ШТАММ ВИРУСА ЭБОЛА "ЗАИР К-5" ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ МОДЕЛЬНЫХ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ПРИГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ВАКЦИННЫХ ПРЕПАРАТОВ Российский патент 2004 года по МПК C12N7/00 A61K39/12 C12N7/00 C12R1/92 

Изобретение относится к биотехнологии и медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении и научных исследованиях при изучении молекулярно-биологических механизмов изменения вирулентности вируса Эбола.

Вирус Эбола был выделен в 1976 г. и отнесен к семейству Filiviridae. Филовирусы, являясь возбудителями геморрагических лихорадок, принадлежат к группе вирусов, вызывающих особоопасные заболевания. Средства специфической профилактики и эффективной терапии заболеваний, вызванных вирусом Эбола, до сих пор не разработаны (Геморрагическая лихорадка Эбола в Заире в 1976 г. Отчет международной комиссии. - Бюллетень ВОЗ 1998, т.56, 2, с.213-237).

В этих условиях вопрос о получении новых штаммов вируса Эбола для проведения модельных экспериментов и приготовления диагностических и вакцинных препаратов является весьма актуальным.

Известны штаммы вируса Эбола Zaire 76 (Connolly B.M., Steele K.E., Davis K. J. , Geisbert T.W., Kell W.M., Jaax N.K., Jarling PB. Pathogenesis of experimental Ebola vims invection in guinea pigs/ J. Infect. Dis, 1999; 179 (Suppl): S203-17) и штамм Zaire 95 (Bray M. , Davis К., Geisbert Т., Schmaljohn С. , Huggins J. A mouse model for evaluation of prophylaxis and therapy of Ebola hemorrhagic fever/ J. Infect Dis, 1999; 179 (Suppl): S248-218). Указанные штаммы использовались для проведения модельных экспериментов с целью изучения патогенеза геморрагической лихорадки Эбола и путей ее профилактики и лечения на новорожденных мышах ICR.

Однако для создания диагностических и вакцинных препаратов требуется получение новых штаммов, адаптированных к разным биологическим объектам и видам животных.

Наиболее близким аналогом (прототипом), использованным для селекции новых заявляемых вирусных штаммов Заир Ч-15 и Заир К-5, является штамм вируса Эбола Заир Mayinga (Chepurnov A.A., Tuzova M.N., Ternovoy V.A., Chernukhin I. V. Suppressive effect of Ebola virus on Т cell proliferation in vivo is provided by a 125-kDa GP viral protein/ Immunology Letters 68 (1999) 257-261). Штамм Заир Mayinga получен из Белорусского НИИ эпидемиологии и микробиологии, представляет собой 10%-ный гомогенат печени инфицированных обезьян М. Rhesus.

Основные характеристики штамма-прототипа:
Название вируса в соответствии с правилами номенклатуры и положение в современной системе классификации: порядок Mononegavirales; семейство Filoviridae; род Ebolavirus; вид Zaire virus; штамм Zaire Mayinga.

Область использования вируса: изучение патогенеза геморрагической лихорадки Эбола и путей ее профилактики и лечения на новорожденных мышах ICR.

Тип нуклеиновой кислоты: РНК. Структура нуклеиновой кислоты: одна молекула неинфекционной негативной линейной одно-цепочечной РНК.

Молекулярная масса нуклеиновой кислоты: 4,2 •10⁶ Д. Масса вириона:
4,64 •10⁸ Д. Морфология вириона: длинные филаментозные формы, иногда с ветвлениями, иногда U-образные формы или циркулярные. Размеры вириона: диаметр - около 80 нм, длина частиц может достигать 14000 нм. Тип симметрии капсида: спиральный.

Физико-химические свойства вириона: коэффициент седиментации около 1400 S, плотность вирионов около 1,14 г/мл, что соответствует плотности структур, содержащих РНК, белок и липиды. Вирионы содержат 8 белков: 2 гликопротеина (GP1 и GP2, трансмембранные белки с молекулярным весом 120 и 26 кД соответственно), 4 белка рибонуклеокапсидного комплекса (NP с молекулярным весом 104 кД и функцией инкапсидации; VP35 с молекулярным весом 35 кД и функцией фосфопротеинового аналога; VP 30 с молекулярным весом 30 кД и функцией инкапсидации и связывания; L с молекулярным весом 180 кД и функцией РНК-полимеразы), а также 2 белка, ассоциированных с мембраной (VP24 с молекулярным весом 24 кД и неизвестной функцией; VP40 молекулярным весом 40 кД и функцией матриксного протеина).

Культуральные признаки: в культуре клеток Vero вирус не вызывает четких цитопатических изменений, хотя признаки клеточных изменений отмечаются - появляются очаги округлых клеток с увеличенной оптической плотностью. В культуральной жидкости и клетках при помощи электронной микроскопии уже на 3-й день после заражения обнаруживаются характерные частицы вируса, состоящие из нуклеокапсидной массы; окончательное почкование вирионов происходит на клеточных мембранах.

Патогенность для организма: вирус в больших концентрациях может накапливаться в крови (10^5,5-10^6,5 БОЕ/мл, ткани печени, селезенки, легких и поджелудочной железы. Механизм передачи, источник инфекции, географическое распространение: контактное распространение инфекции от человека к человеку, заражение осущесвляется путем прямого контакта с инфицированными кровью, мочой, носоглоточным отделяемым больного человека; источник инфекции - больной человек, в природе носителей вируса Эбола не найдено. Географическое распространение: государства Центральной Африки (Заир). Контагиозность: высокая.

Генетические взаимодействия: структура генома вируса Эбола свидетельствует о родственных связях с семействами Paramyxoviridae и Rhabdoviridae.

Способ и условия для длительного хранения: хранится в виде 10%-ной суспензии печени инфицированных обезьян М. Резус, приготовленной на желточно-сахарозной среде при температуре минус 70^oС.

Недостатком штамма-прототипа является то, что он адаптирован к узкому спектру биологических объектов, что не позволяет его использовать для создания диагностических и вакцинных препаратов.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение отечественного авторского штамма вируса Эбола, адаптированного к более широкому спектру биологических объектов и используемого для проведения модельных экспериментов на разных биологических объектах и видах животных с целью изучения молекулярно-биологического механизма изменения вирулентности вируса Эбола и создания диагностических и вакцинных препаратов.

Штамм вируса Эбола "Заир К-5" получен в лаборатории особоопасных вирусных инфекций Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" и депонирован 20.03.2001г. в НИИ "Коллекция культур микроорганизмов" Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" (Новосибирская обл. , п. Кольцово, ГНЦ ВБ "Вектор") под регистрационным номером V-338.

Название вируса в соответствии с правилами номенклатуры и положение в современной системе классификации:
Порядок: Mononegavirales
Семейство: Filoviridae
Род: Ebolavirus
Вид: Zaire virus
Штамм: Zaire K-5.

Область использования вируса (вакцинный, диагностический штамм): изучение молекулярно-биологических механизмов изменения вирулентности вируса Эбола, использование морских свинок в качестве модели в экспериментах по изучению патогенеза, лечения и профилактики геморрагической лихорадки Эбола.

Новый вирусный штамм получен из исходного штамма Заир Mayinga путем 15 последовательных пассажей на культуре клеток Л-68 с последующим клонированием. Адаптация полученного клона 1 к нелинейным морским свинкам массой 180-200 г путем 5 последовательных пассажей. В качестве пассажного материала использовали 10%-ный гомогенат печени морских свинок, полученный в разгар инфекции.

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Свойство или иное назначение штамма, послужившее основанием для заявки: тест-объект с последовательно измененными свойствами с целью изучения молекулярно-биологического механизма изменения вирулентности вируса Эбола и возможности получения аттенуированной вакцины; а также для использования морских свинок для модельных экспериментов по изучению геморрагической лихорадки Эбола.

Условия культивирования (среда, Т^o, время ): среда Игла MEM с добавлением 2% сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиков из расчета 100 ед/мл. Культивирование производится при температуре 37^oС в течение 5 суток. Титр вируса: 4,8 •10⁴ БОЕ/мл или 1 •10^6,0 ЛД₅₀ для морских свинок или 1•10⁷ ИД₅₀ для морских свинок.

ГЕНО- И ХЕМОТАКСОНОМИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ
Тип НК: РНК; молекулярная масса НК: 4,64•10⁶ Д.

Особенности генетической организации (количество генов, кодируемые белки): форма НК представляет собой одну молекулу неинфекционной линейной негативной одно-цепочечной РНК
Рестрикционные характеристики: (8 белков) 2 гликопротеина (GP 1 и GP2), 4 белка рибонуклеокапсидного комплекса (NP; VP35; VP; L), 2 белка, ассоциированных с мембраной (VP24, VP40).

Электрофореграмма: Углеводы: гликопротеины GP1 и GP2
Ферменты (наличие): РНК-полимераза; транскриптаза.

Наличие мутации в гене: частично изучена 1 замена в гене, кодирующем белок Vp24 His >Tyr¹⁸⁶.

Стратегия вирусного генома (способ репродукции): геномная РНК выполняет две матричные функции: транскрипции и репликации. Общая схема репликации: минус - цепь родительской РНК > плюс - цепь РНК > минус - цепь РНК потомства > вирионы потомства.

Другие особенности: в вирионе содержится фермент транскриптаза; синтезируемые мРНК имеют длину одного гена, кодирующего единичный полипептид, что ведет к контролю относительного количества отдельных белков.

МОРФОЛОГИЯ (архитектура)
Форма вириона: длинные филаментозные формы, иногда с ветвлениями, иногда U-образные формы или циркулярные. Размер вириона: диаметр - около 80 нм, длина частиц может достигать 14000 нм.

Капсид (форма, размер): диаметр - около 80 нм, длина частиц может достигать 14000 нм. Электронная микрофотография: тип симметрии капсида спиральный.

КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА
Условия культивирования in vitro (питательная среда, Т^o, время и т.д.): питательная среда Игла MEM с добавлением 2% сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиков из расчета 100 ед/мл; для наработки вируса используют клетки Vero или Л-68; температура культивирования (37,0±0,5)(С, заражающая доза вируса 0,01 БОЕ/мл, время культивирования 120±12 ч. Стабильность (число пассажей)-3.

Цитопатический эффект: в культуре клеток Vero вирус не вызывает четких цитопатических изменений, хотя признаки клеточных изменений отмечаются - появляются очаги округлых клеток с увеличенной оптической плотностью. Специфические включения (цитоплазменные, ядерные): в культуральной жидкости и клетках при помощи электронной микроскопии уже на 3-й день после заражения обнаруживаются характерные частицы вируса, состоящие из нуклеокапсидной массы; окончательное почкование вирионов происходит на клеточных мембранах.

Титр вируса после окончания культивирования: 4,8 •10⁴ БОЕ/мл; время накопления - 72 ч.

ФИЗИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
Масса вириона: 4,64 •10⁸; коэффициент седиментации: 1400 S; плавучая плотность 1,14 г/мл.

УСТОЙЧИВОСТЬ К ВНЕШНИМ ФАКТОРАМ
Вирусы инактивируются различными детергентами (твин-80, ND-40), эфиром, хлорсодержащими дезинфектантами, 1%-ным формалином, бетапропиолактоном, а также ультрафиолетовым и гамма-облучением. Вирусы инактивируются полностью при температуре (58±2)^oС и экспозиции 2 ч. Штамм устойчив к высыханию.

АНТИГЕННЫЕ СВОЙСТВА
Антигенная структура: антигенные свойства сохранены, нет серологических различий между исходным вирусным штаммом Заир Mayinga и Заир К-5.

Константа нейтрализации вирусов гомологичной сывороткой: не менее 1000. Гемагглютинирующая активность: не обладает.

Образование специфических антител: обладает высокой иммуногенностью.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ПРИЗНАКИ И СВОЙСТВА
Иммуногенность: вызывает продукцию противовирусных антител, в том числе и вируснейтрализующих. Патогенность: патогенность для человека не изучена. Вирулентность: приобретена для морских свинок до 6 lg ЛД₅₀. Контагиозность: высокая при прямом контакте с инфекционным материалом, допускается возможность заражения воздушно-капельным путем. Стабильность аттенуации: сохраняет свою стабильность после трех пассажей на культуре клеток Vero. Способность продуцировать интерферон не изучена.

МАРКЕРНЫЕ ПРИЗНАКИ ШТАММА И МЕТОДЫ ИХ ВЫЯВЛЕНИЯ: генетических, биохимических и иммунологических признаков нет. Приобретена вирулентность для нелинейных морских свинок до 6lg ЛД₅₀ и по ИД₅₀ 1 • 10^7,5 для морских свинок.

Генетические взаимодействия: структура генома вируса Эбола свидетельствует о родственных связях с семействами Paramyxoviridae и Rhabdoviridae.

Характеристика жизненного цикла вируса: проникновение через микротравмы кожных покровов и слизистых, первичная репликация происходит скорее всего в макрофагах, после чего с кровотоком вирус попадает в клетки печени (главный орган-мишень), селезенки, почек, надпочечников. Вирусная репликация Характерна для вирусов с негативным геномом. Вирусная нуклеокапсидная масса накапливается в цитоплазме в виде телец включения. Окончательное почкование вирионов происходит на клеточных мембранах.

Стабильность биологических свойств: сохраняет приобретенные свойства после трех пассажей на культуре клеток Vero.

Способ и условия для длительного хранения: хранится в виде 10%-ной суспензии печени инфицированных морских свинок, приготовленной на желточно-сахарозной среде при температуре минус 70^oС.

Пассажная история штамма вируса Эбола "Заир К-5".

В качестве исходного материала для селекции использовали вирус Эбола штамм Mayinga, полученный из Белорусского НИИ эпидемиологии и микробиологии, прошедший 15 пассажей на культуре клеток Л-68.

Титрование вируса проводили методом негативных колоний под агаровым покрытием, на культуре клеток Vero, и по летальному эффекту при внутримозговом заражении новорожденных белых мышей.

В опытах использовали морских свинок весом 200-300 г, беспородных белых мышей (новорожденных и взрослых). Животных содержали на стандартном рационе. Все болезненные процедуры проводили с использованием анальгезирующих средств.

После 15-го пассажа вирус был клонирован. Клонирование вируса проводили трехкратно методом "из бляшки в бляшку" без промежуточного подращивания.

Полученные 3 клона и неклонированный вирус 15-го пассажа на 5-й день культивирования на культуре клеток Л-68 обладали одинаковым биологическим титром по БОЕ и вирулентностью для новорожденных мышей. После введения морским свинкам клона 1 на 5-9-е сутки у 60% животных было отмечено повышение ректальной температуры на 1,0-1,5^oС. В крови и печени этих животных было отмечено наличие вируса в невысоких титрах (3,5 lg БОЕ/мл).

Пассирование на морских свинках проводили, заразив внутрибрюшинно исходную группу животных культуральной суспензией вируса Эбола с титром 10⁵ БОЕ. Животных, у которых на 6-8-е сутки отмечали подъем ректальной температуры, усыпляли, асептически забирали печень и готовили 10% гомогенат, которым заражали следующую группу животных. Заражение проводили внутрибрюшинно, введением 1 мл 10% гомогената каждому животному. Наличие вируса на каждом пассаже проверяли титрованием крови и печени инфицированных животных методом негативных колоний на культуре клеток под агаровым покрытием и по гибели новорожденных мышей после внутримозгового заражения.

Дальнейшее пассирование клона 1 на этом виде животных привело к усилению температурной реакции до 40,5-41,5^oС (в норме до 39,0) и увеличению числа температурящих животных до 100%. Начиная с 4-го пассажа, появились случаи летальных исходов. Вирус, прошедший 5 пассажей, обладал высокой летальностью для морских свинок. Уровень вирулентности для новорожденных мышей при этом не изменился. Дальнейшее пассирование на морских свинках не привело к увеличению летальности для этого вида животных (таблица).

Таким образом, заявляемый штамм обеспечивает усиление патогенности на рассматриваемых видах биологических объектов, что позволяет его использовать для проведения модельных экспериментов на указанных биологических объектах и видах животных с целью изучения молекулярно-биологического механизма изменения вирулентности вируса Эбола и разработки подходов к созданию диагностических и вакцинных препаратов.

Изобретение относится к биотехнологии и медицинской вирусологии. Штамм Заир К-5 получен в лаборатории особоопасных вирусных инфекций Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" и депонирован 20.03.2001 г. в НИИ Коллекция культур микроорганизмов Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" (Новосибирская обл., п. Кольцово, ГНЦ ВБ "Вектор") под регистрационным номером V-338. Штамм вируса Эбола адаптирован к широкому спектру биологических объектов и используется для проведения модельных экспериментов на разных биологических объектах и видах животных с целью изучения молекулярно-биологического механизма изменения вирулентности вируса Эбола и создания диагностических и вакцинных препаратов. 1 табл.

Штамм вируса Эбола “Заир К-5”, коллекция ГНЦ ВБ “Вектор”, регистрационный номер V-338, используемый для проведения модельных экспериментов и приготовления диагностических и вакцинных препаратов.