СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКДИСТЕРОИДОВ Российский патент 2004 года по МПК C07J9/00 C07J75/00 A61K31/575 A61K35/78 

Изобретение относится к области получения биологически активных веществ из растительного сырья, а именно 20-гидроксиэкдизона (экдистерон, β-экдизон, 2β, 3β, 14α, 20, 22, 25-гексагидрокси-(20R, 22R)-5β-холест-7-ен-6-он), экдизона (α-экдизон, 2β, 3β, 14α, 22, 25-пентагидрокси-(20S, 22R)-5β-холест-7-ен-6-он), инокостерона (2β, 3β, 14α, 20, 22, 26-гексагидрокси-(20R, 22R, 25S)-5β-холест-7-ен-6-он) и макистерона А (2β, 3β, 14α, 20, 22, 25-гексагидрокси-24α-метил-(20R, 22R)-5β-холест-7-ен-6-он).

Известен способ получения экдистерона, согласно которому воздушно-сухие листья растений рода Serratula измельчают и экстрагируют водой при температуре не выше 100°С в течение 1 часа. Полученный экстракт пропускают через слой твердого гидрофобного сорбента, например, активированного угля, диасорба, полисорба, осуществляя одновременно разделение сопутствующих веществ и очистку целевого продукта. Затем продукт экстрагируют с сорбента органическим растворителем (1. Пат. РФ №2063763, кл. А 61 К 35/78, 1996 г.).

Недостатком известного способа является низкий выход целевого продукта, 0.49% от воздушно-сухого сырья, использование больших объемов дистиллированной воды и органических растворителей.

Известен способ получения экдистерона из растительного сырья путем измельчения воздушно-сухих листьев растений рода Serratula, экстракции их водой при температуре не выше 100°С и фильтрации, фильтрат концентрируют, а полученный концентрат экстрагируют этилацетатом, из экстракта частично отгоняют растворитель, сконцентрированный экстракт охлаждают и фильтруют выпавшие кристаллы экдистерона. Согласно данному способу выход целевого продукта составляет 0,65-0,7% от массы сухого растительного сырья (2. Пат. РФ №2151598, кл. А 61 К 31/575, С 01 J 75/00, 2000 г.).

Недостатком известного способа является большое количество используемого этилацетата, низкий выход целевого продукта. При использовании этого способа выделяют только β-экдизон, остальные экдистероиды не выделяются и не используются.

Наиболее близким техническим решением, выбранным за прототип, является способ одновременного получения 20-гидроксиэкдизона и инокостерона из надземной части растения Serratula coronata, включающий измельчение сырья, экстракцию целевых продуктов водой, реэкстракцию гидрофобных сопутствующих веществ углеводородным растворителем, осаждение фенольных соединений из водного экстракта сульфатом цинка, твердофазную экстракцию экдистероидов путем фильтрования осветленного водного экстракта через сорбент “Диасорб С 16 Т”, селективное элюирование экдистероидов с сорбента растворителем, концентрированно полученных фракций с экдистероидами, перекристаллизацию целевых веществ и вакуумную сушку экдистероидов (3. Пунегов В.В, Мишуров В.П., Никитина Е.Н., Коснырева И.В. Особенности технологии получения экдистероидов растения Serratula coronata L методом твердофазной экстракции. Тез. докл. Второго междунар. симп. Новые нетрадиционные растения и перспективы их практического использования”. - Пущино, 1997, т.2, с.79-81).

Недостатком данного способа является низкий выход по целевым компонентам в расчете на воздушно-сухое сырье: 1,1% по 20-гидроксиэкдизону и 0,2% по инокостерону.

Задача, решаемая заявляемым техническим решением, заключается в повышении выхода целевых продуктов за счет более полного выделения экдистероидов из растительного сырья.

Поставленная задача решается благодаря тому, что в заявляемом способе получения экдистероидов из растительного сырья, включающем измельчение растительного сырья и водную экстракцию целевых продуктов, растительное сырье предварительно подвергают размолу и механохимической обработке в шаровых мельницах в присутствие абразивного материала и водорастворимого адсорбента при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Водорастворимый адсорбент 5-30

Абразивный материал 5-25

Растительное сырье Остальное

Предпочтительно, в качестве шаровых мельниц используют мельницы планетарного, вибрационного и виброцентробежного типов, обеспечивающих ускорение воздействующих шаров от 60 до 400 м/с².

Предпочтительно, в качестве абразивного материала используют кварцевый песок.

Предпочтительно, в качестве водорастворимого адсорбента используют сахарозу.

Существенными отличительными признаками заявляемого изобретения, находящимися в причинно-следственной связи с достигаемым техническим результатом, являются:

- растительное сырье подвергают механохимической обработке путем размола его в шаровых мельницах;

- размол и механохимическую обработку проводят в присутствии абразивного материала и водорастворимого адсорбента;

- механохимическую активацию проводят при следующем соотношении компонентов, маc.%:

Растительное сырье 50-70

Водорастворимый адсорбент 5-30

Абразивный материал Остальное

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Воздушно-сухое растительное сырье, содержащее фитоэкдистероиды, смешивают с водорастворимым адсорбентом, например сахарозой или другим твердым углеводом (D-глюкозой, D-фруктозой или D-лактозой), что не исключает использование любого другого твердого водорастворимого адсорбента, включающего в свой состав полифункциональные соединения, содержащие 4 и более гидроксильных групп, и абразивным материалом, например кварцевым песком, что не исключает использование других абразивов, не изменяющих химическую природу целевых продуктов, подвергают механохимической активации путем размола в шаровых мельницах планетарного, вибрационного и виброцентробежного типов, обеспечивающих ускорение воздействующих тел (шаров) от 60 до 400 м/с². В результате механохимической обработки происходит тонкое измельчение сырья до размеров частиц 4-3,5 мкм. Введение абразивного материала резко увеличивает эффективность измельчения растительного сырья и приводит к разрушению клеточных стенок. Клеточное содержимое обрабатываемых таким образом растений в процессе механохимической активации контактирует с водорастворимым адсорбентом. При этом экдистероиды растений концентрируются на поверхности водорастворимого адсорбента вследствие образования молекулярных комплексов.

Полученную смесь подвергают двукратной экстракции водой при температуре 50-70°С. Длительность экстракции составляет 1,0-1,5 часа.

Выделение экдистероидов из водного экстракта можно проводить любым известным способом. При этом в каждом случае наблюдается увеличение выхода экдистероидов.

Механохимическая обработка смеси вышеназванного состава обеспечивает следующее:

- разрушение клеточных стенок в частицах растительного сырья позволяет наиболее полно выделить экдистероиды из растения, выделяемая смесь содержит 20-гидроксиэкдизон, экдизон, инокостерон и макистерон А, структурные формулы которых приведены на чертеже;

- образование композитных частиц, состоящих из растительного материала, в который внедрены частицы абразивного материала, например кварцевого песка, приводит к увеличению удельного веса, что облегчает последующее отстаивание, фильтрование или центрифугирование водных экстрактов;

- вследствие образования хорошо растворимых молекулярных комплексов происходит связывание биологически активных веществ, экдистероидов с водорастворимым адсорбентом, что позволяет легко и достаточно полно проводить водную экстракцию экдистероидов.

Заявляемый способ поясняется следующими примерами.

Пример 1.

Сухую надземную часть растения Serratula coronata смешивают с кварцевым песком и сахарозой при следующем соотношении, маc.%: 60:20:20 соответственно, обрабатывают в проточном механическом активаторе типа ВЦМ при ускорении шаров 120 м/с² и времени пребывания смеси в зоне обработки 2 мин до размера частиц не более 25-35 мкм. Полученный полупродукт экстрагируют дважды горячей водой при температуре 50-70°С в течение 1,0-1,5 часов, гидромодуль 6,0-7,0. После отстаивания осадок отжимают через фильтроткань или центрифугируют. Объединенные водные части охлаждают до температуры 3-6°С, после чего постепенно из раствора выкристаллизовывается 20-гидроксиэкдизон, который собирают центрифугированием или фильтрованием.

Фильтрат экстрагируют трижды этилацетатом при соотношении вода - органическая фаза 3:1. После удаления из экстракта 3/5 растворителя получают концентрат, который охлаждают снова до 3-6°С и отфильтровывают остатки выпадающего 20-гидроксиэкдизона. Из полученного экстракта экдистероиды выделяют методом сорбционной фильтрации по известному способу. Фракции, содержащие по данным ВЭЖХ (высоко эффективной жидкостной хроматографии) целевые компоненты, собирают. Анализ методом ВЭЖХ на содержание экдистероидов проводят согласно [В.В.Володин и др. Инокостерон и макистерон А из Serratula coronata // Физиология растений, Том 45, №3 (1998), 378-381.]. Из фракций, содержащих целевые компоненты, растворитель удаляют под вакуумом. В случае необходимости очистку экдистероидов проводят перекристаллизацией по известному способу.

Выход продуктов в пересчете на сухое растительное сырье составляет, мас.%:

20-Гидроксиэкдизон 1,8-1,9

Инокостерон 0,25-0,3

Экдизон 0,28-0,32

Макистерон А 0,018-0,02

Пример 2.

Осуществляют в условиях примера 1. В качестве экстрагента водного фильтрата, полученного после осаждения 20-гидроксиэкдизона, используют смесь н-бутанол-этанол в соотношении 3:1. Выход продуктов, маc.%:

20-Гидроксиэкдизон 1,7-1,85

Инокостерон 0,24-0,29

Экдизон 0,28-0,31

Макистерон А 0,017-0,019

Пример 3.

Осуществляется в условиях примера 1. Полученный водный экстракт предварительно обезжиривают петролейным эфиром или бензином (Б-1 или БР-2). После этого проводят непрерывную противоточную экстракцию этилацетатом смеси экдистероидов из водного экстракта. Затем удаляют 4/5 органического растворителя, выпавшие при охлаждении из концентрата кристаллы 20-гидроксиэкдизона собирают центрифугированием или фильтрованием.

Из полученного органического экстракта выделяют сумму экдистероидов в условиях примера 1. Выход продуктов в пересчете на сухое растительное сырье составляет, маc.%:

20-Гидроксиэкдизон 2,0-2,1

Инокостерон 0,29-0,32

Экдизон 0,31-0,34

Макистерон А 0,02-0,022

Полученные продукты представляют собой: 20-гидроксиэкдизон - бесцветные или розовые кристаллы с т.пл. 241,5-242,0°С, макистерон А - аморфный бесцветный или светло-розовый порошок, т.пл. 262-266°С, [α]20D

Заявленные соотношения концентраций компонентов механохимически обрабатываемой смеси определяются следующими эффектами.

Введение кварцевого песка в концентрации менее 5% приводит к резкому увеличению времени механохимической обработки до технологически неприемлемых величин. Использование кварцевого песка в концентрации более 25 маc.% нецелесообразно вследствие того, что большие концентрации не влияют на эффективность измельчения и механохимической активации, а непроизводительные затраты на измельчение песка растут.

Введение сахарозы в количестве менее 5 маc.% не обеспечивает полноты извлечения продукта из растительного сырья. Применение для обработки смесей, содержащих более 30 маc.% сахарозы, становится неэффективным с экономической точки зрения - затраты на увеличение выхода продукта не окупаются из-за стоимости дополнительно затрачиваемой сахарозы.

Сопоставительный анализ с ближайшим аналогом показывает, что заявляемое техническое решение благодаря механохимической обработке смеси воздушно-сухого растительного сырья с водорастворимым адсорбентом и абразивным материалом при вышеназванном соотношении компонентов позволяет произвести разрушение клеточных стенок растения, и содержимое клеток приходит в контакт с водорастворимым адсорбентом.

Дополнительным преимуществом присутствия в обрабатываемой смеси абразивного материала является включение мелких частиц его в частицы растительного сырья. Это облегчает последующее отстаивание, фильтрование или центрифугирование водных экстрактов. Взаимодействие экдистероидов с водорастворимым адсорбентом, например с сахарозой, приводит к образованию хорошо растворимых молекулярных комплексов.

Таким образом, за счет применения механохимической активации достигается более полное извлечение из сырья целевых компонентов при меньших расходах растворителя.

По сравнению с прототипом заявляемое техническое решение позволяет повысить выход экдистероидов: по 20-гидроксиэкдизону с 1,08 маc.% по прототипу до 2,1 маc.%. Кроме того, заявленное решение позволяет выделить не только такие экдистероиды как экдизон, инокостерон, но также и макистерон А.

Применение заявленного технического решения позволяет существенно повысить концентрацию 20-гидроксиэкдизона в водных экстрактах, в результате чего удается провести его кристаллизацию непосредственно из водной фазы. Расход этилацетата на стадии экстракции экдистероидов из водного экстракта уменьшается в 5-10 раз.

Изобретение относится к области получения биологически активных веществ из растительного сырья, а именно к способу одновременного получения 20-гидроксиэкдизона, инокостерона, экдизона, макистерона А, имеющих следующие структурные формулы:

20-гидроксиэкдизон - R1=ОН, R2=Н, R3=ОН, R4=Н. Инокостерон - R1=ОН, R2=Н, R3=Н, R4=ОН. Экдизон - R1=Н, R2=Н, R3=ОН, R4=Н. Макистерон А - R1=ОН, R2=СН3, R3=ОН, R4=Н. Способ позволяет повысить выход целевых продуктов и полноту выделения экдистероидов из растительного сырья за счет того, что в способе, включающем измельчение растительного сырья и водную экстракцию целевых продуктов, растительное сырье подвергают размолу и механохимической обработке в шаровых мельницах в присутствии абразивного материала и водорастворимого адсорбента при следующем соотношении компонентов, мас.%: водорастворимый адсорбент 5-30; абразивный материал 5-25; растительное сырье - остальное. В качестве шаровых мельниц используют мельницы планетарного, вибрационного и виброцентробежного типов, обеспечивающих ускорение воздействующих шаров от 60 до 400 м/с². Предпочтительно, в качестве абразивного материала используют кварцевый песок, а в качестве водорастворимого адсорбента используют сахарозу. 1 с. и 4 з.п. ф-лы, 1 ил.

1. Способ получения экдистероидов из растительного сырья, включающий измельчение растительного сырья, водную экстракцию целевых компонентов при температуре не выше 100°С и реэкстракцию сопутствующих гидрофобных веществ углеводородным растворителем, отличающийся тем, что растительное сырье предварительно подвергают размолу и механохимической обработке в высоконапряженных мельницах в присутствии абразивного материала и водорастворимого адсорбента при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Водорастворимый адсорбент 5-30

Абразивный материал 5-25

Растительное сырье Остальное