ВЕЗИКУЛЫ С РЕГУЛИРУЕМЫМ ВЫСВОБОЖДЕНИЕМ АКТИВНЫХ ИНГРЕДИЕНТОВ Российский патент 2000 года по МПК A61K9/133 B01J13/02 

Изобретение относится к синтетическим мембранным везикулам, и к содержащим их композициям, пригодным в качестве системы доставки лекарственного средства, способам их получения и к системам направленной доставки, включающим указанные композиции.

Поливезикулярные липосомы являются одним из трех основных типов липосом. Первый тип, сделанный Kim, et al.(Biochim, Biophys. Acta, 782; 339-348, 1983), особенно отличается от других систем доставки лекарственных средств на липидной основе, например моноламеллярных (Huang, Biochemistry, 8: 334-352, 1969; Kim, et al, Biochim. Biophya. Acta, 646:1-10, 1981) и полиламеллярных (Bangham, et al., J.Mol. Bio., 13:238-252, 1965) липосом. В противоположность моноламеллярным липосомам, поливезикулярные частицы содержат множество водных отделений (камер) в каждой частице. В противоположность полиламеллярным липосомам, множественные водные отделения в поливезикулярных частицах неконцентрические
В предыдущих публикациях описывается ряд способов производства моноламеллярных и полиламеллярных липосом, например в патентах США N 4522803 Lenk; 4310506 (Baldesechwieler); 4235871 (Papahadjopoulos); 4224179 (Schneider); 4078052 (Papahadjopoulos); 4394372 (Naylor); 4308166 (Marchetti); 4485054 (Heirei) и 4508703 (Redzincak). В предыдущих публикациях настоящей области описываются также способы производства поливезикулярных липосом, которые оказались нестабильными в биологических жидкостях (Kim, et al., Biochim, Biophys. Acta, 728:339-348, 1983). Для исчерпывающего обзора различных способов приготовления моноламеллярных и полиламеллярных липосом обращайтесь к Szoka. et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9: 465-508, 1980.

В способе авторов Kim et al. (Biochim., Biophys. Acta, 728:339-348, 1983) эффективность инкапсулирования маленьких молекул, например цитозинарабинозида, была низкой, и они имели быструю скорость высвобождения в биологических жидкостях. Последующие исследования (Kim et al. Cancer, Treat. Rep. , 71:705- 711, 1987) показали, что быструю скорость высвобождения инкапсулированных молекул в биологической жидкости можно улучшить инкапсулированным в присутствии гидрохлорида.

Оптимальное лечение с помощью многих лекарственных средств требует поддержания их уровня in vivo в течение длительного времени. Например, оптимальное противораковое лечение специфичными для клеточного цикла антиметаболитами требует поддержания цитотоксичного уровня лекарственного средства в крови в течение продолжительного времени. Цитарабин является весьма зависимым от графика введения противораковым лекарственным средством. Поскольку это лекарство убивает клетки только тогда, когда они репликатируют ДНК, то для оптимального уничтожения клеток требуется продолжительное действие этого лекарства при терапевтической концентрации. К сожалению, период полувыведения цитарабина после внутривенного (iv) или подкожного (sc) дозированного введения очень короткий и находится в диапазоне нескольких часов. Для достижения оптимального уничтожения раковых клеток специфичным для фазы клеточного цикла лекарственным средством, подобным цитарабину, необходимо соблюдать два основных требования: во-первых, раковая опухоль должна подвергаться воздействию высокой концентрации лекарства без нанесения необратимого вреда пациенту и, во-вторых, опухоль должна подвергаться его воздействию в течение продолжительного времени, чтобы все или большинство раковых клеток пытались синтезировать ДНК в присутствии цитарабина.

До сих пор регулирование скорости высвобождения было негибким, и выбор средств, изменяющих скорость высвобождения, был ограничен главным образом гидрогалогенидами. Очень выгодно иметь гибкую систему доставки лекарственного средства, которое участвует в процессе регулирования скорости высвобождения инкапсулированных веществ, а также широкий выбор агентов, изменяющих скорость высвобождения.

В соответствии с этим целью данного изобретения являются создание препарата, который представлял бы собой депо для медленного высвобождения лекарства, обеспечивающего пролонгированное и непрерывное действие биологически активного вещества с терапевтической концентрацией и регулируемой скоростью высвобождения.

Другой целью данного изобретения является разработка способа приготовления таких депо-препаратов.

Изобретение относится также к применению биологически активного соединения, инкапсулированного в вышеупомянутые везикулы, для получения фармацевтических композиций.

Другие и дополнительные цели, признаки и преимущества, присущие данному изобретению, раскрываются в его описании и формуле.

Композиции настоящего изобретения содержат синтетические мембранные везикулы, т. е. липидные везикулы со множественными внутренними водными камерами, образованными неконцентрическими слоями, причем эти камеры содержат один или несколько негидрогалогенидных агентов, изменяющих скорость высвобождения, эффективных для замедления скорости высвобождения инкапсулированных биологически активных веществ. Настоящее изобретение предлагает также способы получения таких композиций. Замедление скорости высвобождения фармацевтических веществ из липосом известно из заявки ЕР-А-0280503.

Предложенные синтетические мембранные везикулы обладают высокой эффективностью для инкапсулирования, регулируемой скоростью высвобождения инкапсулированного вещества, вполне определенным, воспроизводимым распределением частиц по размеру, сферической формой, регулируемым средним размером, который можно легко увеличить или уменьшить, и регулируемым внутренним размером и числом камер.

Настоящее изобретение относится также к способу получения синтетических мембранных везикул, включающему следующие стадии:
а) образование эмульсии типа "вода-в-масле" из двух несмешиваемых компонентов, содержащих по меньшей мере один органический растворитель, воду, по меньшей мере одно биологически активное вещество и по меньшей мере один негидрогалогенидный агент, изменяющий скорость высвобождения;
б) диспергирование этой эмульсии типа "вода-в-масле" в водном компоненте для образования сфер растворителя; и
в) удаление органического растворителя из сфер растворителя с образованием синтетической мембранной везикулы, содержащей водные капельки с растворенными в них биологически активным веществом и агентом, изменяющим скорость высвобождения.

Представленный чертеж является графиком, показывающим скорость высвобождения лекарственного средства из синтетических мембранных везикул, суспендированных в плазме крови человека при 37^oC. Применяемые символы обозначают используемые агенты, изменяющие скорость высвобождения, идентификация их приводится в таблице.

Термин "синтетические мембранные везикулы", применяемый в описании и формуле изобретения, обозначает искусственные микроскопические липидные везикулы, состоящие из липидных двухслойных мембран, окружающих многочисленные не концентрические водные камеры. В противоположность этому, моноламеллярные липосомы имеют одну водную камеру, а полиламеллярные липосомы имеют многочисленные концентрические мембраны типа "луковой кожуры", между которыми находятся подобные оболочке концентрические водные камеры.

Термин "сферы растворителя", применяемый в описании и формуле изобретения, представляет собой микроскопические сферические капельки органического растворителя, внутри которых находятся многочисленные маленькие капельки водного раствора. Сферы суспендированы и полностью погружены во второй водный раствор.

Термин "нейтральный липид" обозначает масло или жиры, которые сами не обладают способностью образовать мембрану и лишены гидрофильной "головной" группы.

Термин "амфипатичеекие липиды" обозначает те молекулы, которые имеют гидрофильную "головную" группу и гидрофобную "хвостовую" группу и обладают способностью образовать мембрану.

Термин "агент, изменяющий скорость высвобождения" обозначает вещества, кроме гидрогалогенидов, добавленные в процессе производства синтетических мембранных везикул, которые эффективны для снижения или увеличения скорости высвобождения инкапсулированных биологически активных веществ из синтетических мембранных везикул.

Способ изобретения включает приготовление эмульсии типа "масло-в-воде" путем (1) растворения амфипатических липидов в одном или нескольких органических растворителях для липидного компонента, (2) добавления в липидный компонент несмешиваемого первого водного компонента и биологически активного вещества, которое нужно инкапсулировать, и (3) добавления к органическому растворителю или первому водному компоненту или к ним обоим агента, изменяющего скорость высвобождения, эффективного для понижения скорости высвобождения инкапсулированных биологически активных веществ из синтетических мембранных везикул, и затем механического эмульгирования смеси.

В эмульсии водные капельки, суспендированные в органическом растворителе, образуют внутренние водные камеры и монослой амфипатических липидов, тянущийся вдоль водных камер, становится одним листиком двуслойной мембраны в конечном продукте. Эмульсию затем погружают во второй водный компонент, содержащий один или несколько неионогенных осмотических агентов и нейтрализующий кислоту агент с низкой ионной силой, например акцептор протонов, предпочтительно выбранный из лизина в форме свободного основания, гистидина в форме свободного основания или их комбинации. Затем эмульсию перемешивают механически, при помощи ультразвуковой энергии, распылением форсункой или подобным образом или комбинацией этих способов для образования шариков растворителя, суспендированных во втором водном компоненте.

Сферы растворителя содержат многочисленные водные отделения с растворенным в нем веществом, которое нужно инкапсулировать. Органический растворитель удаляют из сфер предпочтительно выпариванием летучего растворителя, например пропусканием потока газа над суспензией. Когда растворитель полностью удаляется, сферы превращаются в синтетические мембранные везикулы. Типичные газы, удовлетворительные для применения при выпаривании растворителя, включают азот, гелий, аргон, кислород, водород и диоксид углерода.

Изменяющим скорость высвобождения агентом является любая молекула, которая эффективно снижает скорость высвобождения инкапсулированных биологически активных веществ из синтетических мембранных везикул в биологических жидкостях и in vivo в результате чего скорость высвобождения веществ становится ниже, чем скорость высвобождения их из синтетических мембранных везикул, полученных в отсутствие такого агента, изменяющего скорость высвобождения. Агенты, изменяющие скорость высвобождения, включают, но не ограничиваются ими, перхлорную кислоту, азотную кислоту, муравьиную кислоту, уксусную кислоту, трифторуксусную кислоту, трихлоруксусную кислоту, серную кислоту, фосфорную кислоту и их комбинации. Количество применяемых агентов, изменяющих скорость высвобождения, является количеством, эффективным для обеспечивания пролонгированной, постоянной и регулированной скорости высвобождения терапевтических уровней инкапсулированных биологически активных веществ. Например, концентрация агента, изменяющего скорость высвобождения, в органическом растворителе или первом водном компоненте, в который он добавлен, варьирует от около 0,1 мМ до около 0,5 М, предпочтительно от около 10 мМ до около 200 мМ.

В качестве растворителя липидной фазы можно применять много разных типов летучих гидрофобных растворителей, например простые эфиры, углеводороды, галогенированные углеводороды или фреоны. Например, удовлетворительны для этого диэтиловый эфир, изопропиловый и другие простые эфиры, хлороформ тетрагидрофуран, галогенированные простые эфиры, сложные эфиры и их комбинации.

Для предупреждения слипания сфер растворителя друг с другом и со стенками сосуда, предпочитают, чтобы сферы включали по меньшей мере 1 мол.% амфипатического липида с результирующим отрицательным зарядом, чтобы суспендирующий второй водный раствор имел очень низкую ионную силу и, когда применяют кислоту, чтобы агент для нейтрализации кислоты добавляли во второй водный раствор для достижения его концентрации в этом растворе от около 0,1 мМ до около 0,5 М, чтобы предотвратить коалесценцию шариков растворителя. Кроме того, в суспендирующем водном растворе можно применять один или несколько неионогенных осмотических агентов, например трегалозу, глюкозу или сахарозу, чтобы поддерживать уравновешенное осмотическое давление в мембранных везикулах и снаружи этих мембран.

Для приготовления синтетических мембранных везикул можно применять различные типы липидов, имеется только два требования для их применения, заключающиеся в том, что нужно включать один амфифильный липид с суммарным отрицательным зарядом и нейтральный липид. Примерами нейтральных липидов являются триолеин, триоктаноин, растительное масло, например соевое масло, лярд, говяжий жир, токоферол и их комбинации. Примерами амфифильных липидов с результирующим отрицательным зарядом являются кардиолипин, фосфатидилсерины, фосфатидилглицерины и фосфатидные кислоты.

Вторым водным компонентом является водный раствор, содержащий растворенные вещества с низкой ионной силой, например углеводы, включая глюкозу, сахарозу, лактозу, и аминокислоты, например лизин, гистидин в форме свободного основания и их комбинации.

Внутрь синтетических мембранных везикул инкапсулированием можно вводить многие и различные биологические вещества и терапевтические средства,
Термин "терапевтическое средство" использован здесь для композиций данного изобретения, включает, без ограничения, лекарственные средства, радиоактивные изотопы и иммуномодуляторы. Подобные вещества известны или их легко может установить специалист в настоящей области. Могут быть определенные комбинации терапевтического средства с данным типом синтетических мембранных везикул, которые более совместимы, чем другие. Например, способ получения синтетических мембранных везикул может быть несовместим с непрерывной биологической активностью белкового терапевтического средства. Однако, поскольку условия, которые обычно образуют несовместимую пару конкретного терапевтического средства с конкретной дисперсной системой, хорошо известны или легко устанавливаются, поэтому исключение таких возможных проблем является делом рутинным.

Лекарственные средства, которые можно вводить в дисперсную систему в качестве терапевтических средств, включают небелковые, а также белковые лекарственные средства. Термин "небелковые лекарственные средства" включает соединения, которые классически называются лекарственными средствами, например митомицин С, даунорубицин, винбластин, и гормоны. Особенно интересными являются противоопухолевые, специфические для клеточного цикла лекарственные средства, например цитарабин, метотрексат, 5-фтор-урацил (5-FU), флоксуридин (FUDR) блеомицин, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, флударабинфосфат, винкристин и винбластин
Примерами белковых материалов, которые можно вводить в синтетические мембранные везикулы, являются ДНК, РНК, белки различных типов, белковые гормоны, полученные генной инженерией и эффективные в медицине, гемопоэтические факторы роста, монокины, лимфокины, фактор некроза опухоли, ингибин, факторы альфа и бета роста опухоли, мюллерова ингибирующая субстанция, фактор роста нервов, фибробластный фактор роста, гормоны гипофиза и гипофизарные гормоны, включая LH (лютеинизирующий гормон) и другие высвобождающие гормоны, кальцитонин, белки, которые служат в качестве иммуногенов для вакцинации, и последовательности ДНК и РНК.

Список характерных биологически активных веществ, эффективных в медицине, которые можно инкапсулировать в синтетических мембранных везикулах в присутствии изменяющего скорость высвобождения агента данного изобретения, включает также биологически активные вещества, эффективные для сельскохозяйственного использования:
Антиастматические средства: метапротеренол, аминофиллин, теoфиллин, тербуталин, норэпинефрин, эфедрин, изопротеренол, адреналин,
Антистенокардические средства: изосорбид динитрат,
Сердечные гликозиды: дигиталис, дигитоксин, ланатозид C, диогоксин.

Стероиды: преднизолон, триамцинолон, гидрокортизон, дексаметазон, бетаметазон.

Антидиабетические средства диабенез®(Diabines®) хлорпропамид
Антиаритмические средства: пропанолол, атенолол, верапамил.

Транквиллизаторы: хлорпромазин, бензодиазепин, бутирофеноны, гидроксизины, мепробамат, фенотиазины, тиоксантены.

Гормоны: тироксины, кортикостероиды, тестостерон, экстроген, прогестерон, минералокортикоид.

Гипотензивные средства: апрезолин, атеналол, хлорфенирамин, каптоприл, резерпин, инсулин.

Антипаразитарные средства.

Анальгетики: празиквантел, метронидазол, пентамидин, ивермектин, синтетикс.

Нуклеиновые кислоты и аналоги: ДНК, РНК, метилфосфонаты и аналоги, антисмысловые нуклеиновые кислоты.

Седативные средства и морфин, дилаудид® (DILAUDID) (гидроморфин), кодеин, кодеиноподобный, демерол®(Demerol®) (мепередин), оксиморфон, фенобарбитал, барбитураты, фентанил, кеторолак.

Антигистамины: пирибензамин, дифенилгидрамин.

Противоопухолевые средства: азатиоприн, блеомицин, циклофосфамид, винкристин, метотрексан, 6-TG, 6-MP, винбластин, YP-16,YM-26, циспластин, 5-FU, FUDR, флударабинфосфат.

Антибиотики: пенициллин, тетрациклин, амикацин, эритромицин, цефалотин, имипенем, цефотаксим,
Иммуномодуляторы: интерферон, интерлейкин-2, гаммоглобулин, моноклональные антитела.

Сосудосуживающие средства: допамин, декстроамфетамин.

Противогрибковые средства: амфотерицин В, миконазол, мурамилдипептид, клотримазол, кетоконазол, флуконазол, итраконазол.

Противовирусные средства: ацикловир и производные, ганцикловир и фосфаты, дизоксарил, ривавирин/амантадин, азидотимидин и производные, аденинарабинозид, ингибиторы протеазы типа амидина, карбенициллин, цефтазидим, канамицин, тобрамицин, ампициллин, гентамицин, цефокситин, цефадроксил, цефазолин, другие аминогликозиды, амоксициллин, моксалактам, пиперациллин, ванкомицин, ципрофлоксацин, другие хинолоны.

Вакцины: другие рекомбинантные убитые и живые вакцины и антигенный материал для применения в качестве вакцин, антигенный материал для лечения аллергии, грипп, респираторно-синцитиальный вирус ВИЧ-вакцина, вакцины гемоглобинофильного гриппа, вакцины гепатитов А,В,С, эпидимический паратит, краснуха, корь, столбняк, вакцины малярии, герпес, раковые вакцины, вакцина против.

Моноклональные антитела (человеческие, мышиные, полученные из других видов и/или рекомбинантные, и/или слитые, и/или их фрагменты), ОКТ3, ОКТ4, НА-IА.

Антитела против карциноамбрионального антигена, антиганглиозидные антитела: анти-GD2, анти-GМ2, анти-GD3, анти- GМ3, антитела, родственные антигену, ассоциированному с мочевыми путями, анти-П-2-рецептор, химерный анти-Leu-2, анти-Leu-2, химерный анти-Leu-3а, химерный L 6, моноклональные антитела L 6, меченный радиоактивным азотопом L 6, центорекс, центоксин, Панорекс®(Panorex®), анти-LPS, иммунотоксин, антитела на фактор некроза опухоли, антипсевдомонас, антитела на фактор некроза опухоли, ОнкоТер130, KS 1/4-OAVLB, ADCC-агент, мышиные моноклональные антитела на человеческие В-клеточные лимфомы (анти- идиотипы), мышиные моноклональные антитела (IMelpgl) (анти-идиотип) против мышиных моноклональных антител на антиген, ассоциированный с меланомой анти-В4-блокированный рицин, анти-My9-блокированный рицин, ИммуРаид-СЕА, моноклональные антитела против рака ободочной кишки и прямой кишки, рака яичников и рака легких, меченные рением-186 моноклональные антитела, Ортоклон ОКТ® , ES^TM, LYM-1, TNT,
Гербициды: триазин, хлорацетамид, цианазин, бентазон, бутахлор, CNP, хлометоксинил, симетрин, атразин, алахлор, цианазин, метолахлор, метрибузин, фенокcигербициды: 2,4-Д [(2,4-диклорфенокси) уксусная кислота], 2,4-Д амин 32,4-дихлорфеноксиуксусная кислота диметиламин), 2,4-Д изооктил (изооктиловый эфир 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты), 2,4,5-Т амин (2,4,5-трихлорфеноксиуксусная кислота триметиламин) другие триазиновые гербициды, другие хлорацетамидные гербициды, другие феноксикислотные гербициды.

Пестициды: Абамектин, другие авермектины, атразин, линдан, дихлорвос, диметоат, варфарин, п,п'- ДДД, п,п'- ДДЕ, НСН, ДМДТ, алдрин, дильдрин, алдикарб, EOB, DCP, DBCP, симазин, цианазин, токсин Bacillus thuringiensis Bacillus thuringiensis var. kurstaki, оксид бис (три-н-бутилолова)(ТВТО), другие хлорорганические пестициды.

Белки и гликопротеины: лимфокины, интерлейкины - 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 цитокины, GM-CSP (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор) M- CSF, G-CSF, фактор некроза опухоли, ингибин, фактор роста опухоли, мюллерова ингибирующая субстанция, фактор роста нерва, фибробластный фактор роста, тромбоцитарный фактор роста, фактор свертывания крови (например VIII, IX, VII), инсулин, активатор тканевого плазминогена, антиген гистосовместимости, онкогенные продукты, основной миелиновый белок, коллаген, фибринонектин, ламинин, другие белки, изготовленные способом генной инженерии, эритропоиэтин, слитые белки IL-1/GM-CSF, моноклональные антитела, поликлональные антитела, слитые белки антитело-токсин, конъюгат антитело-радионуклид, интерфероны, фрагменты и пептидные аналоги и аналоги фрагмента белков, пептидов и гликопротеинов, эпидермальный фактор роста, CD4-рецептор и другие рекомбинантные рецепторы, другие белки, выделенные из природных источников, антидиуретический гормон, окситоцин, адренокортикотропный гормон, кальцитонин, фолликулостимулирующий гормон, гормон, высвобождающий лютеинзирующий гормон, лютеинзирующий гормон, гонатотропин, факторы трансформации роста, стрептокиназа, человеческий гормон роста.

Соматотропины других видов, включая, но не ограничиваясь ими: 1) свиной, 2) бычий, 3) птичий, 4) овечий, 5) рыбий, гормоны, высвобождающие гормон роста людей и различных видов животных, глюкагон, Десмопрессин, Гормон, высвобождающий гормоны щитовидной железы, Гормон щитовидной железы, Секретин, Магаинины, Интегрины, Пептиды адгеэии, включая, но ограничиваясь ими, пептиды, имеющие последовательность Аргинин-глутамин- аспарагиновая кислота, Супероксиддисмутаза, Дефензины, Т-клеточные рецепторы, Антагонисты брадикинина, Пентигетид, Пептид Т, Антинфламмины, Основные компоненты комплекса гистосовместимости (МНС) и пептиды, направленные к МНС, Ингибиторы протеазы, Липрессин, Бузерелин, Леупролид, Нафарелин, Дезлорелин, Гозерелин, Гисторелин, Трипторелин, Антагонисты ЛГ-ВГ (LHRH), НОЕ- 2013, Детиреликс, Org-30850, ORF-21243, Пептидный ингибитор фермента, превращающего ангиотензин, Пептиды ингибирования ренина, Эбиратид (НОЕ-427), DGAVP, Агонисты и антагонисты опиоидных рецепторов, включая, но не ограничиваясь ими: 1. Энкефалины, 2. Эндорфины, Е-2078, ДРДРЕ, Вазоактивный кишечный пептид, Предсердный натриуретический пептид (фактор), Натриуретический пептид головного мозга, Ингибиторы выведения предоердного пептида, Гирудин, Ингибиторы онкогенов, Другие колониестимулирующие факторы
Нейротрансмиттеры: Допамин, Эпинефрин, Норэпинефрин, ацетилхолин, Гаммааминомасляная кислота.

Радиоконтрастные средства: Хелаты гадолиния, Иогексол, Этиодол, Иодексинол.

Радионуклиды: Технецкий, Индий, Иттрий, Галлий,
Другие: Ингибиторы клеточных поверхностных рецепторов.

Термин "терапевтически эффективный", в отношении заявленных композиций, обозначает, что терапевтический агент присутствует в водной фазе внутри везикул в концентрации, достаточной для достижения отдельного медицинского эффекта, для которого предназначено данное терапевтическое средство. Примерами, без ограничения, желательных медицинских эффектов, которых можно достигнуть с применением композиции изобретения, являются химиотерапия, терапия антибиотиками и регулирование метаболизма. Точные дозировки будут изменяться в зависимости от таких факторов, как конкретное фармацевтическое средство и желательный медицинский эффект, а также характеристики пациента, например возраста, пола, общего состояния и тому подобного. Специалисты настоящей области могут легко учитывать эти факторы и применять их для установления эффективных терапевтических концентраций без обращения к неуместному экспериментированию.

Обычно диапазон дозировок, пригодных для человека, составляет 0,1-6000 мг/м² площади поверхности тела. Например, для подкожного введения требуемая доза может быть очень мала, но для других способов, например для внутрибрюшинного введения, рекомендуемая доза может быть очень большой. Хотя предписанные дозы могут выходить за пределы указанного выше интервала, он содержит значения, рекомендуемые для практически всех биологически активных веществ.

Синтетические мембранные везикулы можно вводить любым способом, например внутримышечным, внутритрахеальным, внутрибрюшинным, подкожным, внутривенным, внутрилимфатическим, пероральным и в подслизистую оболочку, под различный эпителий, включая бронхиальный, желудочно-кишечный, мочеполовой эпителий и различные слизистые оболочки тела.

Кроме этого, синтетические мембранные везикулы данного изобретения можно использовать для инкапсулирования соединений, ценных для сельскохозяйственных применений, например удобрений, пестицидов, тому подобное. Для использования в сельском хозяйстве синтетические мембранные везикулы можно распылять или распространять на площади почвы, где будут выращивать растения, и эффективное для сельского хозяйства соединение, содержащееся в везикулах, будет выделяться благодаря контактированию с дождевой водой и поливной водой. В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения, везикулы с медленным высвобождением можно смешать с поливной водой, которую применяют для растений и сельскохозяйственных культур. Специалист данной области обычно способен выбрать эффективное количество соединения, полезного в сельскохозяйственных применениях для достижения конкретной желаемой цели, например уничтожения вредителей, подкормки растений и т.д.

Синтетические мембранные везикулы можно модифицировать для придания органу или клеткам специфичности мишени, на пример введением их в системы, обеспечивающие направленную доставку. Такие модификации могут быть, в частности, уместны при применении синтетических мембранных везикул данного изобретения для введения лекарственных средств, которые очень токсичны или способны индуцировать серьезные побочные эффекты, например таксол.

Направленную доставку синтетических мембранных везикул в мишень классифицируют на основе анатомических и механических факторов. При анатомической направленной доставке синтетические мембранные везикулы доставляют прицельно в определенное место тела, например осуществляют орган-специфическую, клетки-специфическую и органелла-специфическую доставку. Механистическую доставку в мишень можно различать на основании того, пассивная или активная эта доставка.

Пассивная доставка в мишень использует природную тенденцию синтетических мембранных везикул данного изобретения распределяться в клетках ретикулоэндотелиальной системы (RES) в органах, которые содержат синусоидные капилляры. При активной доставке в мишень, с другой стороны, синтетическую мембранную везикулу вводят в систему для доставки в мишень соединением ее со специфическим лигандом, например моноклональным антителом, сахаром, гликолипидом или белком, или изменением состава или размера синтетических мембранных везикул, чтобы достичь направленную доставку их в органы и типы клеток, другие, чем встречающиеся в природе места (сайты) локализации (смотри, например, Remington's Pharmaceutical Sciensis, Gannaro, A.R., Mack Publisning, 18, Edition hh 1691-1693, 1990).

В общем, соединения, которые должны быть соединены с поверхностью синтетических мембранных везикул, будут лигандами и рецепторами, которые позволяют дисперсной системе активно "попасть в цель" на желаемой ткани. Лигандом может быть любое представляющее интерес соединение, которое будет специфически связываться с другим соединением, именуемым рецептором, так чтобы лиганд и рецептор образовали гомогенную пару.

Поверхность системы для направленной в цель доставки можно модифицировать различными способами. Например, в липидный бислой синтетических мембранных везикул можно ввести липидные группы, чтобы поддерживать "прицельный" лиганд в стабильной ассоциации с липидным бислоем. Для соединения липидных цепей с "прицельным лигандом" можно применять различные соединяющие группы (Mannino,et al., Bio Techniques, 6(7): 682, 1988). Соединения, соединенные с поверхностью синтетических мембранных везикул, могут изменяться от маленьких гаптенов с мол.массой около 125-200 до много больших антигенов с мол. массой по меньшей мере 6000, но обычно мол. массой менее 1 миллиона. Конкретный интерес представляют белковые лиганды и рецепторы.

В общем, поверхностные мембранные белки, которые связываются со специфическими молекулами-эффекторами, именуются рецепторами. В данном изобретении предпочтительными рецепторами являются антитела. Эти антитела могут быть моноклональными или поликлональными и могут быть их фрагментами, например. Fab F(ab')₂ и F_v которые способны связываться с антигенной детерминантой. Способы связывания белков, например антител, с синтетическими мембранными везикулами хорошо известны (смотри, например, патенты США N 4806466 и 4857735).

Антитела можно применять для прицельной доставки синтетических мембранных везикул к лигандам поверхности специфических клеток. Например, некоторые антигены, экспрессированные специфически на опухолевых клетках, обозначаемые опухолеспецифическими антигенами (TAAS), можно использовать для цели направленной доставки содержащих антитела синтетических мембранных везикул непосредственно в злокачественные опухоли. Поскольку действие композиции, введенной в синтетические мембранные везикулы, может быть неразборчивым в отношении типа клеток, направленные в цель синтетические мембранные везикулы представляют собой усовершенствование по сравнению с беспорядочно инъецируемыми неспецифическими синтетическими мембранными везикулами. Для ковалентного связывания поликлональных или моноклональных антител с бислоем синтетических мембранных антител можно применять ряд способов. Синтетические мембранные везикулы с "прицельными" антителами могут включать моноклональные или поликлональные антитела или их фрагменты, например Fab или F(ab')₂, поскольку они эффективно связываются с антигенным эпитопом на клетках-мишенях. Синтетические мембранные везикулы можно также направленно доставлять к клеткам, экспрессирующим рецепторы гормонов или другие факторы сыворотки крови (Malone et al., Proc. Nat'1. Acad. Sci., USA, 86: 6077, 1989; Gregoriadis, Immynology Todey, 11 (3): 89, 1990).

Пример 1
Стадия 1. В чистый стеклянный цилиндр (2,5 см внутреннего диаметра х 10,0 см высоты) помещали 5 мл раствора, содержащего 46,5 мкмоль диолеоилфосфатидилхолина, 10,5 мкмоль дипальмитоилфосфатидилхолина, 75 мкмоль холестерина, 9,0 мкмоль триолеина в хлороформе (липидная фаза).

Стадия 2. Пять мл водной фазы, цитарабин (20 мг/мл), растворенный в 0,136N перхлорной кислоты, агент, изменяющий скорость высвобождения, добавляют в указанный выше стеклянный цилиндр, содержащий липидную фазу. Осмотическое давление водного раствора около 274 + 20 мОс/кг. Для других агентов, изменяющих скорость высвобождения, а именно азотной кислоты, муравьиной кислоты, серной кислоты, фосфорной кислоты, уксусной кислоты, трихлоруксусной кислоты и трифторукоусной кислоты, приготовили растворы 20 мг/мл цитарабина с применением этих агентов для получения водных растворов, являющихся почти изотоническими относительно конечной среды для хранения, а именно изотонического физиологического солевого раствора (0,9% хлористого натрия).

Стадия 3. Для приготовления эмульсии вода-в-масле применяли гомогенизатор (Auto Homo Mixer, Model, Tokushu Kika, Osaka, Japan), перемешивали 8 мин при скорости вращения 9000 об/мин.

Стадия 4. Для приготовления шариков хлороформа, суспендированных в воде, 20 мл раствора, содержащего 4% декстрозы и 40 мМ лизина помещали в виде слоя сверху эмульсии вода-в-масле и затем перемешивали в течение 60 сек при скорости 4000 об/мин для образования шариков хлороформа.

Стадия 5. Шарики хлороформа, суспендированные в стеклянном цилиндре, наливали на дно колбы Эрленмейера на 1000 мл, содержащей 30 мл воды, глюкозу (3,5 г/100 мл) и лизин в форме свободного основания (40 мМ). Через колбу пропускали поток азота со скоростью 7 л/мин для медленного выпаривания хлороформа в течение 20 минут при 37^oC. В колбу добавляли бизотонический физиологический солевой раствор (0,9% хлористого натрия). Синтетические мембранные везикулы затем отделяли центрифугированием при 600 х г в течение 10 мин, Супернатант декантировали и шарики снова суспендировали в 50 мл изотонического физиологического солевого раствора. Шарики снова суспендировали в физиологическом растворе, чтобы достичь конечной концентрации 10 мг цитарабина на 1 мл суспензии.

Средняя длина - определенный взвешиванием средний диаметр полученных частиц синтетических мембранных везикул находится в диапазоне 12-16 мкм. Процент захвата цитарабина приводится в таблице. Применение различных агентов, изменяющих скорость высвобождения, оказывает заметное влияние на скорость высвобождения цитарабина из синтетических мембранных везикул, инкубированных в плазме крови человека. На чертеже представлен для различных кислот график зависимости процента цитарабина, удерживаемого в синтетических мембранных везикулах после инкубирования при 37^oC в плазме крови, от времени инкубирования. Период полувысвобождения лекарственного средства, рассчитанный при предположении одноэкспоненциальной модели для данных, показанных на чертеже, приводится в таблице. Данные в таблице являются средней и стандартной девиацией из трех экспериментов.

Было удивительным и неожиданным, что природа кислоты оказывает абсолютное влияние на скорость высвобождения цитарабина в плазме крови человека. Применение понопротоновых неорганических кислот, а именно соляной кислоты, азотной кислоты и перхлорной кислоты, приводило к самой низкой скорости высвобождения цитарабина. Применение дипротоновой и трипротоновой кислот, т.е. серной кислоты и фосфорной кислоты, приводило к высоким скоростям высвобождения. Органические кислоты, муравьиная кислота, уксусная кислота, трифторуксусная кислота и трихлоруксусная кислота также имеют результатом высокие скорости высвобождения.

Таким образом, данное описание изобретения предлагает препараты "депо" широкого применения и использования, в которых биологически активные вещества инкапсулируются в относительно больших количествах, которые обеспечивают продолжительное действие или доставку при терапевтических концентрациях этих веществ для достижения оптимальных результатов и скорость высвобождения вещества в которых регулируют изменением природы кислоты, применяемой в готовой препаративной форме.

Данное изобретение, следовательно, хорошо подходит и приспособлено для достижения данных результатов и целей и имеет указанные преимущества и признаки, а также другие характерные черты.

Изобретение относится к области медицины. Композиция из синтетических мембранных везикул содержит по меньшей мере один агент, изменяющий скорость высвобождения, отличный от гидрогалогенида, и по меньшей мере одно биологически активное вещество, причем везикулы имеют определенное распределение по размеру, регулируемый средний размер, величину и число внутренних камер и регулируемую скорость высвобождения биологически активного вещества. Способ получения композиции характеризуется добавлением агента, изменяющего скорость высвобождения, эффективного для пролонгирования, поддерживания и регулирования скорости высвобождения из везикул биологически активного вещества на терапевтическом уровне после инкапсулирования. Предложенная композиция более эффективна при использовании. 7 с. и 39 з.п.ф-лы, 1 табл., 1 ил.

1. Композиция, включающая синтетическую мембранную везикулу, содержащую липидные двуслойные мембраны, заключающие многочисленные неконцентрические водные камеры, содержащие одно или несколько биологически активных веществ, инкапсулированных в них, и один или несколько негидрогалогенидных агентов, изменяющих скорость высвобождения. 2. Композиция по п.1, где агенты, изменяющие скорость высвобождения, выбирают из группы, состоящей из кислоты азотной, перхлорной, муравьиной, серной, фосфорной, уксусной, трихлоруксусной и трифторуксусной и солей или их комбинаций. 3. Композиция по п.1, где агент, изменяющий скорость высвобождения, является монопротонной неорганической кислотой. 4. Композиция по п.2, где кислоты нейтрализуют акцептором протона. 5. Композиция по п.1, где биологически активное вещество является лекарственным веществом. 6. Композиция по п. 1, где биологически активные вещества выбирают из группы, состоящей из антибиотиков, вакцин, противовирусных средств, противогрибковых средств, противоопухолевых лекарственных средств, белков и гликопротеинов. 7. Композиция по п.6, где противоопухолевое лекарственное средство является цитарабином. 8. Композиция по п. 1, где биологически активные вещества выбирают из группы, состоящей из гербицидов и пестицидов. 9. Система направленной доставки, включающая композицию по п.1 с присоединенным к ней лигандом, обеспечивающим направленную доставку. 10. Система направленной доставки по п.9, где лиганд, обеспечивающий направленную доставку, является антителом или его фрагментом. 11. Система направленной доставки по п.9, где антитело является моноклональным антителом. 12. Система направленной доставки по п.9, где липидные группы вводят в липидный бислой синтетической мембранной везикулы. 13. Композиция по п.1, где направление синтетической мембранной везикулы осуществляют анатомическим способом. 14. Композиция по п.1, где направление синтетической мембранной везикулы осуществляют механистическим способом. 15. Композиция по п.1, где направление синтетической мембранной везикулы осуществляют пассивным методом. 16. Композиция по п.1, где направление синтетической мембранной везикулы осуществляют активным методом. 17. Композиция по п.16, где синтетическую мембранную везикулу направляют на цель активным методом путем связывания с фрагментом, выбранным из группы, состоящей из сахара, гликолипида и белка. 18. Синтетическая мембранная везикула по п.1, полученная способом, содержащим: (a) образование эмульсии типа "вода-в-масле" из двух несмешиваемых компонентов, содержащих по меньшей мере один органический растворитель, воду, по меньшей мере одно биологически активное вещество и по меньшей мере один негидрогалогенидный агент, изменяющий скорость высвобождения; (b) диспергирование этой эмульсии типа "вода-в-масле" в водном компоненте для образования сфер растворителя и (c) удаление органического растворителя из сфер растворителя для образования синтетической мембранной везикулы. 19. Способ получения синтетических мембранных везикул, включающий следующие стадии: (a) образование эмульсии типа "вода-в-масле" из двух несмешиваемых компонентов, содержащих по меньшей мере один органический растворитель, воду, по меньшей мере одно биологически активное вещество и по меньшей мере один негидрогалогенидный агент, изменяющий скорость высвобождения; (b) диспергирование этой эмульсии типа "вода-в-масле" в водном компоненте для образования сфер растворителя и (c) удаление органического растворителя из сфер для образования синтетических мембранных везикул, содержащих водяные капельки с биологически активным веществом и растворенный в них агент, изменяющий скорость высвобождения. 20. Способ по п.19, где концентрация негалогенидного агента, изменяющего скорость высвобождения, находится в диапазоне от около 0,1 мМ до около 0,5 М. 21. Способ по п.19, где нейтрализующий кислоту агент в концентрации от около 0,1 мМ до около 0,5 М добавляют во время стадии (b). 22. Способ по п. 19, где органический растворитель имеет растворенный липидный компонент, содержащий по меньшей мере один амфипатический липид с результирующим отрицательным зарядом и по меньшей мере один нейтральный липид. 23. Способ по п.22, где липидный компонент выбирают из группы, состоящей из фосфолипида и смеси фосфолипидов. 24. Способ по п. 23, где фосфолипиды выбирают из группы, состоящей из фосфатидилхолина, кардиолипина, фосфатидилэтаноламина, сфингомиелина, лизофосфатидилхолина, фосфатидилсерина, фосфатидилинозита, фосфатидилглицерина и фосфатидной кислоты. 25. Способ по п.24, где по меньшей мере один из фосфолипидов имеет по меньшей мере один суммарный отрицательный заряд. 26. Способ по п.24, где фосфолипид обеспечивают в смеси с холестерином. 27. Способ по п.24, где фосфолипид обеспечивают в смеси со стеариламином. 28. Способ по п.22, где липофильный биологически активный материал обеспечивают в смеси с липидным компонентом. 29. Способ по п.22, где нейтральный липид выбирают из группы, состоящей из триолеина, триоктаноина, растительного масла, лярда, говяжьего жира, токоферола и их комбинаций. 30. Способ по п.19, где органический растворитель выбирают из группы, состоящей из простых эфиров, углеводородов, галогенированных углеводородов, галогенированных простых эфиров, сложных эфиров и их комбинаций. 31. Способ по п.19, где биологически активный материал имеет гидрофильный характер. 32. Способ по п. 19, где эмульсию образуют способом, выбираемым из группы, состоящей из механического перемешивания, ультразвукового метода и распыления через форсунку. 33. Способ по п.32, где средний размер синтетических мембранных везикул и число водных камер в них определяется типом, интенсивностью, и продолжительностью выбранного способа эмульгирования. 34. Способ по п.19, где агент, изменяющий скорость высвобождения, является монопротонной неорганической кислотой, водный компонент содержит по меньшей мере один нейтрализующий агент. 35. Способ по п.34, где нейтрализующий агент выбирают из группы, состоящей из лизина в форме свободного основания, гистидина в форме свободного основания и их комбинаций. 36. Способ по п.34, где водный компонент является водным раствором, содержащим растворенные вещества, выбранные из группы, состоящей из углеводов и аминокислот. 37. Способ по п.34, где водный компонент является водным раствором, содержащим растворенные вещества, выбранные из группы, состоящей из глюкозы, сахарозы, лактозы, лизина в форме свободного основания, гистидина в форме свободного основания и их комбинаций. 38. Способ по п.19, где сферы растворителя образуют способом, выбираемым из группы, состоящей из механического перемешивания, ультразвукового метода, распыления через форсунку и их комбинаций. 39. Способ по п.38, где средний размер синтетической мембранной везикулы определяется типом, интенсивностью и продолжительностью применяемого способа. 40. Способ по п.19, где органический растворитель удаляют пропусканием газа над водным компонентом. 41. Способ по п.19, где биологически активное вещество выбирают из группы, состоящей из противоастматических средств, сердечных гликозидов, гипотензивных средств, антипаразитических средств, нуклеиновых кислот и их аналогов, антибиотиков, вакцин, противоаритмических средств, противостенокардитических средств, гормонов, противодиабетических средств, противоопухолевых средств, иммуномодуляторов, противогрибковых средств, транквилизаторов, стероидов, седативных средств и аналгетиков, сосудосуживающих средств, противовирусных средств, моноклональных антител, гербицидов, пестицидов, белков и гликопротеинов, нейротрансмиттеров, радионуклидов, радиоконтрастных средств и их комбинаций. 42. Синтетическая мембранная везикула по п.32 или 33, где биологически активное вещество выбирают из группы, состоящей из противоастматических средств, сердечных гликозидов, гипотензивных средств, антипаразитических средств, нуклеиновых кислот и их аналогов, антибиотиков, вакцин, противоаритмических средств, противостенокардитических средств, гормонов, противодиабетических средств, противоопухолевых средств, иммуномодуляторов, противогрибковых средств, транквилизаторов, стероидов, седативных средств и аналгетиков, сосудосуживающих средств, противовирусных средств, моноклональных антител, гербицидов, пестицидов, белков и гликопротеинов, нейротрансмиттеров, радионуклидов, радиоконтрастных средств и их комбинаций. 43. Способ лечения пациента биологически активным соединением, включающий введение пациенту эффективного количества терапевтического средства, инкапсулированного в синтетическую мембранную везикулу в присутствии негидрогалогенидного агента, изменяющего скорость высвобождения, эффективного для регулирования скорости высвобождения соединения на терапевтическом уровне. 44. Способ лечения пациента биологическим активным соединением, содержащий введение пациенту композиции по п.1 и любому из пп.2 - 7. 45. Способ по п. 19, где биологически активное вещество выбирают из группы, состоящей из гербицидов и пестицидов. 46. Способ лечения пациента биологически активным соединением, содержащий введение пациенту системы направленной доставки по п.9 или 10.