ШТАММ ВИРУСА ЭБОЛА "ЗАИР Ч-15" ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ МОДЕЛЬНЫХ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ПРИГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ВАКЦИННЫХ ПРЕПАРАТОВ Российский патент 2004 года по МПК C12N7/00 A61K39/12 C12N7/00 C12R1/92 

Изобретение относится к биотехнологии и медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении и научных исследованиях при изучении молекулярно-биологических механизмов изменения вирулентности вируса Эбола.

Вирус Эбола был выделен в 1976 г. и отнесен к семейству Filiviridae. Филовирусы, являясь возбудителями геморрагических лихорадок, принадлежат к группе вирусов, вызывающих особоопасные заболевания. Средства специфической профилактики и эффективной терапии заболеваний, вызванных вирусом Эбола, до сих пор не разработаны (Геморрагическая лихорадка Эбола в Заире в 1976 г. Отчет международной комиссии. - Бюллетень ВОЗ 1998, т.56, 2, с.213-237).

В этих условиях вопрос о получении новых штаммов вируса Эбола для проведения модельных экспериментов и приготовления диагностических и вакцинных препаратов является весьма актуальным.

Известны штаммы вируса Эбола Zaire 76 (Connolly B.M., Steele K.E., Davis K.J., Geisbert T.W., Kell W.M., Jaax N.K., Jarling P.B. Pathogenesis of experimental Ebola virus invection in guinea pigs/ J. Infect. Dis, 1999; 179 (Suppl): S203-17) и штамм Zaire 95 (Bray M. , Davis К., Geisbert Т., Schmaljohn С. , Huggins J. A mouse model for evaluation of prophylaxis and therapy of Ebola hemorrhagic fever/ J. Infect Dis, 1999; 179 (Suppl): S. 248-218). Указанные штаммы использовались для проведения модельных экспериментов с целью изучения патогенеза геморрагической лихорадки Эбола и путей ее профилактики и лечения на новорожденных мышах ICR.

Однако для создания диагностических и вакцинных препаратов требуется получение новых штаммов, адаптированных к разным биологическим объектам и видам животных.

Наиболее близким аналогом (прототипом), использованным для селекции нового заявляемого вирусного штамма Заир Ч-15, является штамм вируса Эбола Заир Mayinga (Chepurnov A. A., Tuzova M.N., Temovoy V.A., Chernukhin I.V. Suppressive effect of Ebola virus on Т cell proliferation in vivo is provided by a 125-kDa GP viral protein/ Immunology Letters 68 (1999) 257-261). Штамм Заир Mayinga получен из Белорусского НИИ эпидемиологии и микробиологии, представляет собой 10%-ный гомогенат печени инфицированных обезьян М. Rhesus.

Основные характеристики штамма-прототипа:
Название вируса в соответствии с правилами номенклатуры и положение в современной системе классификации: порядок Mononegavirales; семейство Filoviridae; род Ebolavirus; вид Zaire virus; штамм Zaire Mayinga.

Область использования вируса: изучение патогенеза геморрагической лихорадки Эбола и путей ее профилактики и лечения на новорожденных мышах ICR.

Тип нуклеиновой кислоты: РНК. Структура нуклеиновой кислоты: одна молекула неинфекционной негативной линейной одно-цепочечной РНК.

Молекулярная масса нуклеиновой кислоты: 4,2•10⁶ Да. Масса вириона: 4,64•10⁸ Да. Морфология вириона: длинные филаментозные формы иногда с ветвлениями, иногда U-образные формы или циркулярные. Размеры вириона: диаметр - около 80 нм, длина частиц может достигать 14000 нм. Тип симметрии капсида: спиральный.

Физико-химические свойства вириона: коэффициент седиментации около 1400 S, плотность вирионов около 1,14 г/мл, что соответствует плотности структур, содержащих РНК, белок и липиды. Вирионы содержат 8 белков: 2 гликопротеина (GP1 и GP2, трансмембранные белки с молекулярным весом 120 и 26 кДа соответственно), 4 белка рибонуклеокапсидного комплекса (NP с молекулярным весом 104 кДа и функцией инкапсидации; VP35 с молекулярным весом 35 кДа и функцией фосфопротеинового аналога; VP 30 с молекулярным весом 30 кДа и функцией инкапсидации и связывания; L с молекулярным весом 180 кДа и функцией РНК-полимеразы), а также 2 белка, ассоциированных с мембраной (VP24 с молекулярным весом 24 кДа и неизвестной функцией; VP40 молекулярным весом 40 кДа и функцией матриксного протеина).

Культуральные признаки: в культуре клеток Vero вирус не вызывает четких цитопатических изменений, хотя признаки клеточных изменений отмечаются - появляются очаги округлых клеток с увеличенной оптической плотностью. В культуральной жидкости и клетках при помощи электронной микроскопии уже на 3-й день после заражения обнаруживаются характерные частицы вируса, состоящие из нуклеокапсидной массы; окончательное почкование вирионов происходит на клеточных мембранах.

Патогенность для организма: вирус в больших концентрациях может накапливаться в крови (10^5,5-10^6,5 БОЕ/мл, ткани печени, селезени, легких и поджелудочной железы). Механизм передачи, источник инфекции, географическое распространение: контактное распространение инфекции от человека к человеку, заражение осуществляется путем прямого контакта с инфицированными кровью, мочой, носоглоточным отделяемым больного человека; источник инфекции - больной человек, в природе носителей вируса Эбола не найдено. Географическое распространение: государства Центральной Африки (Заир). Контагиозность: высокая.

Генетические взаимодействия: структура генома вируса Эбола свидетельствует о родственных связях с семействами Paramyxoviridae и Rhabdoviridae.

Способ и условия для длительного хранения: хранится в виде 10%-ной суспензии печени инфицированных обезьян М. Резус, приготовленной на желточно-сахарозной среде при температуре минус 70^oС.

Недостатком штамма-прототипа является то, что он адаптирован к узкому спектру биологических объектов, что не позволяет его использовать для создания диагностических и вакцинных препаратов.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение отечественного авторского штамма вируса Эбола, адаптированного к более широкому спектру биологических объектов и используемого для проведения модельных экспериментов на разных биологических объектах и видах животных с целью изучения молекулярно-биологического механизма изменения вирулентности вируса Эбола и создания диагностических и вакцинных препаратов.

Штамм вируса Эбола "Заир Ч-15" (авторское название) получен в лаборатории особоопасных вирусных инфекций Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" и депонирован 20.03.2001 г. в НИИ "Коллекция культур микроорганизмов" Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" (Новосибирская обл., п. Кольцово, ГНЦ ВБ "Вектор") под регистрационным номером V-337.

Название вируса в соответствии с правилами номенклатуры и положение в современной системе классификации:
Порядок: Mononegavirales
Семейство: Filoviridae
Род: Ebolavirus
Вид: Zaire vims
Штамм: Zaire Ch-15
Новый вирусный штамм Заир Ч-15 получен из исходного штамма Заир Mayinga путем 15 последовательных пассажей на диплоидной культуре клеток легкого эмбриона человека Л-68.

МОРФОЛОГИЯ (архитектура)
Форма вириона: длинные филаментозные формы, иногда с ветвлениями, иногда U-образные формы или циркулярные.

Размер вириона: диаметр - около 80 нм, длина частиц может достигать 14000 нм.

Капсид (форма, размер): диаметр - около 80 нм, длина частиц может достигать 14000 нм.

Тип симметрии капсида: спиральный
ГЕНО- И ХЕМОТАКСОНОМИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ
Тип нуклеиновой кислоты (НК): РНК
Молекулярная масса НК: 4,64•10⁶ Да
Форма НК: одна молекула неинфекционной линейной негативной одноцепочечной РНК.

Рестрикционные характеристики: (8 белков) 2 гликопротеина (GP1 и GP2), 4 белка рибонуклеокапсидного комплекса (NP; VP35; VP; L), 2 белка, ассоциированных с мембраной (VP24, VP40).

Углеводы: гликопротеины GP1 и GP2
Ферменты: РНК-полимераза; транскриптаза
Наличие мутации в гене: частично изучены; обнаружены нуклеотидные замены в гене, кодирующем белок Vp24 His>TYR¹⁸⁶, Asp>Gly¹⁶⁵.

Стратегия вирусного генома (способ репродукции): геномная РНК выполняет две матричные функции: транскрипции и репликации. Общая схема репликации: минус-цепь родительской РНК> плюс-цепь РНК> минус-цепь РНК потомства> вирионы потомства.

Другие особенности: в вирионе содержится фермент транскриптаза; синтезируемые мРНК имеют длину одного гена, кодирующего единичный полипептид, что ведет к контролю относительного количества отдельных белков.

Физико-химические свойства вириона: коэффициент седиментации около 1400 S, плавучая плотность вирионов около 1,14 г/мл, что соответствует плотности структур, содержащих РНК, белок и липиды. Вирионы содержат 8 белков: 2 гликопротеина (GP1 и GP2, трансмембранные белки с молекулярным весом 120 и 26 кДа соответственно), 4 белка рибонуклеокапсидного комплекса (NP с молекулярным весом 104 кДа и функцией инкапсидации; VP35 с молекулярным весом 35 кДа и функцией фосфопротеинового аналога; VP 30 с молекулярным весом 30 кДа и функцией инкапсидации и связывания; L с молекулярным весом 180 кДа и функцией РНК-полимеразы), а также 2 белка, ассоциированных с мембраной (VP24 с молекулярным весом 24 кДа и неизвестной функцией; VP40 молекулярным весом 40 кДа и функцией матриксного протеина).

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
Условия культивирования (среда, Т^o, время,): среда Игла MEM с добавлением 2%-ной сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиков из расчета 100 ед/мл. Культивирование производится при температуре 37^oС в течение 5 суток на культурах клеток Л-68 или Vero. Конечный титр вируса: 4,2•10⁴ БОЕ/мл.

Способ и условия для длительного хранения: хранится в виде 10%-ной суспензии печени инфицированных обезьян М. Резус, приготовленной на желточно-сахарозной среде при температуре минус 70^oС.

Способ определения (тестирования): титрование методом образования негативных колоний под агаровым покрытием на культуре клеток Vero.

Безопасность: относится к 1 группе биологической опасности, все работы производятся в условиях максимальной биологической безопасности.

КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА
Условия культивирования in vitro: питательная среда Игла MEM с добавлением 2%-ной сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиков из расчета 100 ед/мл, чувствительные клетки Vero или Л-68, температура культивирования (37,0±0,5)^oС, заражающая доза вируса 0,01 БОЕ/мл, время культивирования 120±12 часов. Число пассажей - 15.

Цитопатический эффект: в культуре клеток Vero вирус не вызывает четких цитопатических изменений, хотя признаки клеточных изменений отмечаются - появляются очаги округлых клеток с увеличенной оптической плотностью.

Специфические включения (цитоплазменные, ядерные): в культуральной жидкости и клетках при помощи электронной микроскопии уже на 3-й день после заражения обнаруживаются характерные частицы вируса, состоящие из нуклеокапсидной массы; окончательное почкование вирионов происходит на клеточных мембранах.

Титр вируса (при определенных условиях): 4,2•10⁴ БОЕ/мл; время накопления - 72 часа.

Устойчивость к действию внешних факторов и химических веществ. Вирусы инактивируются различными детергентами (твин-80, ND-40), эфиром, хлорсодержащими дезинфектантами, 1%-ным формалином, бета-пропиолактоном, а также ультрафиолетовым и гамма-облучением. Вирусы инактивируются полностью при температуре (58±2)^oС и экспозиции 2 часа.

АНТИГЕННЫЕ СВОЙСТВА
Антигенная структура: антигенные свойства сохранены, нет серологических различий между исходным вирусным штаммом Заир Mayinga и Заир Ч-15. Константа нейтрализации вирусов гомологичной сывороткой: не менее 1000. Гемагглютинирующей активностью заявляемый штамм не обладает.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ПРИЗНАКИ И СВОЙСТВА
Иммуногенность: вызывает продукцию противовирусных антител, в том числе и вируснейтрализующих. Вирулентность: вирулентность сохранена для морских свинок, обезьян, снижена для новорожденных мышей ICR от 7,45 до 2,25 lg ЛД₅₀. Контагиозность: высокая при прямом контакте с инфекционным материалом, допускается возможность заражения воздушно-капельным путем. Стабильность аттенуации: сохраняет свою стабильность после пассажей на культуре клеток Vero.

МАРКЕРНЫЕ ПРИЗНАКИ ШТАММА И МЕТОДЫ ИХ ВЫЯВЛЕНИЯ: генетических, биохимических и иммунологических признаков нет. Другие признаки: снижена вирулентность для новорожденных мышей ICR от 7,45 до 2,25 lg ЛД₅₀.

Генетические взаимодействия: структура генома вируса Эбола свидетельствует о родственных связях с семействами Paramyxoviridae и Rhabdoviridae.

Характеристика жизненного цикла вируса: проникновение через микротравмы кожных покровов и слизистых, первичная репликация происходит, скорее всего, в макрофагах, после чего с кровотоком вирус попадает в клетки печени (главный орган-мишень), селезенки, почек, надпочечников. Вирусная репликация характерна для вирусов с негативным геномом. Вирусная нуклеокапсидная масса накапливается в цитоплазме в виде телец включения. Окончательное почкование вирионов происходит на клеточных мембранах.

Стабильность биологических свойств: сохраняет приобретенные свойства после пассажей на культуре клеток Vero.

Способ и условия для длительного хранения: хранится в виде вируссодержащей культуральной жидкости при температуре минус 70^oС.

Пассажная история штамма вируса Эбола "Заир Ч-15"
В качестве исходного материала для селекции использовали вирус Эбола штамм Mayinga, полученный из Белорусского НИИ эпидемиологии и микробиологии.

Согласно пассажной истории штамм Mainga прошел 24 пассажа на культуре клеток Vero E6. Он обладал высокой вирулентностью для новорожденных мышей (7,45 lg LD₅₀) и некоторой инфекционностью (4,5 lg ID₅₀) для морских свинок. В результате исследований проведено 15 последовательных пассажей исходного вируса на диплоидной культуре клеток Л-68. Пассирование на культуре клеток проводили, заражая сформированный монослой клеток легкого эмбриона человека (Л-68) вирусом в дозе 0,1-0,01 БОЕ/клетку. Урожай снимали на 5-6-е сутки и заражали полученным вирусом свежий монослой культуры клеток.

Титрование вируса проводили методом негативных колоний под агаровым покрытием на культуре клеток Vero и по летальному эффекту при внутримозговом заражении новорожденных белых мышей.

В опытах использовали морских свинок весом 200-300 г, беспородных белых мышей (новорожденных и взрослых), мышей BALB/c и кроликов весом 1-1,5 кг. Животных содержали на стандартном рационе. Все болезненные процедуры проводили с использованием анальгезирующих средств.

Урожай каждого пассажа, собранный на 5-й день после заражения, титровали на мышах-сосунках и монослое клеток Vero под агаровым покрытием. Как видно из таблицы биологический титр урожая вируса в БОЕ снижался с 1-го по 3-й пассаж, а затем возрастал, достигнув плато к 12-му пассажу, после чего оставался неизменным. Вирулентность для новорожденных мышей при этом постоянно снижалась, достигнув плато с остаточной вирулентностью в 2,25 lg LD₅₀ к 12-му пассажу, и далее также оставалась неизменной. Инфекционность для морских свинок в процессе пассирования вируса на культуре клеток Л-68 практически не изменилась.

Таким образом, заявляемый штамм обеспечивает усиление патогенности на рассматриваемых видах биологических объектов, что позволяет его использовать для проведения модельных экспериментов на указанных биологических объектах и видах животных с целью изучения молекулярно-биологического механизма изменения вирулентности вируса Эбола и разработки подходов к созданию диагностических и вакцинных препаратов.

Штамм Заир Ч-15 получен в лаборатории особоопасных вирусных инфекций Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" и депонирован 20.03.2001 г. в НИИ Коллекция культур микроорганизмов Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" (Новосибирская обл., п. Кольцово, ГНЦ ВБ "Вектор") под регистрационным номером V-337. Штамм вируса Эбола адаптирован к широкому спектру биологических объектов и используется для проведения модельных экспериментов на разных биологических объектах и видах животных с целью изучения молекулярно-биологического механизма изменения вирулентности вируса Эбола и создания диагностических и вакцинных препаратов. 1 табл.

Штамм вируса Эбола "Заир Ч-15", коллекция ГНЦ ВБ "Вектор", регистрационный номер V-337, используемый для проведения модельных экспериментов и приготовления диагностических и вакцинных препаратов.