СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РАЗВИТИЯ РЕТИНОПАТИИ НЕДОНОШЕННЫХ Российский патент 2003 года по МПК G01N33/53 

Предлагаемое изобретение относится к офтальмологии и предназначено для прогнозирования риска развития ретинопатии недоношенных. Ретинопатия недоношенных (РН) - тяжелое заболевание недоношенных детей, нередко ведущее к инвалидности по зрению с раннего возраста. Частота РН варьирует в различных странах, достигая 24,7 на 100000 живых рождений. В Москве ежегодно выживает около 5000 недоношенных, а в Российской Федерации - более 100 тысяч. Частота РН среди выживших недоношенных детей составляет 27%, а среди глубоко недоношенных с массой тела при рождении менее 1000 г достигает 84% (Хватова А.В. с соавт. , 2000; Катаргина Л.А., Скрипец П.П., 2000). Причем, данные различных авторов о частоте РН при одной и той же массе тела широко варьируют.

Согласно международной классификации активная РН подразделяется по стадиям процесса, его локализации и протяженности.

1 стадия - появление демаркационной линии на границе сосудистой и бессосудистой сетчатки.

2 стадия - появление вала (или гребня) на месте демаркационной линии.

3 стадия - характеризуется появлением экстраретинальной фиброваскулярной пролиферации в области вала.

4 стадия - частичная отслойка сетчатки - подразделяется на 4а (без вовлечения в процесс макулярной зоны) и 4в (с отслойкой сетчатки в макуле).

5 стадия - полная, или тотальная, отслойка сетчатки.

Несмотря на многолетние клинические и экспериментальные исследования патогенез РН до конца не изучен. Наиболее сложной задачей является прогнозирование развития и характера течения заболевания.

Клинические способы прогнозирования развития РН включают выделение детей группы риска в зависимости от массы тела при рождении, гестационного возраста на момент рождения, длительности кислородотерапии и искусственной вентиляции легких, сопутствующей соматической патологией и т.д. (Хватова А.В. с соав., 1999). Они обладают низкой прогностической ценностью, т.к. очень опосредованно связаны с патогенезом заболевания.

Предлагаемый способ исследования сыворотки крови на содержание в ней антител - IgG и IgM к S-антигену сетчатки, позволяет определять риск развития РН у недоношенных детей.

За ближайший аналог принят способ прогнозирования риска развития РН по наличию периодов значительных колебаний уровней газов (рСО2 от 30 до 100 мм рт.ст. и рО2 от 33 и ниже до 75 мм рт.ст.) в крови в период выхаживания недоношенного ребенка (Коголева Л.В., 2001).

Техническим обоснованием предлагаемого изобретения является более раннее и достоверное прогнозирование риска развития РН у недоношенных детей.

Технический результат достигается за счет выявления повышенных уровней IgG и М к S-антигену сетчатки в сыворотке крови у недоношенных детей в период незавершенности формирования сетчатки (наличие аваскулярных зон без признаков ретинопатии) в возрасте 29-40 недель гестации вследствие активизации или развития органоспецифического иммунитета ребенка к структурам сетчатки (S-антигену).

Способ осуществляют следующим образом.

Кровь из вены ребенка в количестве 3 мл выдерживают в термостате при 37^oС в течение 30-45 мин, затем охлаждают в холодильнике 15-20 мин до 0^oС и помещают в центрифугу на 15 мин при скорости 1000 оборотов в мину. После этого полученную сыворотку крови без форменных элементов замораживают при -18^oС. Уровень плотности IgG и М к S-антигену сетчатки определяют с использованием иммуноферментного анализа (ИФА), применяя твердофазный метод с использованием пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента.

Исследуемые и контрольные образцы сыворотки вносят в лунку полистиролового планшета для ИФА, на котором предварительно иммобилизируют S-антиген сетчатки, выделенный из бычьих глаз (м.м. 48 кДа), затем в лунки вносят мышиные моноклональные антитела против IgG или IgM человека, конъюгированные с ферментной меткой - пероксидазой хрена (фирма "Sigma"). После добавления фермент-специфичного субстратного раствора (ОФД) и "стоп-реагента" (1N H₂SО₄) реакцию регистрируют на спектрофотометре вертикального сканирования ("Мультискан", Финляндия) при длине волны 492 нм. В качестве референт-сыворотки (положительный контроль) в ИФА используют лиофилизированную сыворотку, представляющую собой смешанный пул сывороток, полученных от пациентов с различными формами заболеваний сетчатки (диабетическая ретинопатия, увеоретиниты, идеопатическая отслойка сетчатки и др.).

В качестве отрицательного контроля используют фосфатно-буферный раствор (ФБР, рН 7,2), содержащий бычий сывороточный альбумин в концентрации 1 мг/мл (по белку). При этом мы считали необходимым и достаточным применять ФБР, который используется для разведения испытуемых проб сывороток с добавлением минимального количества неспецифического белкового препарата, учитывая, что у нормальных новорожденных детей общее содержание иммуноглобулиновых белков является низким.

Следует подчеркнуть существенное отличие "отрицательного контроля", используемого при исследовании детей с РН от отрицательных референт-сывороток, обычно используемых при исследовании в ИФА сывороток крови взрослых пациентов и детей старшего возраста, когда стандартными образцами служат сыворотки, полученные из пула крови от практически здоровых (офтальмологически и соматически) людей разных возрастных групп.

Оценку реакции проводят по разности показателей оптических плотностей (АОП), полученных при спектрофотометрическом измерении испытуемой и стандартной, нормальной тест-сыворотки, полученной из пула сывороток крови здоровых людей. Для этого вычисляли среднее значение ОП для каждой анализируемой и контрольной (стандартной-нормальной) пробы. Затем от среднего значения ОП исследуемой сыворотки вычитали среднее значение ОП нормальной контрольной сыворотки. Если полученная разница (ΔОП) была больше или равна 0,20, результат исследования считали положительным.

С целью контроля реакции находили разность между средним значением ОП положительной контрольной сыворотки (полученной из пула сывороток крови больных с выраженной патологией сетчатки и с использующейся в качестве референт-сыворотки) и нормальной контрольной сыворотки. Эта разность должна быть не менее 0,20.

Пример 1. У больной Ш., родившейся 14.11.98 г. на сроке 28 недель гестации с массой тела 1250 г в 4 недели жизни (32 недели гестации), при осмотре глазного дна были выявлены аваскулярные зоны сетчатки без признаков активной РН. Для определения риска развития РН у данного ребенка было произведено исследование крови на наличие антител к S-антигену сетчатки описанным выше способом. В результате выявлены высокие относительные плотности IgG (0,57) и IgM (0,32), что свидетельствовало о риске развития РН. В ходе динамического наблюдения у ребенка было выявлено развитие активной РН 1 стадии на 35 неделе гестации (7 неделе жизни). Осмотры проводились 1 раз в неделю. РН 2 стадия была диагносцирована на 36 неделе гестации (8 неделе жизни) и прогрессировала до 3 пороговой стадии (в 38 недель гестации, 10 недель жизни). Ребенку была выполнена профилактическая криокоагуляция аваскулярных зон сетчатки, после которой в течение 2 недель РН перешла в рубцовую стадию.

Пример 2. У больного Б. , родившегося 05.11.98 г. на сроке 28 недель гестации с массой тела 1340 г в 4 недели жизни (32 недели гестации), при осмотре глазного дна были выявлены аваскулярные зоны сетчатки без признаков активной РН. Для определения риска развития РН у данного ребенка было так же произведено исследование крови на наличие антител к S-антигену сетчатки тем же способом. В результате выявлены низкие относительные плотности IgG (0,07) и IgM (0,02), что свидетельствовало об отсутствии риска развития РН. В ходе динамического наблюдения у ребенка действительно не было выявлено признаков РН, а рост сосудов сетчатки закончился формированием нормальной сосудистой сети, что свидетельствует о том, что при низких относительных плотностях IgG и IgM риск развития РН минимален.

Из приведенных примеров видно, что предложенный способ позволяет прогнозировать развитие ретинопатии недоношенных у детей группы риска с точностью, превышающей предшествующие способы прогнозирования данного состояния.

Изобретение относится к медицине, офтальмологии и может быть использовано для прогнозирования развития ретинопатии недоношенных. Проводят иммунологическое исследование сыворотки крови. Определяют наличие антител класса IgG и IgM к S-антигену сетчатки методом иммуноферментного анализа. При показателях относительной плотности >0,1 каждого из них в сроки 29-40 недель гестации прогнозируют развитие ретинопатии недоношенных. Способ позволяет повысить эффективность прогнозирования возможности развития ретинопатии недоношенных.

Способ прогнозирования развития ретинопатии недоношенных, включающий иммунологическое исследование сыворотки крови, отличающийся тем, что определяют наличие антител класса IgG и IgM к S-антигену сетчатки методом иммуноферментного анализа и при показателях относительной плотности > 0,1 каждого из них в сроки 29-40 недель гестации прогнозируют развитие ретинопатии недоношенных.