированных на пластмассовой поверхности, уменьшается при ее предварительной обработке суспензией DPPC липосом; адсорбция инсулина на поверхностях катетера демонстрирует такую же закономерность.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что амфипатические вещества, в особенности макромолекулы, адсорбируются на мягких поверхностях, включающих смесь липидов и поверхностно-активных веществ, более эффективно, чем на липидных агрегатах, не содержащих поверхностно-активных молекул. Вообщем, смесь молекул, образующих стабильную мембрану - обычно, но не обязательно в виде липидных везикул (липосом) - и по меньшей мере одного сильно амфипатического, то есть относительно растворимого в воде, дестабилизирующего бислой компонента (часто это поверхностно-активное вещество), примером такой смеси может служить смесь фосфолипидов и поверхностно-активных веществ, более склонна связывать амфипатические вещества, такие как белки, чем чисто фосфолипидные поверхности, в особенности везикулы или липосомы, которые состоят только из фосфолипидов или также включают по крайней мере одно стабилизирующее бислой вещество, относящееся к классу липидов, такое как холестерин. Было обнаружено, что относительное число связавшихся амфипатических макромолекул (белков) оказалось неожиданно выше в случае поверхностей, которые имели суммарные заряды того же знака, что и суммарный заряд адсорбирующейся частицы. Это явно противоречит опубликованной информации, из которой следует, что для того, чтобы электростатическое связывание было сильным, требуются противоположные заряды на взаимодействующих частицах.

Авторы предполагают, что одним из требований установленного выше улучшения надмолекулярной (например, для носителей лекарственных средств) ассоциации является общая приспособляемость адсорбирующей поверхности. Эта способность к улучшению адсорбции позволяет адсорбирующимся макромолекулам:
i) во-первых, накапливаться вблизи адсорбирующей поверхности благодаря создающим местное притяжение заряд-зарядным и другим взаимодействиям;
ii) во-вторых, оптимизировать неэлектростатические взаимодействия/связывания с адсорбирующей поверхностью. (Последний процесс обычно требует наличия гидрофобных и образующих водородные связи участков, которые образуются или становятся доступными за счет гибкости поверхности и/или ее приспособляемости.)
(Макромолекулярные) комбинации препарат/носитель лекарственных средств, которые полностью удовлетворяют этим требованиям и позволяют контролировать их выполнение, лучше всего подходят для практического применения.

Авторы далее предполагают, что каждая стадия, входящая в процесс адсорбции белка на мягкой (мембранной) поверхности, зависит в различной степени от близости и численности гидрофобных участков связывания в/на границе раздела мембрана-раствор. Кинетика гидрофобной ассоциации между макромолекулами и связывающей поверхностью, следовательно, должна быть чувствительной к числу участков, доступных для связывания, которое в свою очередь увеличивается за счет присутствия поверхностно-активных ингредиентов в мембране и мягкости мембраны.

Скорость, при которой адсорбирующиеся (макро)молекулы могут конформационно приспособиться ко множеству участков связывания также является важной. Например, в случае незаряженных гибких (Transfersome^®) мембран гидрофобное взаимодействие является основной причиной ассоциации инсулина с поверхностью. Однако лежащее в ее основе многостадийное связывание требует существенных перегруппировок в системе и, следовательно, длительного времени адсорбции для ее завершения. Вследствие этого оптимальные величины времени инкубации для образования комплексов Transfersome^®-инcyлин, могут быть довольно большими.

Схема протекания адсорбции, изложенная выше, согласуется с основным сценарием протекания адсорбции, описанным в специальной литературе. Несмотря на это несколько различий и даже спорных вопросов ясно отличают данные разработки от общеизвестных знаний, раскрытых в настоящее время.

Неожиданно оказалось, что добавление заряженных поверхностно-активных веществ к поверхности в соответствии с изобретением ускоряет процесс связывания белка с указанной поверхностью и обеспечивает средство контроля степени и скорости ассоциации макромолекулы с мембраной. Это противоречит вышеупомянутому широко распространенному мнению о том, что поверхностно-активные вещества подавляют связывание белков. С другой стороны, по меньшей мере частичное удаление поверхностно-активного вещества с такой поверхности ускоряет процесс макромолекулярной десорбции и высвобождает некоторые молекулы. Это также прямо противоречит опубликованным сведениям.

Неожиданно мы обнаружили, что макромолекулярная адсорбция на мягкой деформируемой поверхности в соответствии с изобретением, в особенности на соответствующей мембране, сильнее, чем на менее деформируемой поверхности. Так как из уровня техники известно, что мягкие мембраны являются более гидрофильными и взаимно отталкивающимися, чем мембраны менее адаптируемого типа, такое открытие прямо противоречит ожиданиям.

Следовательно, одной из задач настоящего изобретения является определение условий, которые обеспечивают максимальную ассоциацию между крупными, часто макромолекулярными, амфипатическими молекулами, такими как белки, или любого другого типа подходящих цепочечных молекул и комплексной адсорбирующей поверхностью.

Другой задачей настоящего изобретения является определение преимущественных факторов, которые контролируют скорость макромолекулярной адсорбции к или соответственно скорость десорбции с комплексной поверхности.

Еще одной задачей настоящего изобретения является предложение способов получения композиций, подходящих для (био)технологического и медицинского применения.

Другая задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы описать способы, которые особенно подходят для практического использования полученных композиций, включая, но не ограничиваясь ими, использование полученных адсорбатов в диагностике, технологии разделения и (био)технологии, биоинженерии, генетических манипуляциях, для стабилизации, концентрации или доставки агента, например в медицине или ветеринарии.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ.

"Ассоциат" согласно определению, используемому в настоящей заявке, представляет собой комплекс из двух или более различных молекул, по меньшей мере одна из которых образует агрегаты с одной или несколькими хорошо определенными поверхностями, независимо от причины образования комплекса, но исключая ковалентное связывание. Ассоциация между различными типами молекул может быть основана на инкапсулировании (например, заключении внутрь везикулы, содержащей образующую(ие) поверхность молекулу(ы)), внедрении (например, включении в слой агрегата у поверхности и под ней) или адсорбции (на поверхности агрегата); также возможны комбинации двух или более этих принципов.

Термины "адсорбат", "адсорбирующаяся (макро)молекула", "связывающая (макро)молекула", "ассоциирующая (макро)молекула", и т.д. в настоящей заявке используются взаимозаменяемо для описания ассоциации между молекулами, которые не образуют протяженных поверхностей в выбранных условиях, и "адсорбентом" или "связывающей поверхностью" и т.д. в вышеупомянутых условиях.

"Носитель" обозначает агрегат независимо от природы и источника его происхождения, который способен ассоциироваться с одной или более макромолекулами, используемый для практических целей, таких как нанесение на или доставка в тело человека или животного.

"Липид" в соответствии со смыслом настоящего изобретения представляет собой любое вещество, свойства которого такие же, как у жиров. Как правило, молекулы этого ряда содержат протяженный неполярный отрезок (цепь, X) и в большинстве случаев также содержат водорастворимую, полярную, гидрофильную группу, так называемую главную группу (Y). Основная структурная формула 1 для таких соединений выглядит как
X-Y_n (1)
где n больше или равно нулю. Липиды с n=0 называются неполярными липидами, с ni 1 - полярными липидами. В контексте настоящего описания все амфифильные вещества, такие как глицериды, глицерофосфолипиды, глицерофосфинолипиды, глицерофосфонолипиды, сульфолипиды, сфинголипиды, изопреноидлипиды, стероиды, стерины или стеролы и т.д. и все липиды, содержащие остатки углеводов, просто называются липидами. Для более подробного определения в качестве ссылки предлагается РСТ/ЕР91/01596.

"Погранично-активное" вещество или "поверхностно-активное вещество" в настоящей заявке обозначает любое вещество, увеличивающее склонность системы к образованию краев, выступов или других сильно изогнутых структур и отрезков с большим числом дефектов. В дополнение к обычным поверхностно-активным веществам к этой категории относятся вспомогательные поверхностно-активные вещества и другие молекулы, которые способствуют солюбилизации липидов в присутствии более часто используемых поверхностно-активных веществ; а также молекулы, которые индуцируют или способствуют образованию (по меньшей мере частично гидрофобных) дефектов в адсорбирующих (гетеро)агрегатах. Непосредственное поверхностно-активное действие или непрямой катализ (частичного) расслоения смеси молекул, или также вызванные поверхностно-активным веществом конформационные изменения соответствующих молекул часто являются причиной этого воздействия. Соответственно многие растворители, так же как и асимметричные, а следовательно, амфипатические, молекулы и полимеры, такие как многочисленные олиго- и полисахариды, олиго- и полипептиды, олиго- и полинуклеотиды и/или их производные принадлежат к вышеупомянутой категории в дополнение к более обычным часто используемым поверхностно-активным веществам. Довольно подробный список наиболее известных стандартных поверхностно-активных веществ, некоторых подходящих растворителей (иначе называемых вспомогательными поверхностно-активными веществами) и многих других подходящих поверхностно-активных веществ можно найти в описании РСТ/ЕР91/01596. Более полный список можно найти в Handbook of industrial surfactants; Michael Ash, Irene Ash, eds., Gower Publishing, 1993.

"Цепочечная молекула", или "макромолекула", представляет собой молекулу с линейной или разветвленной цепью, которая содержит группу(ы) по меньшей мере двух типов или видов строения с неодинаковым сродством к "адсорбирующей поверхности". Другое требование, характерное для соответствующего альтернативного (пункт 2) или объединенного (пункт 3) вариантов настоящего изобретения, состоит в том, что по меньшей мере один тип такой группы должен быть (частично) заряжен в донорном растворе и/или у адсорбирующей поверхности. Различное сродство к поверхности у отдельных групп часто объясняется их различной амфипатичностью, то есть различной гидрофильностью/гидрофобностью. Различные группы могут быть произвольно распределены вдоль цепи, однако часто несколько групп со сходными физическими свойствами (например, несколько гидрофильных или более одной гидрофобной) расположены на одном сегменте цепи.

"Макромолекулы", в соответствии со смыслом настоящей заявки среди прочих включают:
Углеводы, с основной формулой С_x(Н₂О)_y, например сахар, крахмал, целлюлоза и т.д., для осуществления настоящего изобретения наиболее часто нуждаются в модификации, чтобы придать им дополнительное сродство к связывающей поверхности. Это можно сделать, например, путем присоединения гидрофобных остатков к углеводам, предназначенным для ассоциации с (частично) гидрофобной поверхностью, или путем введения таких групп, которые могут участвовать в других некулоновских взаимодействиях (например, в образовании водородных связей) с более гидрофильной связывающей поверхностью.

Олиго- или полинуклеотиды, такие гомо- или гетеро-цепи дезоксирибонуклеиновой (ДНК) или рибонуклеиновой (РНК) кислоты, так же как их химические, биологические или молекулярно-биологические(генетические) модификации (для более детального определения следует рассмотреть списки, приведенные в РСТ/ЕР91/01596).

Олигопептиды или полипептиды включают 3-250, часто 4-100 и наиболее часто 10-50 одинаковых или разных аминокислот, которые естественным способом соединены амидными связями, но в случае протеомиметиков могут быть построены на основе различных схем полимеризации и могут даже быть частично или полностью циклическими; возможно использование оптически чистых соединений или рацемических смесей (см. РСТ/ЕР91/01596 для более подробного и полного определения).

Длинные полипептидные цепи обычно называют белками независимо от детальной конформации и точной степени полимеризации. Большинство белков, если не все, довольно эффективно ассоциируются с поверхностями.

Только для иллюстрации далее охарактеризованы несколько соответствующих классов.

Ферменты, которые включают оксидоредуктазы (включая различные дегидрогеназы, (пер)оксидазы, (супероксид)дисмутазы, и т.д.), трансферазы (такие как ацил-трансферазы, фосфорилазы и другие киназы), транспептидазы (такие как эстеразы, липазы и т.д.), лиазы (включая декарбоксилазы, изомеразы и т.д.), различные протеазы, коферменты и т.д.

Иммуноглобулины классов IgA, IgG, IgE, IgD, IgM всех подтипов, их фрагменты, такие как Fab- или Fab2-фрагменты, одноцепочечные антитела или их части, такие как вариабельные или гипервариабельные области, в природном виде или после химических, биохимических или генетических манипуляций могут быть полезны для настоящего изобретения. Они включают, но не ограничиваются ими, IgG-гамма-цепи, IgG- F(аb')2-фрагменты, IgG- F(ab), IgG- Fc фрагменты, Ig-каппа-цепи, легкие цепи иммуноглобулинов (например, каппа и лямбда цепи), а также включают более мелкие фрагменты иммуноглобулинов, такие как вариабельные или гипервариабельные области любого из этих веществ или фрагментов.

Иммунологически активные макромолекулы, иные, чем антитела (эндотоксины, цитокины, лимфокины и другие крупные иммуномодуляторы или биологические посредники) также принадлежат к классу гетерологичных цепных молекул. Также к ним относятся фитогемагглютинины, лектины, полиинозины, полицитидиловая кислота (поли I:С), эритропоэтин, "гранулоцитарно-макрофагальный колоностимулирующий фактор" (GM-CSF), интерлейкины с 1 по 18, интерфероны (альфа, бета или гамма и их (био)синтетические модификации), факторы некроза опухоли (TNFs); все достаточно крупные и амфипатические экстракты из тканей и растений, их химические, биохимические или биологические производные или заменители, их части и т.д. Все эти молекулы соответственно могут подходящим образом эффективно ассоциироваться с комплексными поверхностями, как описано в настоящем документе.

Другие биологически сходные примеры включают вещества, которые влияют на местный или общий рост, такие как основной фактор роста фибробластов (BFGF), фактор роста эндотелиальных клеток (ECGF), фактор роста эпидермиса (EGF), фактор роста фибробластов (FGF), инсулин, инсулиноподобные факторы роста (такие как LGF I и LGF II), факторы роста нервной ткани (такие как NСР-бета, NGF 2,5s, NGF 7s, и т.д.), фактор роста, полученный из тромбоцитов (PDGF), и т.д.

Производные, особенно полезные для целей настоящего изобретения, включают модификации, производимые (био)химическим, биологическим или генетическим путем, при которых молекулы адсорбата замещаются несколькими, часто более чем 3 неполярными (гидрофобными) остатками, такими как арил, алкильная, алкенильная, алкеноильная, гидроксиалкильная, алкенилгидроксильная или гидроксиацильная цепь с 1-24 атомами углерода в качестве подходящих групп, или реакциями, в результате которых увеличивается способность к участию в других некулоновских взаимодействиях между адсорбатом и адсорбентом. При гидрофобизации макромолекул предпочтительны боковые цепи с относительно небольшим числом (1-8, или даже лучше 1-4) атомов углерода. Из уровня техники известна обширная информация о том, как следует проводить гидрофобизацию цепных молекул для различных целей. Для целей настоящего изобретения исключается прочное соединение адсорбента, освещенное в других публикациях (Torchilin V.P.; Goldmacher V.S.; Smirnov V.N. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1978, 85: 983-990), не только из-за того, что оно известно из уровня техники, но также потому, что оно, вероятно, приведет к трудно обратимой ассоциации.

Из уровня техники также уже известно, что добавление поверхностно-активных веществ к мембране, построенной из амфипатического вещества, изменяет способность указанной мембраны к адаптации. Более того, уже высказывалось предположение о том, что этот факт можно использовать, чтобы улучшить транспортировку агента через поры, которые иначе являются слишком узкими, в барьере путем включения агента в миниатюрные капли, окруженные соответствующими мембранами и суспендированные в подходящей жидкой среде. Это описано более подробно в более ранних заявках РСТ/ЕР91/01596 и РСТ/ЕР96/04526.

Те пути, которые следует выбрать для оптимизации указанных везикул с мембранами с высокой способностью к адаптации с целью их проникновения сквозь поры в барьере, в целом не совпадают с теми шагами, которые нужно осуществить, чтобы обеспечивать или контролировать степень или скорость ассоциации между цепной молекулой с одной стороны и такими мембранами с другой стороны. Кроме этого, способность к трехмерной адаптации таких мембранных поверхностей, которые окружают указанные везикулы (а значит и возможность деформации самих везикул), не обязательно имеет значение, например, в процессах ассоциации, когда указанная поверхность, с которой ассоциируется указанная макромолекула, находится на твердой подложке и, следовательно, не должна обладать способностью к трехмерной адаптации, свойственной свободным мембранам.

Чтобы обеспечить и/или контролировать процессы макромолекулярной ассоциации с поверхностью, на чем сосредоточено настоящее изобретение, можно использовать два основных эффекта, на которые было указано выше.

Первое важное явление состоит в том, что амфипатические молекулы, т.е. уже обсуждавшиеся макромолекулы или цепочечные молекулы, лучше ассоциируются с протяженной поверхностью, которая включает по меньшей мере одно амфипатическое вещество, которое в свою очередь склонно к образованию протяженных поверхностей, и по меньшей мере еще одно вещество, которое является более растворимым в суспендирующей жидкой среде, а также склонно к образованию менее протяженных поверхностей, чем первое амфипатическое вещество. Иными словами, присутствие вещества, склонного дестабилизировать поверхность, придает границе раздела поверхность/раствор относительно большую аттрактивность по отношению к адсорбирующимся макромолекулам по сравнению с соответствующими поверхностями, образованными только менее растворимым веществом, образующим поверхность, в отсутствие предыдущего более растворимого дестабилизирующего поверхность второго вещества. Поверхность в контексте настоящего документа считается протяженной, если на ней возможно распространение и/или развитие кооперативного возбуждения поверхности в двух измерениях. Поверхность везикулы, например, удовлетворяет этому критерию, так как способствует неровностям или флуктуациям; в зависимости от гибкости мембраны средний диаметр везикул, необходимый для этого, имеет величину между 20 нм и несколькими сотнями нанометров. (Смешанные) липидные мицеллы, которые не достигают такого размера по меньшей мере в одном из направлений, не удовлетворяют этому требованию; в таком случае их поверхность не рассматривается как протяженная в соответствии со смыслом настоящего изобретения.

Второе, более растворимое и дестабилизирующее поверхность вещество, как правило, представляет собой погранично-активное вещество или поверхностно-активное вещество.

Второй недавно описанный эффект состоит в том, что вопреки ожиданиям электрически заряженные макромолекулы или цепочечные молекулы легче и лучше ассоциируются с одноименно заряженной поверхностью (т.е. заряды оба отрицательные или оба положительные), когда последняя является комплексной и включает по меньшей мере два амфипатических вещества, одно из которых является более растворимым, чем другое, и также склонно дестабилизировать поверхность, образованную менее растворимым веществом. Иными словами, хотя, как правило, справедливо, что одинаковые заряды отталкиваются друг от друга, заряженные макромолекулы или цепочечные молекулы могут ассоциироваться с одноименно заряженной поверхностью лучше, когда либо ассоциирующееся вещество и поверхность субстрата заряжены отрицательно, либо еще когда оба компонента, участвующих в процессе ассоциации, несут суммарный положительный заряд, при условии, что сложность поверхности делает возможными необходимые внутри- и межмолекулярные перегруппировки. Основываясь на существующем опыте, следовало бы ожидать, что ассоциация будет протекать легче и сильнее в случае, когда отрицательно заряженные макромолекулы ассоциируются с положительно заряженной поверхностью, т.е. когда ей способствует электростатическое притяжение, и наоборот.

Два эффекта, описанные в предыдущих абзацах, могут быть преимущественно объединенными, как это в особенности определено в независимом пункте 3.

Выбор амфипатических образующих поверхность веществ может определяться с точки зрения различной растворимости участвующих веществ, которые вместе образуют мембрану или поверхность, с которой собирается связаться макромолекула или цепочечная молекула и которая наиболее часто принимает форму везикул, суспендированных в жидкой среде. Как правило, эффект изобретения является более заметным, т. е. притягательность поверхности по отношению к связывающимся макромолекулам тем больше, чем сильнее различие растворимости участвующих молекул. Более растворимый ингредиент мембраны должен быть по меньшей мере в 10 раз, но предпочтительно по меньшей мере в 100 раз более растворимым, чем менее растворимый участвующий в построении поверхности компонент. Так, когда амфипатическое образующее поверхность вещество, такое как фосфолипид, объединено со вторым веществом, например поверхностно-активным веществом, в подходящей жидкой среде, такой как вода, значительно большие преимущества имеет использование в качестве второго компонента поверхностно-активного вещества, которое более растворимо в воде, чем фосфолипид (в нужном количестве).

С другой стороны, выбор, который следует сделать, может также определяться с точки зрения значений кривизны полученной поверхности. При использовании вышеупомянутого примера фосфолипида (в качестве основного образующего поверхность вещества), смешанного с поверхностно-активным веществом (в качестве дестабилизирующего поверхность более растворимого второго ингредиента) в воде (используемой в качестве жидкой среды), полученные везикулы приобретают некоторую характерную кривизну поверхности. (Средняя) кривизна, как правило, определяется как величина, обратная среднему радиусу пространства, заключенного внутри рассматриваемой поверхности. Как правило, добавление поверхностно-активного вещества будет увеличивать кривизну поверхности смешанных липидных везикул по сравнению с кривизной фосфолипидных везикул, не содержащих поверхностно-активного вещества. Если существует концентрация насыщения поверхностно-активного вещества, при которой стабильность изогнутой поверхности не подвергается катастрофическому риску, оптимальная концентрация поверхностно-активного вещества обычно выбирается так, чтобы она составляла менее 99% такой концентрации насыщения; чаще выбирают значение между 1 и 80 мол.%, даже более предпочтительно между 10 и 60 мол.% и наиболее предпочтительно между 20 и 50 мол.% от концентрации насыщения.

С другой стороны, если концентрация насыщения в рассматриваемой системе недостижима, благодаря тому, что после добавления поверхностно-активного вещества поверхность разрушается прежде, чем достигается насыщение, количество используемого поверхностно-активного вещества обычно составляет менее чем 99% от солюбилизирующей концентрации. Опять же, оптимальная концентрация поверхностно-активного вещества в системе часто находится между 1 и 80%, чаще между 10 и 60%, и предпочтительно между 20 и 50% от концентрации, ограничивающей образование абсорбирующей поверхности солюбилизированных смешанных липидных агрегатов, т.е. при более высокой концентрации, при которой протяженная поверхность заменяется значительно меньшей средней поверхностью.

Подходящая используемая на практике смесь веществ также может быть определена с точки зрения средних значений кривизны указанных поверхностей. Как указано в пункте 7, поверхности имеют среднюю кривизну (определяемую как величина, обратная среднему радиусу площадей, охватываемых поверхностями), соответствующую среднему радиусу между 15 и 5000 нм, часто между 30 и 1000 нм, чаще между 40 и 300 нм и наиболее предпочтительно между 50 и 150 нм. Следует отметить, однако, что кривизна адсорбирующей поверхности необязательно обусловлена свойствами адсорбирующей мембраны. Когда используются поверхности на твердой подложке и они построены в соответствии с настоящим изобретением из выбранной смеси амфипатических веществ, средняя кривизна указанных поверхностей обычно определяется кривизной поверхности твердой подложки.

Кроме этого, изобретение можно определить с точки зрения относительной концентрации связанных с поверхностью заряженных компонентов, по меньшей мере когда используется ассоциация между одноименными зарядами. Относительная концентрация таких связанных с поверхностью заряженных компонентов имеет величину между 5 и 100 мол.%, более предпочтительно между 10 и 80 мол.% и наиболее предпочтительно между 20 и 60 мол.% от концентрации всех образующих поверхность амфипатических веществ, вместе взятых. Определенная с точки зрения плотности суммарного заряда поверхности, поверхность характеризуется величинами плотности между 0,05 и 0,5 Кл•м^-2 (кулон на квадратный метр), даже лучше между 0,075 и 0,4 Кл•м^-2 и лучше всего между 0,10 и 0,35 Кл•м^-2.

Предпочтительно выбрать концентрацию и состав фонового электролита, который предпочтительно включает моно- и олиговалентные ионы, таким образом, чтобы достигнуть максимального положительного влияния взаимодействий заряд-заряд на желаемую ассоциацию. Как правило, поддерживают величину общей ионной силы между I=0,001 и I=1, предпочтительно между I=0,02 и I=0,5 и даже более предпочтительно между I=0,1 и 1=0,3.

Другое полезное определение изобретения сосредоточено на адсорбирующих поверхностях в виде мембраны, окружающей мельчайшую капельку жидкости. Такие мембраны часто подобны бислою и включают по меньшей мере два типа или вида (само)агрегирующихся амфифильных веществ, растворимость которых в (предпочтительно водной) жидкой среде, используемой для суспендирования капелек, различается по меньшей мере в 10 раз, предпочтительно по меньшей мере в 100 раз. В этих случаях выбор веществ, которые образуют мембрану, может быть продиктован требованием, чтобы средний диаметр гомоагрегатов более растворимого вещества или диаметр гетероагрегатов, включающих оба вещества, был меньше, чем средний диаметр гомоагрегатов, содержащих только менее растворимое вещество.

Общее содержание в системе всех амфипатических веществ, которые способны образовывать поверхность, предпочтительно имеет величину между 0,01 и 30 мас. %, особенно между 0,1 и 15 мас.%, и наиболее предпочтительно между 1 и 10 мас. % от общей сухой массы, в особенности если указанная комбинация используется для получения композиции для нанесения на тело или в человека или животного, главным образом для медицинских целей.

Вещество, участвующее в построении поверхности, или поддерживающее поверхность вещество, т.е. вещество, которое способно образовывать протяженные поверхности, может быть преимущественно выбрано среди биосовместимых полярных или неполярных липидов, особенно если адсорбирующая поверхность должна иметь структуру, подобную бислою. Конкретно в качестве основного образующего поверхность вещества может быть выбран липид или липоид из любого подходящего биологического источника или соответствующий синтетический липид, или модификация такого липида, предпочтительно глицерид, глицерофосфолипид, изопреноидлипид, сфинголипид, стероид, стерин, серо- или углеводсодержащий липид или любой другой липид, способный к образованию бислоев, в частности наполовину протонированная жидкая жирная кислота, и предпочтительно относящийся к классу фосфатидилхолинов, фосфатидилэтаноламинов, фосфатидилглицеринов, фосфатидилинозитолов, фосфатидных кислот, фосфатидилсеринов, сфингомиелинов или сфиногофосфолипидов, гликосфинголипидов (например, цереброзидов, керамидополигексозидов, сульфатидов, сфингоплазмалогенов), ганглиозидов или других гликолипидов или синтетических липидов, в частности из диолеил-, дилинолеил-, диленоленил-, диленоленоил-, диарахидоил-, дилауроил-, димиристоил-, дипальмитоил-, дистеароил- или соответствующих сфингозиновых производных, гликолипидов или диацил-, диалкеноил- или диалкил-липидов.

Другое дестабилизирующее поверхность и более растворимое вещество преимущественно представляет собой поверхностно-активное вещество и может преимущественно принадлежать к классу неионных, цвиттер-ионных, анионных или катионных моющих средств; в особенности подходящими для использования являются длинноцепочечная жирная кислота или спирт, соль алкил-три/ди/метиламмония, соль алкилсульфата, моновалентная соль холата, дезоксихолата, гликохолата, гликодезоксихолата, тауродезоксихолата или таурохолата, ацил- или алканоил-диметиламиноксид, в особенности додецил-диметиламиноксид, алкил- или алканоил-N-метилглюкамид, N-алкил-N, N-диметилглицин, 3-(ацилдиметиламонио)-алкансульфонат, N-ацилсульфобетаин, октилфениловый эфир полиэтиленгликоля, в особенности октилфениловый эфир нонаэтиленгликоля, ацил-полиэтиленовый эфир, в особенности нонаэтилендодециловый эфир, эфир изоацил-полиэтиленгликоля, в особенности изотридециловый эфир октаэтиленгликоля, ацил-полиэтиленовый эфир, в особенности октаэтилендодециловый эфир, сложный эфир ацил-сорбитан-полиэтиленгликоля, такой как полиэтиленгликоль-20-монолаурат (Tween 20) или полиэтиленгликоль-20-сорбитан-моноолеат (Tween 80), ацил-полигидроксиэтиленовый эфир, в особенности полигидроксиэтилен-лауриловый, -миристоиловый, -цетилстеариловый или -олеоиловый эфир, как в полигидроксиэтилене-4, или 6, или 8, или 10, или 12 и т.д., в лауриловом эфире (как в ряду Brij) или в соответствующем сложном эфире, например, ряда полигидроксиэтилен-8-стеарата (Myrj 45), -лаурата или -олеата, или полигидроксилированном касторовом масле (Chemophor EL), сорбитан-моноалкилате (например, в Arlacel или Span), в особенности в сорбитан-монолаурате (Arlacel-20, Span-20), ацил- или алканоил-N-метилглюкамиде, в особенности или в деканоил- или додеканоил-N-метилглюкамиде, алкил-сульфате (соли), например в лаурил- или олеил-сульфате, дезоксихолат натрия, гликодезоксихолат натрия, олеат натрия, таурат натрия, соль жирной кислоты, такая как элаидат натрия, линолеат натрия, лаурат натрия, лизофосфолипид, такой как н-октадецилен(= олеил)-глицерофосфатидная кислота, - фосфорилглицерин или фосфорилсерин, н-ацил-, например, лаурил или олеил-глицеро-фосфатидная кислота, -фосфорилглицерин или фосфорилсерин, н-тетрадецил-глицеро-фосфатидная кислота, -фосфорилглицерин или фосфорилсерин, соответствующий пальмитолеил-, элаидоил-, вакценил-лизофосфолипид или соответствующий фосфолипид с короткой цепью, или еще поверхностно-активный полипептид.

Концентрация заряженных компонентов мембраны часто находится в интервале относительных концентраций 1-80 мол.%, предпочтительно 10-60 мол.%, и наиболее предпочтительно между 30-50 мол.%, рассчитанном на основе количества всех компонентов, участвующих в построении мембраны.

Предпочтительно, чтобы фосфатидилхолин и/или фосфатидилглицерин был выбран в качестве поддерживающего поверхность вещества, и лизофосфолипид, такой как лизофосфатидная кислота или метилфосфатидная кислота, лизофосфатидилглицерин или лизофосфатидилхолин, или частично N-метилированный лизофосфатидилэтаноламин, моновалентная соль холата, дезоксихолата-, гликохолата, гликодезоксихолата или любого другого достаточно полярного производного стерина, лаурата, миристата, пальмитата, олеата, пальмитолеата, элаидата или какой-либо другой соли жирной кислоты и/или поверхостно-активное вещество Tween-, Myrj- или Brij- типа, или еще Triton, - поверхностно-активные сульфонат или -сульфобетаин, -N-глюкамид или сорбитан (Arlacel или Span) жирной кислоты выбирают в качестве вещества, менее способного к образованию протяженной поверхности.

Преимущественно средний радиус пространства, заключенного указанными протяженными поверхностями, имеет величину между 15 и 5000 нм, часто между 30 и 1000 нм, чаще между 40 и 300 нм и наиболее предпочтительно между 50 и 150 нм.

Как правило, вещество третьего типа, которое ассоциируется с протяженной поверхностью, образованной комбинацией двух других веществ (и в случае, когда требуется, третьим, четвертым, пятым и т.д. веществом), может включать любую молекулу с повторяющимися субъединицами, в особенности в виде цепных молекул. Так, третье вещество может являться олигомером или полимером. В особенности оно может являться амфипатическим макромолекулярным веществом со средней молекулярной массой более 800 дальтон, предпочтительно более 1000 дальтон и часто даже более 1500 дальтон. Обычно такие вещества имеют биологическое происхождение или являются аналогами биологических веществ и преимущественно обладают биологической активностью, т.е. являются биоагентами.

Третье вещество (вещество третьего типа) предпочтительно ассоциируется с мембраноподобными протяженными поверхностями по изобретению, в особенности путем внедрения в пограничный слой (или пограничные слои) между мембраной и жидкой средой, причем этот пограничный(ые) слой(слои) являет(ют)ся неотъемлемой частью указанных мембран.

Содержание указанного третьего вещества (молекул) или соответствующих цепочечных молекул, как правило, имеет величину между 0,001 и 50 мас.% в расчете на массу адсорбирующей поверхности. Часто это содержание имеет величину между 0,1 и 35 мас.%, более предпочтительно между 0,5 и 25 мас.% и главным образом между 1 и 20 мас.% с использованием тех же относительных единиц, причем обнаружено, что конкретная величина соотношения часто уменьшается с увеличением молярной массы указанных цепочечных молекул.

Обнаружено, что является ли адсорбирующаяся макромолекула или цепочечная молекула белком или частью белка, она, как правило, может ассоциироваться с адсорбирующей поверхностью в соответствии со смыслом настоящего изобретения при условии, что такая частица включает по меньшей мере три сегмента или функциональных группы, способных связываться с адсорбирующей поверхностью.

Макромолекулы или цепочечные молекулы, которые в соответствии с настоящим изобретением способны к ассоциации с протяженной поверхностью, образованной указанными амфипатическими веществами, могут принадлежать к классу полинуклеотидов, таких ДНК или РНК, или полисахаридов с по меньшей мере частичной способностью взаимодействовать с поверхностью, будь они в природной форме или после некоторой подходящей химической, биохимической или генетической модификации.

Цепочечные молекулы, ассоциирующиеся с протяженной поверхностью, могут иметь разнообразные физиологические функции и действовать, например, как адренокортикостатический, b-адренолитический, андрогенный или антиандрогенный, антипаразитичекий, анаболический, анестетический или анальгетический, аналептический, антиаллергический, антиаритмический, антиатеросклеротический, антиастматический и/или бронхоспазмолитический, антибиотический, антидепрессивный и/или антипсихотический, антидиабетический агент, антидот, противорвотный, антиэпилептический, антифибринолитический, противосудорожный, антихолинэргический агент, фермент, кофермент или соответствующий ингибитор, антигистаминный, антигипертонический агент, биологический ингибитор лекарственной активности, антигипотонический, антикоагулянтный, противогрибковый, антимиастенический агент, агент против болезни Паркинсона или болезни Альцгеймера, противовоспалительный, жаропонижающий, противоревматический, антисептический, респираторный аналептический или респираторный стимулирующий, бронхолитический, кардиотонический, хемотерапевтический агент, коронарный дилататор, цитостатический, диуретический агент, ганглиоблокатор, глюкокортикоид, противогриппозный агент, гемостатический, гипнотический агент, иммуноглобулин или его фрагмент или любое другое иммунологически активное вещество, биологически активный углевод(производное), контацептив, агент против мигрени, минералокортикоид, антагонист морфина, миорелаксант, наркотический, нейротерапевтический, нейролептический агент, нейромедиатор или один из его антагонистов, пептид(производное), агент для лечения глазных болезней, (пара)-симпатомиметический или (пара)-симпатолитический агент, белок(производное), лекарственное средство против псориаза/нейродермита, мидриатический, психостимулирующий, ринологический агент, любой агент, вызывающий сон, или его антагонист, седативный агент, спазмолитический, туберкулостатический, урологический, сосудосуживающий или сосудорасширяющий, вирустатический агент или любое средство для лечения ран, или любая комбинация вышеперечисленных агентов.

Изобретение также может быть преимущественно использовано, когда третье вещество является агентом, регулирующим рост.

Другие примеры преимущественных вариантов осуществления изобретения включают третье вещество, выбранное из класса иммунорегуляторов, включающего антитела, цитокины, лимфокины, хемокины и соответственно активные части растений, бактерий, вирусов, патогенов или других иммуногенов, или части или модификации любых из них; ферментов, коферментов или какого-либо другого типа биокатализаторов; узнающих молекул, включая среди прочих адгерины, антитела, катенины, селектины, шапероны или их части; гормонов, в особенности инсулина.

В случае инсулина комбинация по изобретению предпочтительно содержит от 1 до 500 межд. ед. инсулина/мл, в частности между 20 и 400 межд. ед. инсулина/мл и наиболее предпочтительно между 50 и 250 межд. ед. инсулина/мл в качестве активного вещества. Предпочтительно в виде лекарственного средства используется рекомбинантный человеческий инсулин или подобный человеческому инсулин.

Другие преимущественные виды использования настоящего изобретения включают применение разнообразных цитокинов, таких как интерлейкины или интерфероны, причем указанные интерлейкины подходят для использования на человеке или животных и включают IL-2, IL-4, IL-8, IL-10, IL-12, и указанные интерфероны подходят для использования на человеке или животных и включают, но не ограничиваются ими, IF альфа, бета и гамма.

Указанная комбинация содержит между 0,01 и 20 мг интерлейкина/мл, в частности между 0,1 и 15 мг и наиболее предпочтительно между 1 и 10 мг интерлейкина/мл, при необходимости после окончательного разбавления для достижения практически требуемого интервала концентрации лекарственного средства.

Указанная комбинация содержит до 20 относительных мас.% интерферона, в частности, между 0,1 и 15 мг интерферона/мл и наиболее предпочтительно между 1 и 10 мг интерферона/мл, при необходимости после окончательного разбавления, за счет которого устанавливается концентрация лекарственного средства в интервале практически предпочтительных концентраций.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения описывается введение фактора роста нервной ткани (NGF), ассоциированного в качестве (третьего) активного вещества с поверхностями по изобретению. Предпочтительным видом данного агента является человеческий рекомбинантный NGF, оптимальные интервалы концентрации для его применения составляют до 25 мг фактора роста нервной ткани (NGF)/мл суспензии или до 25 относительных мас.% NGF в качестве агента, в особенности 0,1-15 отн. мас.% белка и наиболее предпочтительно между 1 и 10 отн. мас.% NGF, при необходимости разбавленного перед использованием.

Существует возможность использования описанной здесь технологии по изобретению с целью введения иммуноглобулина (Ig) в виде интактных антител, частей антител или каких-либо других их биологически приемлемых и активных модификаций. Преимущественно суспензия содержит до 25 мг иммуноглобулина (Ig)/мл суспензии или до 25 мас.% Ig, относительно общего содержания липидов, предпочтительно с 0,1 до 15 отн. мас.% белка и наиболее предпочтительно с 1 до 10 отн. мас.% иммуноглобулина.

В изобретении описаны способы получения охарактеризованных выше комбинаций, в особенности в качестве композиций активного агента, в особенности биологически, косметически и/или фармацевтически активного агента, как обсуждалось выше, причем эти способы включают выбор по меньшей мере двух амфипатических веществ, которые отличаются по своей растворимости в подходящей жидкой среде и которые, по меньшей мере в комбинации, способны образовывать протяженную поверхность, в особенности в виде мембраны, при контакте с указанной средой. Рекомендуется в качестве критерия отбора для этих способов использовать протяженную поверхность, образованную комбинацией веществ, способной притягивать активный агент и способствовать ассоциации с указанной поверхностью, при условии, что указанная поверхность более аттрактивна для этого агента, чем поверхность, образованная только тем из двух веществ, которое образует более протяженные поверхности само по себе, чем другое вещество само по себе, и/или выбрать по меньшей мере два амфипатических вещества, которые отличаются по своей растворимости в подходящей жидкой среде, при условии, что такие вещества, по меньшей мере в комбинации, способны образовывать протяженную поверхность, в особенности мембраноподобную поверхность при соприкосновении с указанной средой, а также при условии, что указанная поверхность, включающая комбинацию обоих веществ, является более притягательной для активного агента и обладает лучшей способностью его связывания, чем поверхность, образованная одним только тем из двух веществ, которое образует более протяженные поверхности, чем другое вещество, и последнее, но не менее важное условие состоит в том, что в случае, когда как поверхность, так и агент несут суммарный электрический заряд, и поверхность, и агент в среднем являются оба отрицательно заряженными или оба положительно заряженными.

Предпочтительные способы получения протяженных поверхностей по изобретению включают механические операции, производимые над соответствующей смесью веществ, такие как фильтрация, изменение давления или механическая гомогенизация, встряхивание, смешивание, перемешивание или действие любого другого способа контролируемой механической фрагментации в присутствии молекул агента, которые должны ассоциироваться с поверхностью, образовавшейся в процессе такой обработки.

Предпочтительно, если выбранной комбинации образующих поверхность веществ позволяют адсорбироваться на подходящей(их) поверхности(ях), являющей(их)ся твердой подложкой или каким-либо другим путем приводят выбранную комбинацию в постоянный контакт с ней (ними), а затем с жидкой средой путем добавления одного вещества вслед за другим или нескольких одновременно, причем по меньшей мере одна из последних стадий образования поверхности проводится в присутствии агента, который впоследствии ассоциируется с поверхностью на твердой подложке.

Преимущественным является вариант, когда сначала получают адсорбирующие поверхности или их предшественники, суспендированные в жидкой среде или на твердой подложке, при "помощи стадий, которые могут включать последовательное смешивание образующих поверхность молекул, и затем добавляют ассоциирующиеся молекулы и позволяют им ассоциироваться с указанными поверхностями, при необходимости при помощи взбалтывания, перемешивания или инкубации, при условии, что такая обработка не разрушит предварительно образованные поверхности.

В соответствии с настоящим изобретением предпочтительным способом получения композиций для неинвазивного применения различных агентов, в особенности через неповрежденную кожу человека или животных или растений, является создание поверхностей, способных ассоциироваться с молекулами агента в комплексы, включающие по меньшей мере одно амфифильное вещество, по меньшей мере одну гидрофильную жидкость, по меньшей мере одно погранично-активное или поверхностно-активное вещество и по меньшей мере один агент. Вместе эти ингредиенты составляют композицию, пригодную для неинвазивного применения агента, причем могут также быть добавлены другие общепринятые ингредиенты, подходящие и необходимые для достижения желаемых свойств и стабильности конечного состава.

При осуществлении способа можно преимущественно смешивать выбранные ингредиенты раздельно и, если требуется, со/растворять компоненты с образованием раствора, затем объединить полученные смесь(и) или раствор(ы), чтобы в конце вызвать образование связывающихся с агентом частиц или поверхностей, предпочтительно под действием механической энергии, как уже обсуждалось.

Амфифильные вещества, подходящие для этой цели, как описано в настоящем изобретении, могут использоваться либо как таковые, либо растворенными в физиологически совместимой полярной жидкости, такой как вода, или смешивающийся с ней растворитель, или в способствующем сольватации реагенте, вместе с полярным раствором, который, кроме того, включает по меньшей мере одно погранично-активное вещество или поверхностно-активное вещество.

Одним из предпочтительных путей индукции образования притягивающих агент поверхностей является добавление вещества в жидкую фазу. Альтернативные варианты включают его испарение с обращенной фазы, инъекцию или диализ или оказание механического воздействия, например встряхивание, перемешивание, вибрация, гомогенизация, обработка ультразвуком (т.е. воздействие ультразвуковых волн), срез, замораживание и оттаивание или фильтрование с использованием обычного подходящего вытесняющего давления. Когда используют фильтрование, фильтрующий материал может быть преимущественно выбран таким образом, чтобы он имел размер пор между 0,01 и 0,8 мкм, предпочтительно между 0,02 и 0,3 мкм и наиболее предпочтительно между 0,05 и 0,15 мкм. Можно использовать несколько фильтров последовательно или параллельно, что является более подходящим, чтобы добиться требуемого эффекта образования поверхности и максимально увеличить простоту и быстроту процесса.

Преимущественно, если указанные агенты и носители ассоциированы, по меньшей мере частично, после образования адсорбирующей поверхности.

Для практических целей можно образовывать ассоциаты между молекулами агента и связывающими поверхностями непосредственно перед применением полученной композиции. В этом случае в качестве исходного материала можно использовать концентрат или лиофилизат.

Изобретение описывает получение носителей для агентов, в особенности для целей доставки лекарственных средств, депо-препаратов или для любого другого вида их использования в медицине или биологии. Так, можно использовать изобретение также в области пенетрации через поры в барьере; в этом случае преимущественно получают ассоциирующую поверхность в виде мембраны, образованной амфипатическими молекулами, окружающей мельчайшие капельки, как уже известно из уровня техники, с молекулами агента, ассоциированными поверхностью указанных капель, которые переносятся с помощью указанных ультра-деформируемых капелек через поры в барьере, даже если средний диаметр пор в барьере меньше, чем средний диаметр капелек или везикул. Однако может возникнуть необходимость согласования свойств, обеспечивающих ассоциацию, с одной стороны, и свойств, обеспечивающих наилучшую способность мембраны к адаптации, с другой стороны, поскольку эти два свойства, как уже обсуждалось выше, не обязательно совпадают и чаще всего на самом деле отличаются от оптимальных свойств состава, определяемого одной способностью везикулярных мембран к адаптации для прохождения через поры.

Другие возможности использования ассоциатов по изобретению включают применение в биоинженерии, генетических манипуляциях, а также применение в технологии разделения, для целей (био)технологии и диагностических целей. Здесь, как и в других случаях использования изобретения, включая ферментативные процессы и катализ, может оказаться полезным тот аспект изобретения, согласно которому ассоциирующаяся поверхность предпочтительнее может находиться на твердой подложке, чем использоваться в виде мембранной везикулы. Это позволяет зафиксировать поверхности по изобретению на твердой подложке, которую затем подходящим образом обрабатывают, присоединяют, разделяют, концентрируют и т.д., например, с целью в максимально возможной степени зафиксировать на твердой подложке каталитически активные макромолекулы, ассоциированные с этим типом поверхности.

Существует возможность стабилизации ассоциирующихся с поверхностью молекул, в особенности цепных молекул, которые по меньшей мере частично являются амфипатическими, таких как (модифицированные) белки, полипептиды, полинуклеотиды или полисахариды, и/или в каталитических процессах, в которых участвуют эти молекулы, в ассоциированном с поверхностью состоянии. Следовательно, можно использовать настоящее изобретение для получения, скажем, колонок, заполненных каталитически активными, высокоаффинными или селективными или обладающими иной активностью макромолекулами. Одним из примеров такого использования являются химические реакции, которые проводят путем пропускания подходящего (их) реагента(ов), например в растворе, через колонку, содержащую поверхности на твердой подложке с нековалентно присоединенными к ним активными молекулами, окружающими поверхность, где происходит реакция с участием указанных активных макромолекул при прохождении раствора через иммобилизованные макромолекулы.

В другом иллюстративном примере раствор с молекулами, по меньшей мере часть из которых нужно отделить от раствора, пропускают через колонку или приводят в контакт с суспензией адсорбирующих поверхностей на твердой подложке с целью сначала позволить молекулам-мишеням ассоциироваться с поверхностью субстрата, а затем разделить жидкую и твердую фазы любым подходящим способом, включая, но не ограничиваясь ими, центрифугирование, осаждение, флотацию (совместно с центрифугированием или без него) электрическое или магнитное разделение частиц адсорбента, и т.д.

Другая возможность использования настоящего изобретения относится к контролю кинетики и/или обратимости ассоциации или диссоциации между указанными ассоциирующимися с поверхностью молекулами с одной стороны и комплексной адаптируемой поверхностью, образованной в соответствии с настоящим изобретением путем комбинации подходящих амфипатических веществ, при котором увеличение плотности заряда на поверхности и/или увеличение мягкости поверхности и/или плотности дефектов на поверхности может быть использовано для ускорения ассоциации. Уменьшение соответствующих параметров может быть использовано для снижения скорости ассоциации или еще для индукции частичной или полной диссоциации.

Температура приготовления композиции и ее хранения редко выходит за пределы интервала от 0 до 95^oС. Вследствие чувствительности к температурным условиям многих интересующих нас ингредиентов, в особенности многих макромолекул, предпочтительной является температура ниже 70^oС и даже ниже 45^oС. Использование неводных растворителей, крио- и термостабилизаторов может позволить работать при различных интервалах температур. Практическое применение изобретения обычно осуществляется при комнатной или физиологической температуре, но его использование при различных температурах также возможно и может потребоваться для конкретных композиций и применений. Одной из возможных причин для этого является поддержание эффективности к адаптации (гибкости, знака заряда и/или плотности заряда) адсорбирующей поверхности при повышенных температурах; другим возможным примером является сохранение агентов в активной форме при низких температурах.

Характеристики композиции обоснованно определяются наиболее чувствительным компонентом системы. Преимущественным может являться хранение в холодных условиях (например, при 4^oС), а также в инертной атмосфере (например, в атмосфере азота).

Описанные композиции могут быть созданы на участке их применения с использованием методик, характерных для адсорбента или адсорбата, в зависимости от того, какой из них важнее. (Примеры адсорбентов на основе фосфолипидов можно найти в "Liposomes" (Gregoriadis G., ed., CRS Press,
Bоca Raton, Fl. , Vols 1-3, 1987); 'Liposomes as drug carriers' Gregoriadis G. , ed., John Wiley & Sons, New York, 1988; 'Liposomes. A Practical Approach', New, R., Oxford-Press, 1989). Композиция также может быть разбавлена или сконцентрирована (например, при помощи ультрацентрифугирования или ультрафильтрации).

В нужное время или перед использованием композиции, в нее могут быть введены добавки, чтобы улучшить химическую или биологическую стабильность конечной композиции, (макро)молекулярную ассоциацию или изменение, кинетику дис/ассоциации, легкость введения, совместимость, и т.д.

Интересующие нас добавки включают разнообразные оптимизирующие систему растворители (концентрация которых не должна выходить за пределы, определяемые поддержанием или достижением требуемых характеристик системы), химические стабилизаторы (например, антиоксиданты и другие поглотители), буфера, и т. д. , усилители адсорбции, биологически активные молекулы-адьюванты (например, бактерицидные, виростатические агенты), и т.д.

Растворители, подходящие для вышеупомянутой цели, включают, но не ограничиваются ими, незамещенные или замещенные, например галогенированные, алифатические, циклоалифатические, ароматические или ароматико-алифатические углеводороды, такие как бензол, толуол, метиленхлорид, дихлорметан или хлороформ, спирты, такие как метанол или этанол, пропанол, этиленгликоль, пропандиол, глицерин, эритрит, коротко-цепочечные алкиловые эфиры карбоновых кислот, таких как уксусная кислота, алкиловые эфиры кислот, такие как диэтиловый эфир, диоксан или тетрагидрофуран и т.д., или их смеси.

Может также понадобиться изменить значение рН смеси адсорбент/адсорбат после ее получения или непосредственно перед использованием. Это должно предотвратить разрушение отдельных компонентов системы и/или ассоциатов. Также это должно улучшить биологическую активность или физиологическую совместимость полученной смеси. Для нейтрализации смеси для биологического применения in vivo или in vitro часто используются биосовместимые кислоты или основания для получения значения рН между 3-12, часто от 5 до 9 и наиболее часто в интервале между 6 и 8, в зависимости от цели или участка применения. Физиологически приемлемыми кислотами являются, например, разбавленные водные растворы неорганических кислот, таких как соляная кислота, серная кислота или фосфорная кислота, и органических кислот, таких как карбоксиалкановые кислоты, например, уксусная кислота. Физиологически приемлемыми основаниями являются, например, разбавленный гидроксид натрия, подходящим образом ионизированные фосфорные кислоты и т.д.

Все прямо или косвенно упомянутые липиды и поверхностно-активные вещества являются известными. Обзор липидов и фосфолипидов, которые образуют агрегаты, подходящие для ассоциации с макромолекулами, приведен, например, в 'Phospholipids Handbook' (Cevc G., ed., Marcel Dekker, New York, 1993), 'An Introduction to the Chemistry and Biochemistry of Fatty acids and Their Glycerides' (Gunstone F. D. ed.). Обзор коммерческих поверхностно-активных веществ приведен в каталогах 'Mc Cutcheon's, Emulsifiers & Detergents', (Manufacturing Confectioner Publishing Co.) и в других источниках такой как Handbook of Industrial Surfactants M. Ash & I. Ash, eds. Cower, 1993. Обзор релевантных активных соединений приведен, например, в 'Deutsches Arzneibuch', The British Pharmaceutical Guide, European Pharmacopoeia, Japanese Pharmacopoeia, The United States Pharmacopoeia, и т.д. Релевантные макромолекулы описаны в промышленных каталогах, в научной периодике на эту тему и в специализированных изданиях.

Данное описание раскрывает некоторые релевантные свойства ассоциатов, продемонстрированные на примере некоторых выбранных смесей полипептид/белок и фосфолипид/поверхностно-активное вещество. Обоснованность общих выводов не ограничивается представленным выбором, так же как и полученными ассоциатами, исключительно полезными в области медицины и ветеринарии.

Следующие примеры должны иллюстрировать изобретение, не устанавливая или очерчивая при этом его ограничения. Температура приведена во всех примерах в градусах Цельсия, размеры носителей в нанометрах, соотношения и процентное содержание приведено в мольных единицах. Все единицы приведены в системе СИ, если нет особых указаний.

Примеры
Следующие эксперименты проводят для того, чтобы определить способность инсулина к связыванию на комплексных везикулах. Используют различные составы композиций везикул. Варианты включают различные поверностно-активные вещества и липиды для введения суммарного заряда на/в везикулы, различные соотношения липид/детергент, различное общее содержание липидов и различные типы и концентрации инсулина.

В первых сериях экспериментов, комплексные липидные везикулы, содержащие смесь фосфолипид/биоповерностно-активное вещество, объединяют с инсулином при различных соотношениях белок/липид, для того, чтобы найти максимум связывания. Подходящие, однокомпонентные везикулы (липосомы) используют для сравнения.

Примеры 1-27 Ультрадеформируемые и гибкие везикулы (Transfersomes^TM).

Исходная суспензия
Общее липидное (TL) содержание 10 мас.%, включающее:
874,4 мг фосфатидилхолина из бобов сои;
125,6 мг холата натрия;
9 мл фосфатного буфера, рН 7.1.

Конечная суспензия А
TL содержание 5 мас. %, включающее липиды, перечисленные выше, и 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4 мг инсулина на 100 мг TL
Для достижения требуемых разбавлений, хранящийся раствор инсулина (4 мг/мл Actrapid^ТМ Novo-Nordisk) смешивают с буфером (см. табл.1).

Конечные суспензии А готовят путем смешивания 2,5 мл исходной липидной суспензии (10% TL) и 2,5 мл подходящего инсулинового разбавления.

Конечная суспензия В
TL содержание от 5 до 0,25 мас.%, включающее липиды, приведенные выше,
и 4, 5, 6,67, 10, 20, 40, и 80 мг инсулина на 100 мг TL
Для того, чтобы получить различные соотношения инсулина/липида используют схему пипетирования, приведенную в табл.2.

Конечные суспензии В готовят путем смешивания 2,5 мл Actrapid НМ (4 мг/мл инсулина) с 2,5 мл соответствующим образом разбавленной суспензии липида.

Конечная суспензия С
TL содержание от 2,5 до 0,125 мас.%, включающее липиды, приведенные выше, и
4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 80 и 160 мг инсулина на 100 мг TL.

Для получения указанных соотношений инсулин/липид, используют схему пипетирования, приведенную в табл.3.

Для тестовых серий С 5%-ную суспензию везикул готовят из 10%-ной хранящейся суспензии путем ее разбавления 1:1 объем : объем буфером и повторения процесса фильтрования и замораживания-оттаивания, как описано ниже.

Приготовление смеси адсорбент/адсорбат. Буфер готовят, используя стандартные методы, и фильтруют через 0,2 микрометровый стерильный фильтр. (Для дальнейшего использования раствор хранят в стеклянном сосуде.) Смесь липидов суспендируют в буфер в стерильном стеклянном сосуде, плотно закрывают, и перемешивают на магнитной мешалке 2 дня при комнатной температуре. Затем суспензию экструдируют последовательно через протравленные (etched-track) поликарбонатные мембраны (Nucleopore тип) с номинальным размером пор 400, 100 и 50 нм соответственно. Каждый раз делают три прохода, используя вытесняющее давление между 0,6 и 0,8 МПа. Полученную суспензию везикул замораживают и размораживают 5 раз при соответствующей темппературе от -70 и до +50^oС. Для получения требуемого конечного размера везикул суспензию вновь экструдируют 4 раза через 100 нм фильтр при 0,7 МПа. На последней стадии высокодеформируемые везикулы стерилизуют путем фильтрования через стерильный шприцовый фильтр с 200 нм порами. Везикулы хранят в стерильных полиэтиленовых контейнерах при 4^oС до их использования.

Каждая инсулиновая молекула несет отрицательный суммарный заряд в области нейтральных рН благодаря избытку отрицательно заряженных аминокислот по отношению к положительно заряженным аминокислотам выше рH 5,4.

Для многих, включая данное исследование ассоциации, используют продажный раствор инсулина (Actrapid^TM из Novo-Nordisk) Таким образом, исходный раствор белка, содержит 4 мг инсулина/мл и 3 мг m-крезола/мл. Получают различные номинальные соотношения инсулина/липида путем добавления соответствующего количества такого раствора к суспензии адсорбирующих везикул. Полученные смеси инсулина-носителя осторожно, но тщательно перемешивают и инкубируют по крайней мере 2 часа в зависимости от эксперимента при комнатной температуре.

В тестовых сериях А конечную суспензию готовят путем разбавления исходной суспезии везикул Actrapid с получением конечной концентрации липидов: 50 мг TL/мл и различные соотношения белок/липид. В тестовых сериях В конечная липидная концентрация варьируется между 2,5 и 40 мг/мл в зависимости от соотношения инсулин/TL. В опытных сериях С конечная липидная концентрация находится в интервале от 1,25 до 25 мг/мл. Для сравнения аналогичные разбавленные серии готовят, используя буфер вместо липидной суспензии.

Тестовые измерения проводят с 4 мл каждой смеси инсулин/везикулы. Через 2 часа липидные везикулы отделяют от водной нижней фазы, чтобы определить, какое количество инсулина каким-либо путем ассоциировалось с липидными везикулами, и как много остается несвязанным в водной нижней фазе. Для этой цели используют CENTRISART I-ультрацентрифужные пробирки с насечкой на 100000 Да. Используют три пробирки для каждого разбавления с помощью 1 мл содержащей инсулин суспензии, и центрифугируют при 2000 g 3 часа (Т=10^oС). Определяют концентрацию инсулина в образовавшемся оптически прозрачном супернатанте (допустимо содержащем только буфер, инсулин и некоторое количество смешанных липидных (фосфатидилхолин/холат) мицелл вместе с растворенным детергентом). Супернатанты, которые не являются оптически прозрачными, отбрасывают, поскольку было показано, что они загрязнены липидными везикулами, проскочившими через CENTRISAT I фильтры, имеющие дефекты. Используют стандартный HPLC процесс для всех определений инсулина, упомянутых в данном описании. Измерения дублируют.

Первоначальные разбавления служат в качестве положительного контроля. При отрицательном контроле определяют величину не специфической адсорбции инсулина на тестовом устройстве. После коррекции с учетом такого не специфического связывания, подсчитывают разницу между исходной и конечной концентрацией инсулина в супернатанте. "Недостающий" инсулин определяют как ассоциированный с везикулами и его выражают в абсолютных или относительных единицах.

Результаты описанного выше эксперимента приведены на фигуре 1. Они показывают, что при соотношении инсулин/липид ниже 6 мг/100 мг TL, 80-90% добавленного белка ассоциируется (связывается) с везикулами. При более высоких соотношениях инсулин/липид, относительная эффективность ассоциации белок-поверхность снижается, и достигает только 5% связывания для 2/5 (40 мг/100 мг) разбавления. Другими словами, 2 мг из каждых добавленных 40 мг инсулина при высоком разбавлении и высоком соотношении белок/липид стремится ассоциироваться (номинально) со 100 мг липида в форме высокодеформируемых везикул.

Пролонгирование времени инкубации или, но в меньшей степени, увеличение концентрации добавляемой суспензии улучшает ситуацию (фигуры 2 и 3).

Примеры 28-45.

Стандартные везикулы (липосомы), исходная суспензия:
1 г фосфатидилхолина из бобов сои;
9 мл фосфатного буфера, рН 7.1.

Конечная суспензия А
TL содержание 5 мас.%, включающее перечисленные выше липиды и
0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4 мг инсулина на 100 мг TL
(0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4 отн. мас.%).

Конечная суспензия В
TL содержание от 5 до 0,25 мас.%, включающее липиды приведенные выше и
4, 5, 6, 7, 10, 20, 40 и 80 мг инсулин на 100 мг TL.

Исходную липидную суспензию готовят как описано в примерах 1-27. Однако для того, чтобы получить достаточно монодисперсное приготовление довольно маленьких липосом, проводят 6 дополнительных экструзий через 100 нм фильтры.

Связывание инсулина с тестируемыми липосомами было очень низким. Только от 2 до 5% вводимого лекарственного средства связывалось со стандартными липидными везикулами в интервале разбавлений от 4 до 100 мг/мл - разбавления (графические данные не приведены).

Для определения и экспериментального исключения воздействия разбавления суспензии на состав высокодеформируемых комплексных везикул, проводят следующие эксперименты.

Примеры 46-59.

Исходная суспензия:
874,4 мг фосфатидилхолина из бобов сои;
125,6 мг холата натрия (дающего 10 об.% TL содержания);
9 мл фосфатного буфера, рН 7,1.

Конечная суспензия:
Состав конечных суспензий был таким же, как в сериях В и С примеров 1-27, включая уменьшающиеся конечные липидные концентрации.

Измеренные соотношения инсулина/липида были следующими: 4, 8, 10, 20, 40, 80, 160 мг инсулина на 100 мг TL
Приготовление суспензии везикул соответствует описанию, приведенному в примерах 1-27 для установленных соотношений инсулин/липид, за исключением того, что в этом случае разбавления проводят или помощи Actrapid, содержащего 10 мM холата и/или при помощи буфера, содержащего от 5 до 20 мМ холата (для контрольных и тестовых образцов). Это делают таким образом, что конечная концентрация холата во всех образцах составляет 5 мМ, что близко к КМЦ этого детергента, для того, чтобы предотвратить диссоциацию холата от мембраны везикулы после разбавления.

При предотвращении отмывания холата с везикул сохраняется не только исходный существующий состав везикул, но также и средняя плотность заряда поверхности везикулы. Эти улучшения отражаются на связывании.

В примерах данных тестовых серий особая осторожность соблюдалась для сохранения номинальной концентрации холата ниже 5 мМ уровня во время процесса пипетирования, для предотвращения случайной солюбилизации везикул, которая особенно вероятна в интервале низких общих липидных концентраций.

Результаты показывают, что вплоть до массового соотношения белок/липид 10%, между 80 и 90% добавленного инсулина связывается с поверхностью липидной везикулы (фигура 4). Это означает, что ассоциация адсорбент/адсорбат является практически полной и эффективность связывания белка очень высока. Процентное содержание белка, ассоциированного с липидом, медленно снижается с повышением соотношения белок/липид и достигает 7% при 1,6 мг инсулина/1 мг липида.

Абсолютное количество носитель-ассоциированный инсулин достигает максимума приблизительно при 0,4 мг инсулина на 1 мг липида, когда 15,6 мг из 40 мг добавленного инсулина, как найдено, ассоциируется со 100 мг общего количества липидов в форме высокодеформируемых везикул. Наилучший выход получают при относительном соотношении 0,2 мг инсулина на 1 мг общего количества липидов, однако при этом 14 мг из введенных 20 мг измерены как ассоциированные со смешанными липидными везикулами. Фигура 4 иллюстрирует эти данные.

Аналогичные результаты получают в случае, если молекулы холата вводят в суспензию смешанных липидных везикул с буферным или инсулиновым раствором.

Примеры 60-71.

Исходная суспензия (20% TL):
1099,7 мг фосфатидилхолина из бобов сои;
900,3 мг Tween 80;
8 мл фосфатного буфера, рН 7,4.

Конечная суспензия, включающая:
липидную смесь, приведенную выше
2, 4, 8, 10, 20, и 40 мг инсулина на 100 мг TL.

Приготовление суспензии везикул осуществляют по существу как описано в примерах 1-27, за исключением того, что время перемешивания увеличивают до 7 дней. Actrapid^TM (Novo-Nordisk) является источником адсорбирующегося инсулина во всех случаях.

Для того чтобы иметь возможность использовать фиксированную концентрацию инсулина 4 мг/мл, готовят соотношения инсулин/липид с изменяющейся конечной общей липидной концентрацией между 8 и 100 мг/мл. Для сравнения (относительно возможного эффекта разбавления), используют везикулы аналогичного состава для приготовления различных соотношений инсулин/липид, но с фиксированной конечной общей липидной концентрацией, составляющей 10 мг/мл (1 мас.%). Время ассоциации белок-везикула выбирают 3 часа.

Время центрифугирования, используемое для отделения не ассоциированного инсулина от белка, связанного с везикулой, составляет 6 часов (при 1000 g). Все остальные детали эксперимента были такими же как описано в первых тестовых сериях (примеры 1-27).

Результаты. Несмотря на тот факт, что связывание инсулина с мембранами, которые содержат неионное поверностно-активное вещество (Tween-80) в целом ниже, чем с заряженными (холатсодержащими) мембранами, количественные характеристики обеих адсорбирующих систем одинаковы (см. примеры 1-27).

Ассоциация инсулина с мембранами при относительном соотношении инсулин/липид 0,04 мг инсулина/1 мг липида составляет приблизительно 50%. Относительная концентрация 0,2 мг инсулина/1 мг липида максимального связывания соответствует только 5,2 мг связанного белка от общего количества добавленных 20 мг инсулина. Абсолютного оптимума, то есть, наилучшего выхода в тестовых сериях, достигают при соотношении 0,04 мг инсулина/1 мг липида.

Примеры 72-76.

Исходная суспензия (10% TL) включающая:
874,8 мг фосфатидилхолина из бобов сои;
125,6 мг холата натрия;
9 мл фосфатного буфера, рН 7,1 (-7,4; с этими буферами, рН исходной суспензии находится в интервале 7,3-7,6.

Поскольку интервал требуемых рН составляет 7,3-7,4, все следующие тестовые серии с холатом в качестве поверностно-активного вещества, проводят с буфером, где рН 7,1).

Раствор инсулина А:
4, 8, 10, 20 мг/мл фосфатный буфер, рН 7,4;
30 мкл НСl (1 М) на мл растворенного сухого инсулина, с последующим добавлением 30 мкл 1 М NaOH на 1 мл раствора.

Раствор инсулина В:
4 мг Actrapid/мл фосфатный буфер, рН 7,4.

Смеси инсулин-везикула
5 мас.% общая липидная концентрация;
0,04, 0,08, 0,1 и 0,2 мг сухого инсулина на 1 мг общего количества липида;
(4, 8, 10, 20 отн. мас.%).

Приготовление суспензии везикул проводят как описано в примерах 1-27, при использовании аналогичного состава мембран. Однако, для достижения высоких соотношений инсулин/липид, используя умеренно высокие конечные концентрации общего липида, растворяют сухой инсулин с доведением его концентрации до более высоких значений, чем применяют в продажных растворах.

Лиофилизованный рекомбинантный человеческий инсулин не растворяется быстро в фосфатном буфере с рН 7,4. Для приготовления раствора инсулина сухой, лиофилизованный рекомбинантный человеческий инсулин "порошок", аналогичный Actrapid^TM, таким образом вначале добавляют к 2 мл буфера и основательно перемешивают. После временного подкисления (достигаемого путем добавления 60 мкл НСl), которое достаточно повышает растворимость инсулина, увеличивая возможность образования прозрачного раствора, добавляют 60 мкл NaOH для того, чтобы вновь вернуть значение рН назад к значению 7,4, при котором инсулин стабилен (в виде гексамеров) и устойчив к разрушению/дезамидированию. Дополнительный раствор готовят путем прямого растворения 8 мг инсулина в 2 мл буфера, рН 7,4.

Суспензия везикул (2 мл) и раствор - А инсулина (2 мл) тщательно смешивают и инкубируют 12 часов при указанных выше номинальных соотношениях инсулин/липид. Конечная общая концентрация липидов составляет 50 мг/мл во всех случаях. Для сравнения используют раствор В. В остальном эксперименты проводят, как описано в примерах 1-27.

Результаты. Связывание инсулина из раствора, приготовленного из сухого белкового порошка (который по крайней мере дает временно возможность получить раствор мономера), сравнимо с тем, которое измерено для инсулина из Actrapid в примерах 1-27 (фигура 5). Это дает основание полагать, что возможно ассоциация большого количества инсулина с суспензией липидных везикул при концентрации 50 мг/мл. Максимум связывания инсулина находится в районе массового соотношения белок/липид 1/5, когда приблизительно 16 мг добавленного инсулина ассоциируются со смешанными липидными мембранами.

При аналогичных концентрациях белка, идентичные результаты определены с растворенным ad hoc и продажными растворами инсулина.

В следующих экспериментальных сериях проводят сравнение адсорбции инсулина к различным заряженным и незаряженным, жидким, смешанным липидным мембранам.

Примеры 77-92.

Обычные везикулы, SPC липосомы, нейтральные (TL=10 мас.%):
отсутствует суммарный заряд, содержатся только цвиттер-ионные фосфолипиды;
1 г фосфатидилхолина из бобов сои;
9 мл фосфатного буфера, рН 7,4.

Обычные везикулы, заряженные SPC/SPG липосомы (TL=10 мас.%):
суммарный отрицательный заряд от 25 мол.% анионного фосфатидилглицерина;
750 мг фосфатилхолина из бобов сои;
250 мг фосфатидилглицерина из бобов сои;
9 мл фосфатного буфера, рН 7,4.

Высокодеформируемые нейтральные везикулы (TL=10 мас.%):
нет суммарного заряда, содержат цвиттер-ионные фосфолипиды и неионные поверхностно-активные вещества;
550 мг фосфатидилхолина из бобов сои;
450 мг Т ween 80;
9 мл фосфатного буфера, рН 7,4.

Высокодеформируемые заряженные везикулы А (TL=10 мас.%):
суммарный отрицательный заряд за счет 25 мол.% анионного холата;
874,4 мг фосфатидилхолина из бобов сои;
125,6 мг холата натрия;
9 мл фосфатного буфера, рН 7,1.

Высокодеформируемые заряженные везикулы В (TL=10 мас.%):
суммарный отрицательный заряд за счет 25 мол.% (относительно PC) анионного фосфатидилглицерина;
284,3 мг фосфатидилхолина из бобов сои;
94,8 мг фосфатидилглицерина из бобов сои;
620,9 мг Tween 80;
9 мл фосфатного буфера, рН 7,4.

Смеси инсулин-везикула, соответственно
50, 25, 10, 5 мг общего количества липида на мл конечной суспензии;
0,04, 0,08, 0,1 и 0,2 мг инсулина на 1 мг общего количества липида;
(4, 8, 10, 20 отн. мас.% белка).

Все везикулы готовят, как описано выше. Tween-содержащие везикулы перемешивают 7 дней. Содержащие холат везикулы и липосомы перемешивают 2 дня. Actrapid 100 HM^TM (Novo-Nordisk) является источником инсулина. Это обусловило варьирование конечной белковой и результирующей конечной липидной концентраций (50, 25, 10 и 5 мг TL/мл, соответственно). Однако с SPC-липосомами, изучался только образец 4 отн. мас.%.

Экспериментальный протокол является таким же, как описано для примеров 1-27. Для всех приготовлений время инкубирования составляет 3 часа, время центрифугирования 6 часов (при 500 g), чтобы облегчить процесс сравнения. Результаты измерений показаны на фигуре 6.

Результаты ясно показывают, что инсулин, несмотря на свой суммарный отрицательный заряд, лучше связывается с отрицательно заряженными поверхностями. Высокая мембранная гибкость, которая обеспечивает высокую деформируемость везикул, также является преимуществом.

Относительная способность к связыванию составляет 80-90% для высокогибких заряженных мембран. Такая очень высокая степень ассоциации белка с мембраной наблюдается при массовом соотношении 1/25 инсулин/липид для обоих типов исследуемых смесей фосфолипида-поверностно-активного вещества. Незаряженные мембраны, содержащие фосфолипиды и неионные поверностно-активные вещества, демонстрируют 50%-ное относительное связывание при сравнимых соотношениях инсулина/липида.

Однако добавленный инсулин только в концентрации между 2,5% (с. р. эксперименты 28-45), как подсчитано, связывается с незаряженными, фосфатидилхолиновыми липосомами. Связывание белка с заряженными липосомами, которые ассоциируются с 10-20% добавленного инсулина при массовом соотношении белок/липид 1/25, превосходит этот, худший из всех результат. Следовательно, обычные заряженные липидные бислои являются промежуточным звеном между незаряженной липосомной мембраной и более гибкими, но нейтральными (Transfersome^TM) мембранами.

Такие результаты позволили предположить, что суммарный заряд поверхности (происходящий от заряженных липидов или других заряженных мембрано-ассоциированных компонентов) должен быть объединен с мягкостью мембраны (которой способствует наличие детергентов и других родственных молекул в адсорбенте) для того, чтобы максимально увеличить поверхностную ассоциацию или ассоциацию носитель-инсулин. Это говорит в пользу того, что заряды "втягивают" (части) адсорбирующихся молекул в адсорбент, который, если он "размягчен" позволяет белку легко внедриться в область раздела поверхности.

Примеры 93-95.

Обычные везикулы, SPC липосомы, нейтральные (TL=10 мас.%):
нет суммарного заряда, содержащие только цвиттер-ионные фосфолипиды;
1 г фосфатидилхолина из бобов сои;
9 мл фосфатного буфера, рН 7,4.

Высокодеформируемые заряженные везикулы A (TL=10 мас.%):
суммарный отрицательный заряд, за счет 25 мол.% анионного холата;
874,4 мг фосфатидилхолина из бобов сои;
125,10 мг холата натрия;
9 мл фосфатный буфер, рН 7,1.

Высокодеформируемые заряженные везикулы В (TL=10 мас.%):
суммарный отрицательный заряд, за счет 25 мол.% (отн. PC) анионного фосфатидилглицерина;
284,3 мг фосфатидилхолина из бобов сои;
94,8 мг фосфатидилглицерина из бобов сои;
620,9 мг Tween 80;
9 мл фосфатного буфера, рН 7,4.

Смеси инсулин-вузикула, соответственно
50, 25, 10, 5 мг общее количество липидов на мл конечной суспензии
0,04, 0,08, 0,1 и 0,2 мг инсулина на 1 мг общего количества липида
(4, 8, 10, 20 отн. мас.% белка)
Приготовление. Для изучения кинетики адсорбции инсулина: в отношении фосфатидилхолиновых Tween 80 смешанных мембран были проведены измерения в зависимости от времени. Тестовые везикулы готовят как описано в соответствующих предыдущих примерах. Первые точечные данные определяют через 2 часа после смешения липидной суспензии с белковым раствором. Для нейтральных высокодеформируемых мембран следующую точку отсчета выбирают через 3 часа. Другие образцы для всех суспензий отбирают после 4-х или после 5 дней и после 5 или 6-ти недель инкубирования.

Результаты. Была обнаружена четкая временная зависимость адсорбции инсулина на незаряженных SPC/Tween смешанных мембранах (см. фиг. 9 для некоторых представленных данных). Эффективность связывания, наблюдавшаяся сначала процесса ассоциации, увеличивается от 30% через 2 часа до 50% через 3 часа, когда номинальное массовое соотношение инсулин/липид составляет 1/25. При t= 4 дня связывание увеличивается до 64%, но эта разница может быть незначительной, поскольку после 5 недель связывание составляет только 58%.

Как показывают измерения связывание инсулина с простыми фосфатидилхолиновыми липосомами повышается только минимально от 2,5% через 3 часа до 5% через 6 недель.

Адсорбция инсулина на заряженных смесях SPC/SPG/Tween 80 происходит значительно быстрее и сильнее, чем в случае нейтральных мембран, на что указывает увеличение связывания белка с такими мембранами от 64% через 2 часа до 76% через 6 недель. Небольшая величина второго увеличения, по сравнению с величиной ассоциации в первые часы, свидетельствует о сравнительно быстрой кинетике связывания.

Для заряженных SPC/холат смешанных мембран скорость связывания инсулина даже выше. Эксперименты, проведенные с такими заряженными везикулами, обнаруживают отсутствие зависимости от времени адсорбции белка на смешанной липидной мембране. В пределах ошибки опыта через 2 часа связывание уже завершено так же, как через 5 недель инкубирования. Это дает возможность полагать, что адсорбция инсулина на заряженных, гибких мембранах происходит значительно быстрее, чем на незаряженных мембранах. В заключение можно предположить, что необычные электростатические взаимодействия также могут вызывать десорбцию молекул белка. Очень слабая и/или очень медленная ассоциация инсулина с фосфатидилхолиновыми мембранами показывает, что гидрофобное связывание, само по себе, является недостатычным для достижения высоких полезных нагрузок. Это может происходить из-за ограниченной способности" молекул инсулина находить подходящие места для связывания на липидной бислойной поверхности. Отталкивание между несколькими неудачно адсорбировавшимися молекулами белка и соседними экспериментальными адсорбатами может быть также важным.

Примеры 96-100.

Суспензии ультрадеформируемых везикул с различной плотностью заряда (TL= 10 мас.%):
суммарный отрицательный заряд, за счет 25, 33, 50, 67, 75 мол.% фосфатидилглицерина;
137, 205, 274, 343, 411 мг фосфатидилглицерина из бобов сои;
411, 343, 274, 205, 137 мг фосфатидилхолина из бобов сои;
452 мг Tween 80;
9 мл фосфатный буфер, рН 7,4;
2 мг инсулин/мл конечной суспензии.

Липидные везикулы готовят как описано в примерах 93-95. Повышение относительной концентрации заряженного липида в мембране усиливает ассоциацию везикула-инсулин, что видно на фигуре 4, и умеренно, но допустимо, повышает вязкость конечной суспензии.

Суспензии липидов при более высоких молярных соотношениях SPG/SPC, приготовленные, как описано в примерах 93-95, являются довольно вязкими и трудными в обращении. Однако более высокая относительная концентрация заряженного липидного компонента должна повышать относительное количество инсулина, ассоциированного с везикулами. Это иллюстрирует фигура 7.

Изменение содержания заряженного липида оказывает воздействие на эффективность связывания (инсулина) белка однообразным образом. Во-первых, относительное количество инсулина, ассоциированного с везикулами, повышается. При соотношении SPC/SPG близком к 50, наблюдается максимум относительного связывания. Это предполагает, что очень высокое содержание SPG наносит ущерб эффективному связыванию инсулина, возможно, это связано с эффектом межфазного вытеснения и/или влияния заряженной поверхности на кинетику адсорбции белка. (Последняя не должна быть очень быстрой, чтобы позволить осуществить макромолекулярные перегруппировки на поверхности, что таким образом приводит к максимальной плотности упаковки).

Примеры 101-104.

Высокогибкие заряженные мембраны (TL=10 мас.%), смешанные 1/1 с инсулином:
874:10 мг фосфатидилхолина из бобов сои;
125,6 мг холата натрия;
9 мл фосфатного буфера, рН 7,1;
4 мг инсулин/мл в исходном растворе.

Для приготовления везикул используют различные методы: в дополнение к экструзии и циклам замораживания-оттаивания, описанным в примерах 1-27, была протестирована также значительно более простая методика (в которой суспензию только последовательно экструдируют).

Не было найдено никакого заметного отличия в эффективности адсорбции белка на смешанных липидных мембранах (фигура 8). Однако форма способности к адаптации липидных везикул, как оценивается в "ограничивающем проникновение через поры испытании", является различной для различных групп: как было найдено, способность к деформации везикулы, полученной в примерах 1-27, является наивысшей.

Примеры 105-106.

Ультрагибкие заряженные мембраны с различными добавками (конечный состав):
437 мг фосфатидилхолина из бобов сои;
63 мг холата натрия;
1 мл фосфатного буфера, рН 7,1;
2 мг инсулина/мл в конечной суспензии.

Добавка А
m-крезол 1,5 мг/мл (конечная).

Добавка В
бензиловый спирт 2,5 мг/мл (конечная).

Добавка сорастворителя к Transfersome^®, содержащим холат натрия, оказывает влияние на результирующее количество мембранно-ассоциированного инсулина. Относительная эффективность связывания составляет 60% в присутствии m-крезола и 90% после введения в тестовую суспензию бензилового спирта.

Добавки, используемые в примерах 103-104, могут также действовать в качестве консервантов.

Примеры 107-110.

Аналогичные мембраны с инсулином из различных источников:
437 мг фосфахолин из бобов сои;
63 мг холата натрия;
1 мл фосфатного буфера, рН 7,1;
2 мг инсулин/мл;
из Actrapid 100 НМ^ТМ (Novo-Nordisk) первоначально сухой, человеческий рекомбинантный (Novo-Nordisk)
первоначально сухой свиной (Sigma Chemical Industries);
из Lispro^ТМ, аналог инсулина (Pfizer Inc.).

Никаких значительных изменений не было замечено в эффективности адсорбции различных белков на аналогичных мембранах. Однако это не исключает и возможность различных скоростей де/адсорбции.

В частности, сухой инсулин, в случае растворения в кислом буфере и переносе его обратно в нейтральный интервал рН, адсорбируется на смешанных липидных мембранах с такой же эффективностью, как и инсулин из готового к использованию раствора Actrapid^ТМ (Novo-Nordisk).

Примеры 111-118.

Мягкие незаряженные мембраны
Исходная суспензия (10% TL):
1099,7 мг фосфатидилхолина из бобов сои;
900,3 мг Tween 80;
19 мл фосфатного буфера, рН 7.

Конечная суспензия, включающая:
8,4 мкл IF смешанного с липидной смесью, приведенной выше,
при использовании от 1,84 мг TL/мл до 18,4 мкг TL/мл для создания увеличивающихся относительных количеств интерферона, как показано на фиг. 10.

Композиции, содержащие смеси белок/липид с увеличивающимся мольным соотношением, готовят, по существу, как описано в примерах 60-71. Тесты проводят как описано в примерах 1-27 с двумя модификациями. Первая включает использование в процессе Centrisart разделительных пробирок (насечки 100 кДа), которые в этих опытных сериях всегда предварительно покрывают альбумином (из раствора, содержащего 40 мг BSA/мл буфера) для снижения неспецифической адсорбции белка до уровня ниже 15%. После инкубирования с BSA пробирки затем дважды промывают буфером и заполняют раствором интерферона (полученным путем разбавления хранящегося раствора в этом же буфере) с достижением подходящей концентрации. Для оценки конечной концентрации белка используют продажный ELISA иммунотест для IF. Для подсчета количества интерферона, ассоциированного с везикулой, используют тот же процесс, что описан в примерах 1-18. Степень связывания белка определяют как "потерю белка" из супернатанта, измеренную дважды или трижды.

Результаты приведены на фиг. 10. Они отражают картину качественно аналогичную той, что описана для связывания инсулина.

Примеры 119-134.

Высокогибкие, заряженные мембраны.

Исходная суспензия
Общее липидное (TL) содержание 10 мас.%, включающее:
874,4 мг фосфатидилхолина из бобов сои;
125,6 мг холата натрия;
9 мл фосфатный буфер, рН 7,1.

Конечные суспензии:
смеси липид/белок, как приведено на фиг. 10;
(другие данные, соответствующие этим, приведены в примерах 111-118).

Результаты двух различных экспериментальных серий, проиллюстрированные на фиг. 10 (закрашенные ромбы и квадраты), отражают желаемое действие отрицательного заряда мембран на эффективность связывания интерферона высокодеформируемыми бислоям, несмотря на суммарный отрицательный заряд белковых молекул
Примеры 135-145.

Исходная суспензия (10% TL):
Мягкие незаряженные мембраны;
SPC/Tw 80;
550 мг фосфатидилхолина из бобов сои;
450 мг Tween 80;
9 мл фосфатного буфера, рН 6,5.

Мягкие заряженные мембраны
SPC/NaChol;
874,4 мг фосфатидилхолина из бобов сои;
125,6 мг холата натрия;
9 мл фосфатного буфера, рН 7,1.

Конечная суспензия, включающая:
липиды в соотношениях, приведенных выше, и
10000 IU (межд.ед) интерлейкина-2 (IL-2)
Данную смесь липидов и белков обрабатывают совместно. Затем определяют степень ассоциации. Отделение осуществляют по существу как описано для примеров 119-134, при этом количество IL-2 определяют, используя зависимую от белка стимуляцию роста Renca-клеток in vitro, в сравнении со стандартной кривой. Полученные данные приведены в следующей таблице. (Абсолютные IL-2 концентрации приведены в IU (международных единицах) и относительное количество белка в %).

Отклонения между исходными и конечными (полностью восстановленный белок) величинами частично происходят за счет потери белка во время разделения везикула/IL-2 и частично благодаря модифицированной активности белка из-за присутствия липидов.

Короткосрочная ассоциация интерлейкина и предварительно сформированных липидных везикул с различной плотностью заряда поверхности, как найдено, является менее чувствительной к зарядному эффекту, чем предполагается исходя из данных табл.4 (данные не приведены).

Примеры 146-148.

Обычные нейтральные везикулы (исходная суспензия):
1 г фосфатидилхолина из бобов сои;
9 мМ фосфатный буфер, рН 6,5.

Высокодеформируемые нейтральные везикулы (исходная):
550 мг фосфатидилхолина из бобов сои;
450 мг Tween 80;
9 мл фосфатного буфера, рН 6,5.

Высокодеформируемые заряженные везикулы (исходная):
874,4 мг фосфатидилхолина из бобов сои;
1% 5,6 мг холата натрия;
9 мл фосфатного буфера, рН 7,1.

Кальцитонин (напр., лосося), смешанный с везикулами (конечная суспензия) 100 мг общего количества липида на мл конечной суспензии
1 мг белка на 100 мг общего количества липидов.

Все липидные суспензии готовят как описано ниже. Белок (снабженный небольшим количеством ¹²⁵I-меченным белком, очищенным незадолго перед использованием) добавляют к сформированным заранее везикулам и инкубируют по крайней мере 24 часа; альтернативно, раствор белка добавляют к липидам и совместно экструдируют через микропористый фильтр во время приготовления суспензии.

Для определения относительной эффективности связывания полипептида с мембранами, смесь белок/везикула хроматографируют, используя вытеснительную гель хроматографию по размеру молекул с последовательным определением радиоактивности. Это позволяет получить два пика, содержащие радиоактивно меченный белок, соответственно ассоциированный с везикулой и в растворе. Площади под кривой составляют порядка 30 и 70% для обычных везикул, от 60-70% и 40-30% для нейтральных, мягких мембран и >80% и <20% для заряженных, высокогибких мембран, соответственно.

Примеры 149-152.

Высокодеформируемые нейтральные везикулы (исходная):
550 мг фосфатидилхолина из бобов сои;
450 мг Tween 80;
9 мл фосфатного буфера, рН 6,5.

Высокодеформируемые заряженные везикулы (исходная):
874,4 мг фосфатидилхолина из бобов сои;
25,6 мг холата натрия;
9 мл фосфатного буфера, рН 7,1.

Иммуноглобулин G, смешанный с везикулами (конечная суспензия):
100 мг общее количество липидов на мл конечной суспензии;
0,5 и 1 мг белка на 100 мг общего количества липида.

Все суспензии липидов готовят, как описано ниже. Иммуноглобулин (моноклональный IgG, направленный против флуоресцеина) включают в композицию путем добавления предварительно сформированной суспензии везикул. После разделения количеств ассоциированного с везикулами и свободного иммуноглобулина, был определен относительный вклад первого из них путем использования гашения флуоресции в отделенном, первоначальном и контрольном растворах. Это позволяет определить конечную концентрацию IgG в каждой лакуне.

Эффективность ассоциации IgG с носителем-мембраной оценивают как составляющую, по крайней мере, 85% в случае заряженных, высокодеформированных везикул и приблизительно на 10% ниже для нейтральных, мягких мембран. Наблюдаемое небольшое отличие возможно присутствует из-за того факта, что Ig содержит большую гидрофобную область Fc, которая быстро внедряется в липидную мембрану даже при отсутствии смягчающих мембран у создающих дефекты компонентов.

Примеры 153-154.

Высокодеформируемые заряженные везикулы. Тип С:
130,5 мг фосфатидилхолина из бобов сои;
19,5 мг холат, натриевая соль;
0,1 мл этанол.

Высокодеформируемые незаряженные везикулы. Тип Т:
75 мг фосфатидилхолин из бобов сои;
75 мг Tween 80;
0,1 мл этанол.

Инсулин, человеческий, рекомбинантный:
1,35 мл Actrapid^TM 100 (Novo-Nordisk).

Тестовая композиция. Одну из липидных смесей вводят в спирт, пока не образуется однородный фосфолипидный раствор (замечание: Na холат не растворяется до конца). Смесь впрыскивают в раствор инсулина и тщательно перемешивают. После созревания в течение приблизительно 12 часов полученную суспензию "сырых везикул" фильтруют несколько раз через 0,2 микрометровый фильтр (Sartorius, Gottingen) для того, чтобы облегчить и достигнуть хорошей гомогенности образца. Конечная концентрация инсулина составляет 80 межд.ед./мл.

Тест. Здоровый мужчина доброволец (75 кг, возраст 42 года) голодает 17 часов перед первым определением концентрации глюкозы. Для того, чтобы определить изменение концентрации глюкозы в крови человека в зависимости от времени, отбирают образцы в объеме от 2 мл до 4 мл через каждые от 10 минут и до 20 минут через мягкий внутривенный катетор, закрепленный на одной из его рук. После начального периода теста, длящегося 70 минут, во время которого средняя концентрация глюкозы в крови составляла 78,4, наносят суспензию Transfersulin^® (45 IU, межд. ед.) и равномерно размазывают ее поверх здоровой поверхности кожи на внутренней стороне другого предплечья (в нескольких последовательностях) так, чтобы покрыть поверхность кожи площадью 56 см². Через 30 минут после нанесения тестовой суспензии, поверхность кожи становится макроскопически сухой; 30 минут позже видны, только слабые следы суспензии.

Для определения концентрации глюкозы в крови используют стандартный глюко-дегидрогеназный тест (Merck, Gluc-DH). Каждая проба содержит три независимых образца и каждое измерение проводят по крайней мере трижды. Это дает уверенность в том, что стандартное отклонение среднего значения редко превышает 5 мг/дл (dL), при ошибке опыта, составляющей 3 мг/дл.

Результаты. Изменение концентрации глюкозы в крови в тесте добровольца с нормогликемией после накожного введения инсулина, ассоциированного с Tрансферсомами^® (Transfersulin^®) всегда медленнее, чем достигается путем подкожной инъекции раствора инсулина.

Максимум снижения концентрации глюкозы в крови после накожного введения Transfersulin^® обычно превышает 10% от результата, полученного после соответствующей подкожной инъекции, при этом площадь под кривой составляет по крайней мере 20%, как определено, исходя из опубликованных ссылочных данных. Среднее снижение концентрации глюкозы в крови, в случае суспензии С, для периода t > 3 часов, составляет приблизительно 18 мг/дл (фиг.11).

Для суспензии Т был получен результат, который оказался приблизительно на 35% хуже по отношению к данным, измеренным для суспензии С. Включение фосфатидилглицерина (15 мас.% относительно фосфатидилхолина) снижает разницу между С- и Т-типами композиций до 25% (данные не приведены).

Однако даже другие лучшие неинвазивные способы доставки инсулина, доступные в настоящее время, такие как лекарственный электрофорез (Meyer B.R., Katzeff H. L, Eschbach J., Trimmer J., 20 Zacharias S.R., Rosen S., Sibalis D. Amer. J. Med. Sd. 1989, 297: 321-325) или транснозальное вспрыскивание доставляют менее, чем 5% и менее, чем 10% молекул инсулина, соответственно, в систему циркуляции крови.

Пример 155.

Высокодеформируемые заряженные везикулы:
состав, как в примерах 72-76.

Инсулин человеческий рекомбинантный:
Actrapid^TM (лиофилизат), как в примерах 72-76 (Novo-Nordisk).

Композицию для теста готовят как описано в примерах 61-65. Введение осуществляют по существу, как описано в предыдущих примерах, но период голодания продолжается дольше и забор образцов крови начинают раньше. (Таким образом начинают эксперимент с 12 часового голодания без мониторинга, после чего наступает период голодания, который составляет 12 часов, в течение которого проверяется уровень содержания в крови глюкозы без какой-либо обработки и период в 16 часов с мониторингом, в течение которого тестируемый доброволец голодает и ему вводится накожно Transfersulin^®. Дополнительным отличием является то, что площадь нанесения составляет только 10 см².

Перед введением инсулина образцы забирают хаотично по времени. После введения Transfersulin^®, образцы крови забирают каждые 20 минут в течение первых 4 часов и впоследствии каждые 30 минут. Все образцы анализируют с помощью Accutrend (Boehringer-Mannheim, Germany), автоматического диагностического устройства. В каждой временной точке берут от трех до пяти показаний. Результаты приведенные на фигуре 12 и соответствуют среднему значению изменения концентрации глюкозы в крови. Штриховые линии дают 95% допустимого предела.

Во втором периоде "без обработки" средняя концентрация глюкозы в крови составляет 83,2 мг/дл. Четко прослеживается снижение концентрации глюкозы в крови в первые часы после накожного введения лекарственного средства с помощью высокоадаптированных смешанных липидных везикул. Глюкодинамический профиль аналогичен тому, который измерен в предыдущих тестовых сериях, при этом общий эффект несколько сильнее, возможно благодаря значительно более высокой концентрации лекарственного средства в последних тестовых композициях.

Примеры 156-158.

Высокодеформируемые заряженные везикулы:
состав, как в примере 153.

Инсулин человеческий рекомбинантный
Actrapid^TM (Novo-Nordisk), партия как приведена на фиг. 12.

В этих тестовый сериях изучают эффект изменения, связанные с варьированием партий инсулина, при использовании той же Transfersome^® серии. Введение проводят как описано в предыдущих примерах. Доза на площадь аналогична той, что используют в предыдущих примерах.

Средняя концентрация глюкозы в крови приблизительно такая же, как во всех трех экспериментах. Такое наблюдается несмотря на то, что результат экспериментов значительно различается в зависимости от партии инсулина. Одна партия работает очень хорошо, а другая не работает вовсе. Третья дает средние результаты. Небольшие, от партии к партии, изменения для инсулина (которые известны, но обычно не указываются и в особенности заметны в присутствии очень большой адсорбирующей поверхности носителя, как представляется, воздействуют на эффективность и/или кинетику взаимодействия инсулин-носитель. Как представляется, изменение скорости высвобождения лекарственного средства, в особенности чувствительно к этому явлению. Таким образом, является важным, перед проведением серьезных тестов, не только изучение количества липида, ассоциированного носителем, но и более важным является определение скорости высвобождения лекарственного средства. Полезным для этих целей является измерение глюкодинамики в тестах на животных, таких как мыши и крысы, так же как характеристик композиций после инъекций.

Ясно, что глюкодинамика у человека-добровольца с нормогликемией после введения трех различных Transfersulin^® партий с идентичными Transfersomes^®, но различными инсулиновыми партиями имеет относительно сильный эффект на биологическую активность конечного состава даже при небольших изменениях в первоначальных характеристиках лекарственного средства (см. фиг. 12).

Изобретение относится к технологии и касается способа конструирования, проверки и применения ассоциатов с повышенной полезной нагрузкой и контролируемой степенью ассоциации/диссоциации. Сущность изобретения состоит в разработке комбинации веществ, два из которых проявляют амфипатические свойства и могут образовывать протяженные поверхности, в особенности мембраноподобные поверхности при контакте с жидкой средой. Первое и второе вещества с амфипатическими свойствами отличаются по своей растворимости в указанной жидкой среде и вещество, более растворимое, образует менее протяженные поверхности по сравнению со вторым веществом, при этом более растворимое вещество выбрано из липидов или липидоподобных материалов, второе выбрано из поверхностно-активных веществ, а третье вещество имеет одну или несколько цепных молекул. Преимущество изобретения заключается в оптимизации средств доставки лекарств. 2 с. и 57 з.п.ф-лы, 12 ил., 4 табл.

1. Комбинация веществ, по меньшей мере два из которых проявляют амфипатические свойства при контакте с подходящей жидкой средой, указанные два вещества способны образовывать протяженные поверхности, в особенности мембранные поверхности при контакте с указанной средой, включающая по меньшей мере одно третье вещество, молекулы которого могут ассоциироваться с указанной поверхностью, отличающаяся тем, что указанные первое и второе вещества с амфипатическими свойствами отличаются по своей растворимости в указанной среде, и вещество, которое является более растворимым в указанной жидкой среде, образует менее протяженные поверхности, чем второе указанное вещество, при этом первое, более растворимое вещество, выбрано из липидов или липидоподобных материалов, второе выбрано из погранично- или поверхностно-активных веществ, а третье вещество имеет одну или несколько цепных молекул, которые более склонны к ассоциации с протяженными поверхностями, образованными комбинацией двух первых веществ, чем с протяженной поверхностью, образованной одним из них. 2. Комбинация по п. 1, отличающаяся тем, что поверхность, образованная двумя первыми веществами, а также молекулы третьего несут электрический заряд. 3. Комбинация по п. 2, отличающаяся тем, что протяженные поверхности, образованные комбинацией двух первых веществ, также как и молекулы третьего вещества, являются обе одновременно отрицательно или обе положительно заряженными. 4. Комбинация по п. 2 или 3, отличающаяся тем, что относительная концентрация связанных с поверхностью заряженных компонентов имеет величину 5-100 отн. мол. %, более предпочтительно 10-80 отн. мол. % и наиболее предпочтительно 20-60 отн. мол. % от концентрации всех образующих поверхность амфипатических веществ, вместе взятых. 5. Комбинация по любому из пп. 2-4, отличающаяся тем, что средняя плотность заряда на поверхности имеет величину 0,05-0,5 Кл•м^-2, предпочтительно 0,075-0,4 Кл•м^-2, и особенно предпочтительно 0,10-0,35 Кл•м^-2. 6. Комбинация по любому из пп. 2-5, отличающаяся тем, что концентрация и состав фонового электролита, который предпочтительно содержит моно- или олиговалентные ионы, выбраны таким образом, чтобы достигнуть максимального положительного воздействия заряд-зарядных взаимодействий на требуемую ассоциацию. 7. Комбинация по п. 6, отличающаяся тем, что концентрация и состав фонового электролита соответствуют величине ионной силы между I= 0,001 и I= 1, предпочтительно между I= 0,02 и I= 0,5 и более предпочтительно между I= 0,1 и I= 0,3. 8. Комбинация по любому из пп. 1-7, отличающаяся тем, что растворимости указанных двух первых веществ в указанной среде отличаются по меньшей мере в 10 раз, предпочтительно по меньшей мере в 100 раз. 9. Комбинация по любому из пп. 1-8, отличающаяся тем, что средний радиус пространства, образованного указанными протяженными поверхностями, имеет величину 15-5000 нм, преимущественно 30-1000 нм, более предпочтительно 40-300 нм и наиболее предпочтительно 50-150 нм. 10. Комбинация по любому из пп. 1-9, отличающаяся тем, что поверхности имеют среднюю кривизну, определяемую как величина, обратная среднему радиусу пространства, окруженного поверхностями, соответствующую среднему радиусу 15-5000 нм, часто предпочтительно 30 и 1000 нм, более предпочтительно 40 и 300 нм и наиболее предпочтительно 50-150 нм. 11. Комбинация по одному из пп. 1-10, отличающаяся тем, что включает по меньшей мере одно первое или второе амфипатическое вещество, образующее протяженную поверхность с другим амфипатическим веществом, увеличивающем среднюю или локальную кривизну указанной поверхности. 12. Комбинация по п. 11, отличающаяся тем, что концентрация указанного увеличивающего кривизну вещества составляет менее 99% концентрации насыщения или той концентрации, выше которой поверхность не может быть образована. 13. Комбинация по п. 12, отличающаяся тем, что концентрация указанного увеличивающего кривизну поверхности вещества имеет величину до по меньшей мере 0,1%, предпочтительно до 1-80%, более предпочтительно до 10-60% и наиболее предпочтительно до 20-50% от соответствующей концентрации. 14. Комбинация по любому из пп. 9-13, отличающаяся тем, что поверхность находится на твердой подложке, имеющей соответствующую кривизну или размер. 15. Комбинация по любому из пп. 1-14, отличающаяся тем, что поверхность, сформированная первыми двумя веществами, имеет форму мембраны, преимущественно двухслойной, окружающей суспендированные или диспергированные в жидкой среде капли жидкости веществ, причем указанные по меньшей мере два вещества имеют различие в растворимости по меньшей мере в 10 раз, предпочтительно по меньшей мере в 100 раз в предпочтительно водной жидкой среде. 16. Комбинация по п. 15, отличающаяся тем, что средний диаметр гомоагрегатов более растворимого вещества или гетероагрегатов обоих амфипатических веществ меньше, чем средний диаметр гомоагрегатов менее растворимого вещества. 17. Комбинация по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что общее содержание всех амфипатических веществ, которые могут образовывать поверхность, имеет величину 0,01-30 мас. %, особенно 0,1-15 мас. % и наиболее предпочтительно 1-10 мас. % от общей сухой массы комбинации. 18. Комбинация по любому из пп. 11-16, отличающаяся тем, что поверхность, образованная комбинацией, содержит заряженные компоненты мембраны в интервале относительных концентраций от 1 до 80 мол. %, предпочтительно от 10 до 60 мол. % и наиболее предпочтительно 30-50 мол. %. 19. Комбинация по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что первое из указанных веществ представляет собой биосовместимый полярный или неполярный формирующий поверхность липид. 20. Комбинация по п. 19, отличающаяся тем, что указанный липид представляет собой липид или липоид из биологического источника или соответствующий синтетический липид, или модификацию такого липида, а предпочтительно представляет собой глицерид, глицерофосфолипид, изопреноидлипид, сфинголипид, стероид, стерин, серо- или углеводсодержащий липид или любой другой липид, способный к образованию бислоев, а в особенности полупротонированную жидкую жирную кислоту, и предпочтительно выбранный из фосфатидилхолинов, фосфатидилэтаноламинов, фосфатидилглицеринов, фосфатидилинозитолов, фосфатидных кислот, фосфатидилсеринов, сфингомиелинов или сфиногофосфолипидов, гликосфинголипидов, в частности цереброзид, керамидополигексозид, сульфатид, сфингоплазмалоген, ганглиозидов или других гликолипидов или синтетических липидов, в частности из диолеил-, дилинолеил-, диленоленил-, диленоленоил-, диарахидоил-, дилауроил-, димиристоил-, дипальмитоил-, дистеароил- или соответствующего сфингозинового производного, или любого другого гликолипида, или диацил-, диалкеноил- или диалкиллипида. 21. Комбинация по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что указанное поверхностно-активное вещество представляет собой неионное, цвиттерионное, анионное или катионное поверхностно-активное вещество. 22. Композиция по п. 21, отличающаяся тем, что поверхностно-активное вещество выбрано из группы, включающей длинноцепочечную жирную кислоту или спирт, соль алкил-три(ди)метиламмония, соль алкилсульфата, моновалентную соль холата, дезоксихолата, гликохолата, гликодезоксихолата, тауродезоксихолата или таурохолата, ацил- или алканоилдиметиламиноксид, в особенности додецилдиметиламиноксид, алкил- или алканоил-N-метилглюкамид, N-алкил-N, N-диметилглицин, 3-(ацилдиметиламмонио)-алкансульфонат, N-ацилсульфобетаин, октилфениловый эфир полиэтиленгликоля, в особенности октилфениловый эфир нонаэтиленгликоля, ацилполиэтиленовый эфир, в особенности, нонаэтилендодециловый эфир, эфир изоацилполиэтиленгликоля, в особенности, изотридециловый эфир октаэтиленгликоля, ацилполиэтиленовый эфир, в особенности октаэтилендодециловый эфир, сложный эфир ацилсорбитанполиэтиленгликоля, такой, как полиэтиленгликоль-20-монолаурат (Tween 20) или полиэтиленгликоль-20-сорбитан-моноолеат (Tween 80), ацилполигидроксиэтиленовый эфир, в особенности полигидроксиэтиленлауриловый, - миристоиловый, -цетилстеариловый или -олеоиловый эфир, такой, как полигидроксиэтилен-4, или 6, или 8, или 10, или 12 и т. д. , лауриловый эфир (как в ряду Brij) или в соответствующем сложном эфире, например, ряда полигидроксиэтилен-8-стеарата (Myrj 45), -лаурата или -олеата, или в лиэтоксилированном касторовом масле 40 (Chemophor EL), сорбитанмоноалкилат (например, в Arlacel или Span), в особенности сорбитан-монолаурат (Агlасеl-20, Span-20), ацил- или алканоил-N-метилглюкамид, в особенности или деканоил-, или додеканоил-N-метилглюкамиде, алкилсульфате (соли), например в лаурил- или олеилсульфате, дезоксихолат натрия, гликодезоксихолат натрия, олеат натрия, таурат натрия, соль жирной кислоты, такую, как элаидат натрия, линолеат натрия, лаурат натрия, лизофосфолипид, такой, как н-октадецилен(= олеил)-глицерофосфатидная кислота, -фосфорилглицерин или фосфор илсерин, н-ацил-, например лаурил или олеилглицерофосфатидная кислота, -фосфорилглицерин или -фосфорилсерин, н-тетрадецил-глицерофосфатидная кислота, -фосфорилглицерин или -фосфорилсерин, соответствующий пальмитолеил-, элаидоил-, вакценил-лизофосфолипид или соответствующий фосфолипид с короткой цепью, или также поверхностно-активный полипептид. 23. Композиция по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что второе амфипатическое вещество является идентичным третьему веществу. 24. Комбинация по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что первое амфипатическое вещество представляет собой фосфатидилхолин и/или фосфатидилглицерин, а второе выбрано из группы, включающей лизофосфолипид, такой, как лизофосфатидная кислота или метилфосфатидная кислота, лизофосфатидилглицерин, или лизофосфатидилхолин, или частично N-метилированный лизофосфатидилэтаноламин, моновалентная соль холата, дезоксихолата, гликохолата, гликодезоксихолата или любого другого достаточно полярного производного стерола, лаурат, миристат, пальмитат, олеат, пальмитолеат, элаидат или какая-либо другая соль жирной кислоты и/или поверхостно-активное вещество ряда Tween-, Myrj- или Brij-, или Triton, жирносульфонатное или -сульфобетаиновое, -N-глюкамидное или сорбитановое (Агlасеl или Span) поверхностно-активное вещество. 25. Комбинация по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что третье вещество включает повторяющиеся субъединицы, в особенности в виде цепных молекул, таких, как олигомеры или полимеры, в особенности со средней молекулярной массой более 800 дальтон, предпочтительно более 1000 дальтон и наиболее предпочтительно более 1500 дальтон. 26. Комбинация по п. 25, отличающаяся тем, что третье вещество имеет биологическое происхождение и предпочтительно является биологически активным. 27. Комбинация по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что третье вещество ассоциируется с мембраноподобной протяженной поверхностью, в особенности путем внедрения в поверхность или поверхности раздела между мембраной и жидкой средой, находящейся в контакте с указанной мембраной. 28. Комбинация по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что содержание цепных молекул имеет величину 0,001-50 отн. % от полной массы указанных протяженных поверхностей, а преимущественно 0,1-35 отн. %, более предпочтительно 0,5-25 отн. % и наиболее предпочтительно 1-20 отн. %, причем конкретная величина соотношения имеет тенденцию к уменьшению с увеличением молярной массы указанных цепных молекул. 29. Комбинация по одному из пп. 25-28, отличающаяся тем, что цепная молекула представляет собой белок и по меньшей мере часть указанной молекулы ассоциирована с указанной поверхностью при условии, что эта часть содержит по меньшей мере три сегмента или функциональных группы, способных связываться с указанной поверхностью. 30. Комбинация по одному из пп. 26-28, отличающаяся тем, что указанные цепочечные молекулы являются полинуклеотидами, такими, как ДНК или РНК, в природной форме или после химической, биохимической или генетической модификации. 31. Комбинация по одному из пп. 25-28, отличающаяся тем, что указанные цепные молекулы принадлежат к классу полисахаридов с по меньшей мере частичной способностью взаимодействовать с указанными протяженными поверхностями либо в природной форме, либо после некоторой химической, биохимической или генетической модификации. 32. Комбинация по любому из пп. 25-31, отличающаяся тем, что цепная молекула может действовать как адренокортикостатический, b-адренолитический, андрогенный или антиандрогенный, антипаразитичекий, анаболический, анестетический или анальгетический, аналептический, антиаллергический, антиаритмический, антиатеросклеротический, антиастматический и/или бронхоспазмолитический, антибиотический, антидепрессивный и/или антипсихотический, антидиабетический агент, антидот, противорвотный, антиэпилептический, антифибринолитический, противосудорожный, антихолинэргический агент, фермент, кофермент или соответствующий ингибитор, антигистаминный, антигипертонический агент, биологический ингибитор лекарственной активности, антигипотонический, антикоагулянтный, противогрибковый, антимиастенический агент, агент против болезни Паркинсона или болезни Альцгеймера, противовоспалительный, жаропонижающий, против о ревматический, антисептический, респираторный аналептический или респираторный стимулирующий, бронхолитический, кардиотонический, хемотерапевтический агент, коронарный дилататор, цитостатический, диуретический агент, ганглиоблокатор, глюкокортикоид, противогриппозный агент, гемостатический, гипнотический агент, иммуноглобулин или его фрагмент или любое другое иммунологически активное вещество, биологически активный углевод, контрацептив, агент против мигрени, минералокортикоид, антагонист морфина, миорелаксант, наркотический, нейротерапевтический, нейролептический агент, нейромедиатор или его антагонист, пептид(производное), агент для лечения глазных болезней, (пара)-симпатомиметический или (пара)-симпатолитический агент, белок(производное), лекарственное средство против псориаза или нейродермита, мидриатический, психостимулирующий, ринологический агент, любой агент, вызывающий сон, или его антагонист, седативный агент, спазмолитический, туберкулостатический, урологический, сосудосуживающий или сосудорасширяющий, виростатический агент или любое средство для лечения ран, или любая комбинация вышеперечисленных агентов. 33. Комбинация по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что третье вещество представляет собой вещество, регулирующее рост. 34. Комбинация по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что третье вещество обладает иммунорегулирующими свойствами и включает антитела, цитокины, лимфокины, хемокины и соответственно активные части растений, бактерий, вирусов, патогенов или других иммуногенов или части, или модификации любых из них. 35. Комбинация по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что третье вещество представляет собой биокатализатор. 36. Комбинация по п. 35, отличающаяся тем, что биокатализатор представляет собой фермент или кофермент. 37. Комбинация по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что третье вещество представляет собой узнающую молекулу, включая адгерины, антитела, катенины, селектины, шапероны или их части. 38. Комбинация по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что третье вещество представляет собой гормон, в особенности инсулин. 39. Комбинация по п. 38, отличающаяся тем, что она содержит 1-500 межд. ед. инсулина/мл, в частности 20-400 межд. ед. инсулина/мл и наиболее предпочтительно 50-250 межд. ед. инсулина/мл, предпочтительно рекомбинантного человеческого инсулина или инсулина, подобного человеческому.

40 Комбинация по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что третье вещество представляет собой интерлейкин, который подходит для использования на человеке или животных и включает в себя IL-2, IL-4, IL-8, IL-10.